Introduction
对于感染性疾病的治疗方案已被复杂化在多药耐药性细菌是免疫广泛的抗生素药物1的快速增加。从耐药细菌介导的感染的高发病率和死亡率，有必要升级药物开发过程和/或探索更好抗菌替代改善的治疗选择。近来，抗毒性的方法是获得给出其在经由非杀菌方法防止致病潜力的兴趣，因此减轻耐药机制2的风险。
群体感应是细菌毒力和这种信号中断现象的一个“总开关”是对发病3一个有前途的抗毒性的方法。毒力的发作需要仲裁分子在细胞外环境中的积累达到临界细菌种群密度之后。由于现状朗姆酒分子扩散回进入胞内基质中，与它们的同源受体结合导致的毒力因子的活化，以及与抗生素抗性和生物膜形成4相关的基因。在一般情况下，群体感应中断涉及抑制仲裁分子和受体相互作用，而不会影响主代谢途径。因此，它不具有对细胞生长的任何直接含意。由于健康不受损害，是最小的选择压力细菌进化并获得对这种治疗5阻力。此外，群体感应中断可以与固有的细菌保护机制干扰，如在生物膜形成，它提供了保护从抗菌剂和宿主免疫反应的情况下。
据估计，在复杂的生物膜状矩阵存在99％地球上的微生物，赋予关键存活优势居住在第微生物ESE结构6。更重要的是，形成这些无柄域是最持久和慢性医院获得性感染7的原因。 鲍曼不动杆菌是一个与全球医院获得性感染相关联，其毒力在很大程度上归因于群体感应的主要的人类病原体之一介导的生物膜形成8。仲裁淬酶已被成功地用于通过靶向一组化合物已知为 N -酰基高丝氨酸内酯（信号分子）是由革兰氏阴性细菌产生的9扰乱仲裁介导的信号转导。一些研究也扩大于使用这些酶通过毒力因子的表达和细胞数在生物膜10,11减少到方框细菌发病机理。不幸的是，仍缺乏有效利用仲裁 - 淬火酶对生物膜形成由细菌病原体扪示范的。该重新已经尝试使用定额抑制剂（AHL类似物）代替法定淬火酶，以破坏A.鲍曼不动杆菌生物膜形成12。虽然使用小分子抑制剂的这种方法是一种有效的方法，维持在平利用其生物利用度可能是一个挑战。与此相反，使用催化仲裁 - 淬火酶可以规避生物利用度问题，因为酶是朝固定上用于治疗效果的生物医学装置的表面更适合。
在这里，我们描述了从地芽孢kaustophilus（GKL）13对细菌生物膜的形成工程定额淬火lactonases的影响进行评估，采用结晶紫染色和激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）。这项研究是生物膜分裂的在一个临床相关的A中的第一次成功的示范鲍曼不动杆菌菌株S1采用定额淬火酶。的方法中所述在这项研究中的用于评估对致病性革兰氏阴性细菌后续治疗的努力发展其他仲裁淬火酶的效力是有用的。
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Protocol
生物膜的形成A. 1.结晶紫定量鲍曼不动杆菌 S1
- 成长5 ml培养A的杆菌中的S1 LB培养基（LB）（胰蛋白胨10克/升，酵母提取物5克/升），在30℃下在振荡培养箱（220转）16小时。
- 调整A.文化杆菌 S1至所希望的OD 600为0.8。使用96孔板，接种细菌培养物（1：100稀释）到新鲜LB含有10微升纯化GKL酶（40毫克/毫升）的;新的文化的最终体积为100微升。
- 准备控制文化为好;这将不包含任何酶。重复类似的状况以产生重复的期望数量。
- 覆盖板用盖，并放入一个密封的10升塑料容器中。前轻轻取出介质孵育板在30℃下3小时。
- 添加另外100微升新鲜LB培养基到井和孵育板21小时，在30℃。 孵化的第二阶段后，轻轻取出所有的媒体。洗净的浮游细菌细胞用200微升无菌水。确保有清洗期间只有最小干扰细胞中。
- 加入100微升的1％结晶紫溶液至每个孔，并孵育15分钟，在RT。通过洗涤井用200μl无菌水去除结晶紫溶液。重复洗两次。
- 加入100微升33％乙酸至每个孔，并孵育15分钟，轻轻摇动;这会溶解染料。
- 定量生物膜的通过测量结晶紫的吸光度在600nm处形成的量。结晶紫的量是成比例的生物膜的形成的量。
A. 2.激光共聚焦显微镜鲍曼不动杆菌 S1生物膜
- 成长5 ml培养A的杆菌中的S1的LB在30℃在振荡培养箱（220rpm下）16小时。
- 广告A的只是培养杆菌 S1至所希望的OD 600为0.8。使用35毫米的玻璃底μ-盘子，接种细菌培养物（1：100稀释）到新鲜LB含有30微升纯化GKL酶（40毫克/毫升）的;新的文化的最终体积为1毫升
- 覆盖μ-盘用盖子，并将其放置在一个密封的10升塑料容器中。前轻轻取出介质孵育μ-盘在30℃下3小时。添加30微升纯化GKL酶和新鲜培养基，将它带到1毫升的总体积。孵育另外21小时，在30℃。
- 重复步骤2.3孵育μ-菜另外24小时在30℃。然后，轻轻地取出介质。
- 加入500微升5微克/毫升阿莱克斯的Fluo 488缀合的麦胚凝集素（WGA）溶于Hank平衡盐溶液（HBSS）到μ-盘和孵育在37℃，30分钟;这会污染形成的生物膜。除去染色液和洗涤吨他μ-菜用2毫升的HBSS。重复该洗涤步骤一次。
- 加入500微升3.7％的甲醛溶解在HBSS中，37℃，30分钟;这将解决生物膜到μ-菜。用2毫升的HBSS洗μ-菜一次，然后彻底删除解决方案。 μ-盘固定生物膜可以在4℃之前CLSM成像储存在黑暗中。
- 对于激光共聚焦显微镜成像和分析，用63倍的放大倍率，产生97堆栈每幅图像，每堆0.21微米的间隔。
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Representative Results
在结晶紫定量实验中，两名仲裁淬火酶用于演示的可行性破坏生物膜的形成：野生型GKL和改进的GKL双突变体（E101G / R230C）。两种酶已显示表明内酯酶活性对3-羟基癸酰基-L-高丝氨酸内酯（3-OH-C 10 -HSL），使用由 A.主要仲裁分子鲍曼不动杆菌 S1 14。为生物膜分裂的有效评估，它们各自的无催化活性的酶（先前表明不螯合AHL配体）也包括在内作为立即对照（GKL D266N突变体和GKL E101G / R230C / D266N突变体）。除了 使用野生型A.杆菌 S1中，突变ΔABAI株（AHL合成酶缺陷）的生物膜形成能力也被测试。既仲裁淬酶，野生型GKL和GKL E101G / R230C突变体能够显著减少在预生物膜形成处理A.杆菌 S1培养物（N = 10; p值0.0001≤）（ 图1）。尽管如此，生物膜分裂为两种酶的程度不成正比它们对3-OH-C 10 -HSL功效。在GKL E101G / R230C突变的周转率（K 猫 ）比野生型GKL对快3-OH-C 10 -HSL 14六倍。然而，在酶之间生物膜分裂的程度的差异是仅有的两个倍。
图1. A.鲍曼不动杆菌 生物膜分裂法。生物膜的形成是由结晶紫染色法。红柱代表生物膜的野生型A.生成量杆菌 ，ΔABAI突变体，不加入仲裁-淬火lactonases的。蓝柱代表AMOUNT生物膜由野生型A.形成杆菌中的四个不同GKL酶的存在：闲置GKL D266N突变体，野生型GKL，不活动GKL E101G / R230C / D266N突变体和GKL E101G / R230C突变体。 ****，P-的≤0.0001值。转载自抗菌药物和化疗 58的许可，1802-1805（2014）。 请点击此处查看该图的放大版本。
A.共聚焦成像杆菌 S1生物膜形成是用来提供对这些固着结构域的结构形态仲裁淬火效果的定性和定量测量。改进GKL E101G / R230C突变体和其催化活性的酶被用于比较。差分图像对比（DIC）图像显示，与改进的GKL E101G / R230C突变处理导致生物膜尺寸的减小（FIGURE2）。荧光图像的分析还显示，当与改进GKL E101G / R230C突变体（表1）处理有减少表面积，生物量和生物膜的平均厚度。
A的 图2代表共聚焦激光扫描显微镜图像 鲍曼不动杆菌 生物膜。A. 鲍曼不动杆菌生物膜处理和未激活的GKL E101G / R230C / D266N突变体（A）和 GKL E101G / R230C突变体（B）和染色用Alexa 氟488缀合的WGA。生物膜（左）和生物膜（右）的荧光图像的DIC图像示为代表的xy（中心），YZ（右），和XZ（底部）的部分。从抗菌药物和化疗 <授权转载STRONG> 58，1802年至1805年（2014）。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 值±SD 一个 | |||
| 特性 | 无治疗 | 治疗无效突变 | 治疗E101G / R230C突变 |
| 生物量（微米3 /微米2） | 2.57±1.65 | 3.39±1.33 | ** 1.37±0.20 |
| 平均厚度（μm） | 3.68±2.51 | 3.41±1.31 | ** 1.21±0.21 |
| 表面积（微米） | 235,920.59±79,456.46 | 209,872.6±115,094.7 | 115,354.9 *±7,630.3 |
| A N = 10图像堆栈。 **，P≤0.001; *，P≤0.05，与非活动E101G / R230C / D266N突变处理相比。 | |||
表1. A.鲍曼不动杆菌 生物膜结构定量。
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Discussion
在这两组实验中，A杆菌 S1中培养在LB培养基无氯化钠作为高盐浓度可减少生物膜由细菌15形成的量。这种伪影的存在可能会低估生物膜的形成的量，以及仲裁 - 淬火酶在不同的处理条件的影响。使用催化失活酶是重要的，作为阴性对照，以消除酶封存的可能影响。 图1表明，即使不活动酶螯合仲裁分子，生物膜的形成不被中断。
鲍曼不动杆菌 S1形成在96孔板的孔的空气和液体的界面之间的微妙环状的生物膜结构。因此，关键的是要避免在介质取出和清洗步骤过度搅拌，以防止意外除去细菌生物膜的。每次温育后，除去LB培养基消除浮游细胞。此外，96孔板置于10升的塑料容器，以尽量减少在气流扰动，并创造有利于生物膜形成一个微厌氧环境。在一个96孔板生物膜定量也依赖于结晶紫加入每个孔中的量。在过量的结晶紫加入成孔的情况下，洗涤步骤的数目可以增加。该结晶紫染色实验提供了法定淬效率的生物膜分裂的相对比较。虽然结晶紫染色是定量测定生物膜的形成，它是唯一的半定量在仲裁 - 淬火酶的催化效率方面。为了获得准确的统计比较，足够的样本大小是针对不同的治疗组重要。离群值也应删除，以防止结果不实陈述。
共聚焦成像和细菌生物膜的分析是一个USEFUL工具，以评估仲裁淬火酶的定性作用。但是，选择的生物膜进行分析的过程可以是用于一个偏压电位通道，如果用户意识到仲裁淬酶施用（活性或失活）的类型。为了避免偏差的可能性，该实验可被设计为从用户排除酶信息，或使用一个随机的方式进行选择。一个公正的选择策略也使生物膜形态的激光共聚焦显微镜更好的定量比较。尽管如此，这是描述的评价方法，对细菌生物膜仲裁 - 淬火的酶的结果的第一项研究。结晶紫染色已经证明在生物膜分裂仲裁-淬火酶的效用和显示，酶“ 改性operandorum不限于减少的细胞数和毒力因子表达的影响。同时，激光共聚焦显微镜分析确定形态的变化也可以提供深入了解可能molecul这些酶的芳目标。虽然目前的实验的目的是要调查对细菌生物膜的酶预处理的效果，该协议可以被修改由细菌生长后加入酶，以评估对预制生物膜的酶的作用，或者通过使用血清的检查其在生理条件下的能力样条件的文化。用于研究GKL酶协议可以扩展到其他仲裁 - 淬火酶和病原体调查其在生物膜分裂关系。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
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