Introduction
Le opzioni di trattamento per le malattie infettive sono state complicate dal rapido aumento di batteri multiresistenti che sono immuni a una vasta gamma di farmaci antibiotici 1. Con l'alta morbilità e mortalità da infezioni batteri mediata resistenti, vi è la necessità di intensificare i processi di sviluppo di droga e / o esplorare alternative migliori antibatterici per migliorare le opzioni terapeutiche. Ultimamente, l'approccio anti-virulenza sta guadagnando interesse dato il suo potenziale nella prevenzione virulenza attraverso media non battericida, quindi mitigare i rischi del meccanismi di resistenza 2.
Quorum-sensing è un 'interruttore generale' nella virulenza batterica e la rottura di questo fenomeno di segnalazione è un metodo anti-virulenza promettente contro patogenesi 3. L'insorgenza della virulenza richiede l'accumulo di molecole quorum nell'ambiente extracellulare dopo aver raggiunto una densità di popolazione batterica critica. Come quomolecole rum diffondono nella matrice intracellulare, legandosi con i loro recettori cognate porta all'attivazione di fattori di virulenza e geni associati con resistenza agli antibiotici e formazione di biofilm 4. In generale, l'interruzione del quorum sensing comporta inibendo molecola quorum e recettore senza influenzare le principali vie metaboliche. Quindi, non ha alcuna implicazione diretta sulla crescita cellulare. Dal momento che il fitness non è compromessa, c'è minima pressione selettiva per i batteri ad evolversi e acquisire resistenza contro tali trattamenti 5. Inoltre, l'interruzione quorum-sensing può interferire con i meccanismi di protezione batterici intrinseci, come nel caso della formazione del biofilm, che fornisce protezione dagli agenti antibatterici e risposta immunitaria.
Si stima che il 99% dei microbi sulla Terra esiste in matrici complesse come biofilm, le conferisce dei vantaggi di sopravvivenza fondamentali per i microrganismi che vivono all'interno thstrutture ESE 6. Ancora più importante, la formazione di questi domini sessili è la causa della maggior parte delle infezioni persistenti e croniche nosocomiali 7. Acinetobacter baumannii è uno dei principali agenti patogeni umani che è associato a infezioni contratte in ospedale globali e la sua virulenza è in gran parte attribuito al quorum sensing formazione di biofilm mediata 8. Enzimi tempra quorum sono stati utilizzati con successo in interrompere quorum mediata trasduzione del segnale di mira un gruppo di composti noti come N -acyl lattoni Homoserine (AHLs) che sono prodotte da batteri Gram-negativi 9. Diversi studi hanno inoltre ampliato sull'uso di questi enzimi per bloccare patogenesi batterica attraverso la riduzione dei numeri di espressione fattore di virulenza e di cella in biofilm 10,11. Purtroppo, permane una mancanza di manifestazione palpabile di un uso efficace di enzimi-quorum tempra contro la formazione di biofilm da batteri patogeni. Ilre sono stati tentativi di utilizzare gli inibitori del quorum (analoghi AHL), invece di enzimi quorum-tempra, di interrompere A. baumannii biofilm formazione 12. Anche se questo metodo di utilizzo di piccole molecole inibitori è un valido approccio, sostenendo la sua biodisponibilità negli usi traslazionali può essere una sfida. Al contrario, l'utilizzo di enzimi quorum tempra catalitici potrebbe aggirare il problema biodisponibilità come enzimi sono più suscettibili verso l'immobilizzazione su superfici di dispositivi biomedicali per effetti terapeutici.
Qui, descriviamo una valutazione degli effetti della ingegnerizzati-quorum tempra lactonases da Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 sulla formazione di biofilm batterico, utilizzando colorazione cristallo viola e microscopia confocale a scansione laser (CLSM). Questo studio è il primo dimostrazione riuscita di interruzione biofilm in una clinicamente rilevante A. ceppo baumannii S1 utilizzando enzimi quorum-tempra. I metodi descrittiin questo studio sono utili per valutare l'efficacia di altri enzimi quorum tempra nei successivi sforzi di sviluppo terapeutici contro i batteri Gram-negativi patogeni.
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Protocol
1. cristallo viola Quantificazione di formazione di biofilm in A. baumannii S1
- Grow una cultura 5 ml di A. baumannii S1 in lisogenia brodo (LB) (triptone 10 g / L, estratto di lievito 5 g / L) a 30 ° C in un incubatore scuotimento (220 rpm) per 16 ore.
- Regolare la cultura della A. baumannii S1 ad una OD 600 di 0,8 desiderato. Utilizzando una piastra a 96 pozzetti, inoculare la coltura batterica (diluizione 1: 100) in fresco LB contenente 10 ml di enzima purificato GKL (40 mg / ml); volume finale della nuova cultura è 100 l.
- Preparare una coltura di controllo pure; questo non conterrà alcun enzima. Ripetere condizioni simili a cedere il numero desiderato di repliche.
- Coprire la piastra con un coperchio e metterlo in un contenitore di plastica 10 L sigillato. Incubare la piastra a 30 ° C per 3 ore prima di rimuovere delicatamente il supporto.
- Aggiungere altri 100 ml di mezzo fresco LB al pozzetto ed incubare la piastra per 21 ore a 30 ° C. Dopo il secondo periodo di incubazione, rimuovere delicatamente tutti i media. Lavare il cellulare dei batteri planctonici con 200 ml di acqua sterile. Assicurarsi che vi sia solo il minimo disturbo alle cellule durante il lavaggio.
- Aggiungere 100 ml di soluzione al cristalvioletto 1% ad ogni pozzetto ed incubare per 15 minuti a RT. Rimuovere la soluzione cristalvioletto lavando il bene con 200 microlitri di acqua sterile. Ripetere il lavaggio per altre due volte.
- Aggiungere 100 ml di 33% di acido acetico ad ogni pozzetto e incubare per 15 minuti agitando delicatamente; questo si dissolverà il colorante.
- Quantificare la quantità di biofilm formata misurando l'assorbanza di cristalvioletto a 600 nm. La quantità di cristalvioletto è proporzionale alla quantità di biofilm formato.
2. Microscopia confocale a scansione laser di A. baumannii S1 biofilm
- Grow una cultura 5 ml di A. baumannii S1 in LB a 30 ° C in un incubatore scuotimento (220 rpm) per 16 ore.
- Anno Dominisolo la cultura di A. baumannii S1 ad una OD 600 di 0,8 desiderato. Utilizzando un fondo di vetro μ-Dish 35 mm, inoculare la coltura batterica (diluizione 1: 100) in fresco LB contenente 30 ml di purificata GKL enzima (40 mg / ml); volume finale della nuova cultura è di 1 ml.
- Coprire il μ-Piatto con un coperchio e metterlo in un contenitore di plastica sigillato 10 L. Incubare la μ-Dish a 30 ° C per 3 ore prima di rimuovere delicatamente il supporto. Aggiungere 30 ml di enzima purificato GKL e mezzo fresco, portando ad un volume totale di 1 ml. Incubare per 21 ore a un'altra 30 ° C.
- Ripetere il passaggio 2.3 e incubare la μ-Dish per un altro 24 ore a 30 ° C. Quindi, rimuovere il supporto delicatamente.
- Aggiungere 500 pl di 5 mg / ml Alex Fluo 488-coniugato agglutinina di germe di grano (WGA) disciolto in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a μ-piatto e incubare a 37 ° C per 30 min; questo si macchia il biofilm formato. Rimuovere la soluzione colorante e lavare tegli μ-Piatto con 2 ml di HBSS. Ripetere la fase di lavaggio ancora una volta.
- Aggiungere 500 ml di 3,7% di formaldeide sciolto in HBSS e incubare a 37 ° C per 30 min; questo risolverà il biofilm sul μ-Dish. Lavare il μ-piatto una volta con 2 ml di HBSS e quindi rimuovere completamente la soluzione. La μ-Dish fissa con biofilm può essere conservato al buio a 4 ° C prima di imaging CLSM.
- Per CLSM di imaging e di analisi, utilizzare 63 ingrandimenti per generare 97 pile per immagine con un intervallo di 0,21 micron per stack.
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Representative Results
Nell'esperimento quantificazione cristallo viola, due enzimi quorum-tempra sono stati usati per dimostrare la fattibilità a interrompere la formazione di biofilm: wild-type GKL e una migliore doppio mutante GKL (E101G / R230C). Entrambi gli enzimi sono stati indicati per dimostrare l'attività lactonase contro 3-idrossi-L-decanoil-omoserina lattone (3-OH-C 10 -HSL), la principale molecola quorum utilizzato da A. baumannii S1 14. Per valida la valutazione di interruzione biofilm, i loro rispettivi enzimi cataliticamente inattivi (in precedenza dimostrato di non sequestrare ligandi AHL) sono stati inclusi anche i controlli immediati (GKL D266N mutante e GKL E101G / R230C / D266N mutante). Oltre a utilizzare wild-type A. baumannii S1, la capacità biofilm formazione di un ceppo mutante Δ Abai (AHL sintasi con deficit) è stato anche testato. Entrambi gli enzimi quorum-tempra, wild-type GKL e GKL E101G / R230C mutanti sono stati in grado di ridurre in modo significativo la formazione di biofilm in preA. trattati culture baumannii S1 (n = 10; p-value ≤ 0,0001) (Figura 1). Tuttavia, l'entità di interruzione biofilm per entrambi gli enzimi non è proporzionale alla loro efficacia contro 3-OH-C 10 -HSL. Il tasso di turnover (k cat) del / R230C mutante GKL E101G è sei volte più veloce di wild-type GKL contro 3-OH-C 10 -HSL 14. Tuttavia, la differenza nel grado di perturbazione biofilm tra gli enzimi è solo due volte.
Figura 1. A. formazione baumannii test interruzione biofilm. biofilm è stata misurata con cristallo viola colorazione. Colonne rosse rappresentano la quantità di biofilm formato da wild type A. baumannii e Δ Abai mutante, senza l'aggiunta di lactonases quorum-tempra. Colonne blu rappresentano l'amount di biofilm formato da wild-type A. baumannii in presenza di quattro diversi enzimi GKL: inattivo GKL D266N mutanti, wild-type GKL, inattivo GKL E101G / R230C / D266N mutanti e GKL E101G / R230C mutanti. ****, P- valore ≤ 0,0001. Riprodotto con il permesso di agenti antimicrobici e Chemioterapia 58, 1802-1805 (2014). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Confocale di A. baumannii S1 formazione di biofilm è stato usato per fornire una misura qualitativa e quantitativa di effetti quorum-tempra sulla morfologia strutturale di questi domini sessili. Il miglioramento GKL E101G / R230C mutante e il suo enzima attività catalitica sono stati utilizzati per il confronto. Il contrasto immagine differenziale immagine (DIC) ha mostrato che il trattamento con il miglioramento GKL E101G / R230C mutante ha determinato una diminuzione della dimensione biofilm (Figure 2). Analisi delle immagini di fluorescenza anche rivelato che vi era riduzione dell'area superficiale, biomassa e spessore medio di biofilm quando trattati con la migliorata GKL E101G / R230C mutante (Tabella 1).
Immagini Figura 2. Rappresentante microscopia confocale a scansione laser di A. biofilm baumannii. A. biofilm baumannii sono stati trattati con inattivo GKL E101G / R230C / D266N mutante (A) e GKL E101G / R230C mutante (B) e colorate con Alexa Fluor 488-coniugato WGA. Immagini DIC dei biofilm (a sinistra) e le immagini di fluorescenza dei biofilm (a destra) sono indicati per xy rappresentante (al centro), yz (a destra), e XZ (in basso) sezioni. Riprodotto con il permesso di agenti antimicrobici e Chemioterapia <strong> 58, 1802-1805 (2014). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Valore ± DS un | |||
| Caratteristica | Nessun trattamento | Il trattamento con mutante inattivo | Il trattamento con E101G / R230C mutante |
| Biomassa (micron 3 / micron 2) | 2.57 ± 1.65 | 3.39 ± 1.33 | 1.37 ± 0.20 ** |
| Spessore Avg (micron) | 3.68 ± 2.51 | 3.41 ± 1.31 | 1.21 ± 0.21 ** |
| Superficie (micron) | 235,920.59 ± 79,456.46 | 209,872.6 115,094.7 ± | 115,354.9 * ± 7,630.3 |
| a n = 10 pile di immagini. **, P ≤ 0,001; *, P ≤ 0.05, rispetto al trattamento con inattivo E101G / R230C / D266N mutante. | |||
Tabella 1. A. baumannii biofilm quantificazione strutturale.
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Discussion
In entrambe le serie di esperimenti, A. baumannii S1 è stato coltivato in LB media senza NaCl come concentrazione di sali può ridurre la quantità di biofilm formato dai batteri 15. La presenza di tale manufatto potrebbe sottovalutare la quantità di biofilm formato, nonché gli effetti degli enzimi-quorum tempra attraverso diverse condizioni di trattamento. L'uso di un enzima cataliticamente inattiva è importante come controllo negativo per eliminare i possibili effetti di enzima sequestro. La figura 1 mostra che, anche se gli enzimi inattivi sequestrano molecole quorum, formazione di biofilm da non interrompere.
A. baumannii S1 forma una delicata struttura biofilm anulare tra aria e l'interfaccia liquido nel pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Quindi, è fondamentale per evitare l'agitazione eccessiva durante la rimozione e lavaggio mezzi passi per impedire la rimozione accidentale di biofilm batterici. LB media è stato rimosso dopo l'incubazione aeliminare le cellule planctoniche. Inoltre, la piastra a 96 pozzetti è stata posta in un contenitore di plastica 10 L per minimizzare le perturbazioni nella circolazione dell'aria e per creare un ambiente di micro-anaerobico che favorisce la formazione di biofilm. Biofilm quantificazione in una piastra a 96 pozzetti dipende anche dalla quantità di cristalvioletto aggiunti a ciascun pozzetto. Nel caso che l'eccesso cristalvioletto viene aggiunto in un pozzo, il numero delle fasi di lavaggio può essere aumentata. L'esperimento di cristallo colorazione viola fornisce un confronto relativo di efficienza quorum di spegnimento in rottura biofilm. Sebbene cristalvioletto colorazione è quantitativa per misurare la formazione di biofilm, è solo semi-quantitativa in termini di efficienza catalitica degli enzimi quorum-tempra. Per confronto statistiche accurate, le dimensioni dei campioni sufficienti sono importanti per i diversi gruppi di trattamento. I valori anomali dovrebbero essere rimosse per prevenire travisamento dei risultati.
Imaging e analisi del biofilm batterico confocale è una USEFul strumento per valutare gli effetti qualitativi degli enzimi-quorum tempra. Tuttavia, il processo di selezione per biofilm analisi può essere un canale potenziale di bias se l'utente è a conoscenza del tipo di quorum tempra enzima somministrata (attivo o inattivo). Per evitare la possibilità di polarizzazione, l'esperimento può essere progettato per escludere le informazioni enzima dall'utente o utilizzare un metodo casuale per la selezione. Una strategia di selezione imparziale permette anche una migliore comparazione quantitativa delle morfologie biofilm da CLSM. Tuttavia, questo è il primo studio che descrive un metodo per valutare l'esito di enzimi quorum tempra sul biofilm batterici. Cristallo colorazione viola ha dimostrato l'utilità di enzimi-quorum tempra in rottura biofilm e ha rivelato che modi operandorum enzimi "non si limitano a ridurre il numero di cellule e di espressione fattore di virulenza. Nel frattempo, le modifiche morfologiche determinate mediante analisi CLSM possono anche fornire intuizioni possibile moleculobiettivi ar di questi enzimi. Sebbene l'esperimento attuale è stato concepito per studiare gli effetti di enzimi pretrattamento sui biofilm batterico, il protocollo può essere modificato per valutare l'effetto del enzimatica su biofilm preformato dall'aggiunta dell'enzima dopo la crescita batterica o esaminare la sua competenza in condizioni fisiologiche attraverso l'uso di siero condizioni -come per la cultura. Il protocollo utilizzato per lo studio degli enzimi GKL può essere estesa ad altri enzimi e agenti patogeni quorum-tempra per indagare il loro rapporto in rottura biofilm.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
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