Introduction
Les options de traitement pour les maladies infectieuses ont été compliquées par l'augmentation rapide des bactéries multi-résistantes qui sont immunisées à une large gamme de médicaments antibiotiques 1. Avec une morbidité élevée et taux de mortalité par bactéries médiation infections résistantes, il est nécessaire d'intensifier les processus de développement de médicaments et / ou explorer de meilleures solutions anti-bactériennes pour améliorer les options thérapeutiques. Dernièrement, l'approche anti-virulence suscite de l'intérêt étant donné son potentiel dans la prévention de la virulence par des méthodes non-bactéricides, donc d'atténuer les risques de mécanismes de résistance 2.
Quorum-sensing est un «interrupteur principal» dans la virulence bactérienne et la perturbation de ce phénomène de signalisation est une méthode anti-virulence prometteur contre la pathogenèse 3. Le début de la virulence nécessite l'accumulation de molécules de quorum dans le milieu extracellulaire après une densité de population bactérienne critique est atteinte. Comme quomolécules diffusent de rhum de nouveau dans la matrice intracellulaire, la liaison avec leurs récepteurs apparentés conduit à l'activation de facteurs de virulence ainsi que des gènes associés à la résistance aux antibiotiques et la formation de biofilm 4. En général, la perturbation quorum-sensing implique l'inhibition de la molécule quorum et interaction avec le récepteur sans affecter les principales voies métaboliques. Par conséquent, il n'a pas de conséquence directe sur la croissance cellulaire. Depuis remise en forme ne soit pas compromise, il ya une pression de sélection minimale pour les bactéries d'évoluer et d'acquérir une résistance contre ces traitements 5. En outre, la perturbation quorum-sensing peut interférer avec les mécanismes de protection bactériennes intrinsèques, comme dans le cas de la formation de biofilm, qui offre une protection contre les agents anti-bactériens et des ordinateurs des réponses immunitaires.
On estime que 99% des microbes sur Terre existe dans les matrices de biofilm comme complexes, conférant des avantages cruciaux de survie pour les micro-organismes vivant dans les estructures ESE 6. Plus important encore, la formation de ces domaines sessiles est la cause de la plupart des infections persistantes et chroniques nosocomiales 7. Acinetobacter baumannii est l'un des principaux agents pathogènes humains qui est associée à des infections mondiales nosocomiales et sa virulence est largement attribuable à quorum-sensing médiée par la formation de biofilm 8. Trempe de quorum-enzymes ont été utilisés avec succès dans quorum perturber la transduction du signal à médiation par le ciblage d'un groupe de composés connus comme les homosérine lactones de N (AHL) qui sont produites par des bactéries Gram-négatives 9. Plusieurs études ont également étendu à l'utilisation de ces enzymes pour bloquer la pathogenèse bactérienne à travers la réduction du nombre d'expression de facteur de virulence et cellulaires dans les biofilms 10,11. Malheureusement, il existe toujours un manque de démonstration palpable de l'utilisation effective des enzymes de quorum extinction contre la formation de biofilm par des pathogènes bactériens. lere ont eu des tentatives d'utiliser des inhibiteurs de quorum (analogues AHL), au lieu des enzymes quorum-trempe, de perturber A. baumannii 12 la formation de biofilm. Bien que cette méthode d'utilisation des inhibiteurs de petites molécules est une approche valable, le maintien de sa biodisponibilité dans les utilisations traductionnelles peut être un défi. Au contraire, l'utilisation d'enzymes de quorum-trempe catalytiques pourrait contourner la question de la biodisponibilité des enzymes se prêtent davantage à l'immobilisation sur des surfaces de dispositifs biomédicaux pour les effets thérapeutiques.
Ici, nous décrivons une évaluation des effets de l'ingénierie lactonases de quorum-trempe de Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 sur la formation d'un biofilm bactérien, en utilisant une coloration au cristal violet et de microscopie confocale à balayage laser (CLSM). Cette étude est la première démonstration réussie de perturbation du biofilm dans un A. cliniquement pertinente baumannii souche S1 utilisant des enzymes quorum-trempe. Les procédés décritsdans cette étude sont utiles pour évaluer l'efficacité d'autres enzymes de quorum-trempe dans les efforts de développement thérapeutique ultérieurs contre les bactéries à Gram négatif pathogènes.
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Protocol
1. Cristal Violet quantification de formation d'un biofilm dans A. baumannii S1
- Développer une culture de 5 ml de A. baumannii S1 dans un bouillon Lysogénie (LB) (tryptone 10 g / L, extrait de levure 5 g / L) à 30 ° C dans un incubateur sous agitation (220 rpm) pendant 16 heures.
- Ajustez la culture de A. baumannii S1 à une DO 600 de 0,8 souhaitée. Utilisation d'une plaque de 96 puits, inoculer la culture bactérienne (dilution 1: 100) dans LB frais contenant 10 ul d'enzyme purifiée GKL (40 mg / ml); volume final de la nouvelle culture est de 100 pi.
- Préparer une culture de contrôle ainsi; ce ne sera pas contenir toute enzyme. Répétez les mêmes conditions pour obtenir le nombre désiré de répétitions.
- Recouvrir la plaque avec un couvercle et le placer dans un récipient de 10 litres en plastique scellé. Incuber la plaque à 30 ° C pendant 3 heures avant de retirer délicatement les médias.
- Ajouter un autre 100 pi de milieu LB frais pour le bien et incuber la plaque pendant 21 heures à 30 ° C. Après la deuxième période d'incubation, retirer délicatement tous les médias. Laver la cellule des bactéries planctoniques avec 200 pi d'eau stérile. Assurez-vous qu'il n'y a qu'une perturbation minimale aux cellules pendant le lavage.
- Ajouter 100 ul de solution de cristal violet à 1% dans chaque puits et incuber pendant 15 min à température ambiante. Retirer la solution de cristal violet par lavage du puits avec 200 ul d'eau stérile. Répétez le lavage pour deux fois plus.
- Ajouter 100 pi d'acide acétique à 33% à chaque puits et incuber pendant 15 min en agitant doucement; cela va dissoudre le colorant.
- Quantifier la quantité de biofilm formé par mesure de l'absorbance de cristal violet à 600 nm. La quantité de violet cristallisé est proportionnelle à la quantité de biofilm formé.
2. confocale à balayage laser de A. baumannii S1 biofilm
- Développer une culture de 5 ml de A. baumannii S1 dans du LB à 30 ° C dans un incubateur à agitation (220 rpm) pendant 16 heures.
- Un dseulement la culture de A. baumannii S1 à une DO 600 de 0,8 souhaitée. L'utilisation d'un 35 mm à fond de verre μ-Dish, inoculer la culture bactérienne (dilution 1: 100) dans LB frais contenant 30 ul d'enzyme purifiée GKL (40 mg / ml); volume final de la nouvelle culture est de 1 ml.
- Couvrir le μ-Dish avec un couvercle et le placer dans un récipient de 10 litres en plastique scellé. Incuber le μ-Dish à 30 ° C pendant 3 heures avant de retirer délicatement les médias. Ajouter 30 ul d'enzyme GKL purifiée et du milieu frais, le ramenant à un volume total de 1 ml. Incuber pendant un autre 21 heures à 30 ° C.
- Répétez l'étape 2.3 et incuber le μ-Dish pour un autre 24 heures à 30 ° C. Puis, retirez délicatement les médias.
- Ajouter 500 pl de 5 pg / ml Alex Fluo 488 conjugué à l'agglutinine de germe de blé (WGA) dissous dans de la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) pour la μ-vaisselle et incuber à 37 ° C pendant 30 min; cela va tacher le biofilm formé. Retirer la solution de coloration et laver til u-vaisselle avec 2 ml de HBSS. Répétez l'étape de lavage une fois de plus.
- Ajouter 500 ul de 3,7% de formaldéhyde dissoute dans du HBSS et incuber à 37 ° C pendant 30 min; cela va résoudre le biofilm sur le μ-Dish. Laver le μ-Dish fois avec 2 ml de HBSS puis retirez complètement la solution. Le μ-Dish fixe avec biofilm peut être stocké dans l'obscurité à 4 ° C avant l'imagerie de CLSM.
- Pour l'imagerie et l'analyse CLSM, utiliser 63 fois grossissement pour générer 97 piles par image avec un intervalle de 0,21 um par pile.
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Representative Results
Dans l'expérience de quantification de cristal violet, deux enzymes quorum-trempe ont été utilisés pour démontrer la faisabilité à perturber la formation de biofilm: type sauvage GKL et une amélioration de double mutant GKL (E101G / de R230C). Les deux enzymes se sont révélées manifester une activité lactonase contre-hydroxy-3-décanoyle L-homosérine lactone (3-OH-C -HSL 10), la principale molécule quorum utilisée par A. baumannii S1 14. Pour évaluation valable de rupture du biofilm, leurs enzymes catalytiquement inactifs respectifs (précédemment indiquées pour ne pas séquestrer ligands AHL) ont également été inclus comme témoins immédiats (GKL D266N mutant et GKL E101G / R230C / D266N mutant). Outre l'utilisation de type sauvage A. baumannii S1, le biofilm formant capacité d'une souche de mutant Δ Abai (AHL synthase déficient) a également été testé. Les deux enzymes quorum-trempe, de type sauvage GKL et GKL E101G / R230C mutantes ont pu réduire de façon significative la formation de biofilm dans le préA. traité cultures baumannii S1 (n = 10; p-value ≤ 0,0001) (figure 1). Néanmoins, la mesure de la perturbation du biofilm pour les deux enzymes est pas proportionnelle à leur efficacité contre 3-OH-C 10 -HSL. Le taux de rotation (k cat) du / R230C mutant GKL E101G est six fois plus rapide que le type sauvage GKL contre 3-OH-C 10 -HSL 14. Cependant, la différence dans l'ampleur de la perturbation d'un biofilm entre les enzymes est seulement deux fois.
Figure 1. A. formation baumannii test de perturbation du biofilm. biofilm a été mesurée par coloration au cristal violet. Colonnes rouges représentent la quantité de biofilm formé par type sauvage A. baumannii et Δ Abai mutant, sans l'ajout de lactonases quorum-trempe. Colonnes bleues représentent l'amount du biofilm formé par type sauvage A. baumannii en présence de quatre enzymes GKL différentes: inactif GKL mutantes de D266N, de type sauvage GKL, inactive GKL E101G / R230C / D266N mutantes et GKL E101G / R230C mutantes. ****, P- valeur ≤ 0,0001. Reproduit avec la permission de Antimicrobial Agents and Chemotherapy 58, de 1802 à 1805 (2014). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
L'imagerie confocale de A. la formation de biofilm baumannii S1 a été utilisé pour fournir une mesure qualitative et quantitative des effets de quorum extinction sur la morphologie structurelle de ces domaines sessiles. L'amélioration GKL E101G mutant / de R230C et son enzyme catalytiquement inactif ont été utilisés pour la comparaison. Le contraste de l'image différentielle (DIC) l'image montré que le traitement avec l'amélioration GKL E101G / R230C mutant a entraîné une diminution de la taille du biofilm (Figure 2). L'analyse des images de fluorescence a révélé qu'il y avait une réduction de la surface spécifique, la biomasse et épaisseur moyenne de film biologique lorsqu'ils sont traités avec le GKL E101G / mutant amélioré R230C (tableau 1).
Figure 2. Représentant images confocal à balayage laser de microscopie de A. biofilms baumannii. A. baumannii biofilms ont été traitées avec inactif GKL E101G / R230C / mutant D266N (A) et GKL E101G / mutant R230C (B) et colorées avec de l'Alexa Fluor 488-WGA conjugué. DIC images des biofilms (à gauche) et des images de fluorescence des biofilms (à droite) sont indiqués pour xy représentant (au centre), yz (à droite), et XZ (en bas) sections. Reproduit avec la permission de Antimicrobial Agents and Chemotherapy <strong> 58, 1802-1805 (2014). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Valeur ± SD une | |||
| Caractéristiques | Aucun traitement | Le traitement avec le mutant inactif | Le traitement par E101G / R230C mutant |
| Biomasse (3 um / um 2) | 2,57 ± 1,65 | 3,39 ± 1,33 | ** 1,37 ± 0,20 |
| Épaisseur moyen (pm) | 3,68 ± 2,51 | 3,41 ± 1,31 | 1,21 ± 0,21 ** |
| Surface (pm) | 235,920.59 ± 79,456.46 | 209,872.6 115,094.7 ± | 115,354.9 7,630.3 * ± |
| un n = 10 piles d'images. **, P ≤ 0,001; *, P ≤ 0,05, comparativement au traitement avec inactive E101G / R230C / D266N mutant. | |||
Tableau 1. A. baumannii biofilm de quantification de structure.
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Discussion
Dans les deux séries d'expériences, A. baumannii S1 a été cultivée dans du milieu LB sans NaCl comme une concentration élevée de sel peut réduire la quantité de biofilm formé par les bactéries 15. La présence d'un tel artefact pourrait sous-estimer la quantité de biofilm formé, ainsi que les effets des enzymes de quorum-trempe à travers différentes conditions de traitement. L'utilisation d'une enzyme catalytiquement inactif est important en tant que témoin négatif pour éliminer les effets possibles de l'enzyme de séquestration. La figure 1 montre que même si les enzymes inactives séquestrent molécules quorum, la formation de biofilm ne soit pas perturbé.
A. baumannii S1 forme une structure du biofilm en forme d'anneau délicat entre l'air et l'interface liquide dans le puits de la plaque de 96 puits. Par conséquent, il est essentiel d'éviter une agitation excessive lors de l'enlèvement des médias et de lavage des mesures pour empêcher le retrait accidentel des biofilms bactériens. LB milieu a été éliminé après chaque incubationéliminer les cellules planctoniques. En outre, la plaque à 96 puits a été placé dans un récipient en plastique de 10 L pour réduire au minimum les perturbations dans le flux d'air et à créer un environnement de micro-anaérobie qui favorise la formation de biofilm. Biofilm quantification dans une plaque à 96 puits dépend également de la quantité de violet cristallisé ajouté à chaque puits. Dans le cas où le cristal violet en excès est ajouté dans un puits, le nombre d'étapes de lavage peut être augmentée. L'expérience de coloration au cristal violet permet de comparer l'efficacité relative de quorum-trempe dans perturbation du biofilm. Bien que la coloration au cristal violet est quantitatif de mesure de la formation de biofilm, il est seulement semi-quantitative en termes de l'efficacité catalytique des enzymes quorum extinction. Pour comparaison statistique précise, les tailles d'échantillon suffisantes sont importants pour les différents groupes de traitement. Les valeurs aberrantes devraient aussi être supprimés pour éviter les fausses déclarations de résultats.
L'imagerie et l'analyse d'un biofilm bactérien confocale est une useful outil pour évaluer les effets qualitatifs des enzymes de quorum-trempe. Cependant, le processus de sélection pour l'analyse biofilm peut être un canal potentiel de biais si l'utilisateur est conscient du type de quorum-trempe enzyme administré (actif ou inactif). Pour éviter la possibilité de partialité, l'expérience peut être conçu pour exclure les informations enzyme de l'utilisateur ou d'utiliser une approche aléatoire pour la sélection. Une stratégie de sélection impartiale permet également une meilleure comparaison quantitative des morphologies de biofilm par CLSM. Néanmoins, cette étude est la première qui décrit un procédé pour évaluer le résultat d'enzymes de quorum extinction sur les biofilms bactériens. La coloration violet de cristal a démontré l'utilité des enzymes de quorum-trempe dans une désorganisation du biofilm et a révélé que la modification de operandorum enzymes ne sont pas limités à la réduction du nombre de cellules et l'expression de facteurs de virulence. Pendant ce temps, les changements morphologiques déterminées par analyse de CLSM peuvent également fournir des indications sur une éventuelle molecular cibles de ces enzymes. Bien que l'expérience actuelle a été conçue pour étudier les effets des enzymes prétraitement sur les biofilms bactériens, le protocole peut être modifié pour évaluer l'effet de l'enzyme sur biofilm préformée en ajoutant l'enzyme après une croissance bactérienne ou d'examiner ses compétences dans les conditions physiologiques grâce à l'utilisation de sérum conditions -comme pour la culture. Le protocole utilisé pour étudier des enzymes GKL peut être étendu à d'autres enzymes et des agents pathogènes quorum-trempe d'enquêter sur leur relation dans la perturbation de biofilm.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
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