Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En optimeret fremgangsmåde til isolering og udvidelse Invariant Natural Killer T-celler fra musemilt

doi: 10.3791/53256 Published: October 29, 2015

Abstract

Evnen til hurtigt at udskille cytokiner ved stimulering er en funktionel egenskab ved den invariante naturlige killer T (iNKT) cellelinie. iNKT celler er derfor karakteriseret som en medfødt T-cellepopulation stand til at aktivere og styre adaptive immunresponser. Udviklingen af forbedrede teknikker til kultur og udvidelse af murine iNKT celler letter studiet af iNKT cellebiologi i in vitro og in vivo modelsystemer. Her beskriver vi en optimeret procedure til isolering og ekspansion af murine milt iNKT celler.

Milt fra C57BL / 6-mus er fjernet, dissekeret og anstrengt og den resulterende cellulære suspension lag over densitetsgradient medier. Efter centrifugering er milt mononukleære celler (MNCs) indsamles og CD5-positive (CD5 +) lymfocytter beriges for anvendelse af magnetiske perler. iNKT celler i CD5 + fraktionen farves efterfølgende med ^5, GalCer-loaded CD1d tetramer og oprenset ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). FACS sorteret iNKT celler derefter oprindeligt dyrket in vitro under anvendelse af en kombination af rekombinante murine cytokiner og pladebundet T-cellereceptor (TCR) stimuli inden udvides i nærvær af murine rekombinant IL-7. Med denne teknik, cirka 10 8 iNKT celler kan genereres inden 18-20 dages dyrkning, hvorefter de kan anvendes til funktionelle assays in vitro, eller til in vivo kan overføres eksperimenter i mus.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Murine invariant naturlige dræberceller T (iNKT) celler er en særskilt population af medfødte T-lymfocytter er valgt i thymus ved CD1d-udtrykkende kortikale thymocytter 1,2. iNKT celler udtrykker en T-cellereceptor (TCR), der består af et invariant Vα14-Jα18 TCR-kæde parret med enten Vβ8, Vβ7 eller Vβ2 TCR'er 3, som er i stand til at genkende endogent samt udenlandske lipid antigener i forbindelse med CD1d. For eksempel genkender murine iNKT celler og aktiveres af et endogent antigen kaldet lipid isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, samt α-galactosylceramid (αGalCer) 5,6, et glycolipid isoleret fra marine svampe. TCR-afhængige aktivering af iNKT celler fremmer priming af adaptive immunresponser, og som følge heraf, har iNKT celler vist sig at være funktionelt involveret i bedring eller udvikling af en række af patologier, herunder reumatiske sygdomme 7 og kræft <sup> 8. I øjeblikket, syntetiske iNKT celle ligander udgør lovende nye vaccineadjuvanser, der kan være i stand til at regulere en række immunopatologiske betingelser.

Det er tidligere blevet påvist, at iNKT celler kan genereres in vitro efter isolering fra muse væv dog; mange af disse undersøgelser ansætte brugen af primære antigenpræsenterende celler (APC'er) og / eller cellelinier 9, Vα14 TCR transgene (Tg) mus 10 eller thymomer til generering af iNKT celleafledte hybridomer 11,12. Desuden stort antal mus, store mængder af reagenser, såsom αGalCer-loaded CD1d dimerer, og lange dyrkningstider foretage nogle publicerede protokoller mindre etisk og økonomisk tiltrækkende 9,13.

I denne rapport beskriver vi en tilpasset fremgangsmåde til isolering og in vitro udvidelse af iNKT celler fra muse milt. Mere specifikt protokollen beskriver en fremgangsmådetil berigelse iNKT celler fra musemilt hvilket reducerer mus, reagenser og kræve længere tid til FACS cellesortering, og foreslår en optimeret tilgang for at udvide sorterede milt iNKT celler in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I denne undersøgelse blev voksne (6-8 uger) C57BL / 6-mus anvendes. Mus blev opstaldet og opdrættet i overensstemmelse med retningslinjerne i Ghent Universitet terrariet. Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og etiske komité.

1. Fremstilling af mononukleære celler (MNCs) fra musemilt

  1. Sacrifice musen ved cervikal dislokation.
  2. Placer musen igen ned på dissekere bord og løse hind og forbenene med stifter.
  3. Sterilisere huden-overflade med 70% (vol / vol) ethanol / H 2 O.
  4. Skære huden langs den abdominale midterlinjen på thorax og udsætte milten med sterile kirurgiske instrumenter.
  5. Efter trimning de omkringliggende fedtvæv, placere milten i en plade med 24 brønde indeholdende 1 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS) ved stuetemperatur.
  6. Dissekere milten ved anvendelse af en steril skalpel og overføre stykkerne i en 70 um nylonfilter placeres i en 50 ml karbade.
  7. Ved hjælp af en 2 ml sprøjte stempel, forsigtigt mash milten stykker gennem cellen si og vask med 5 ml 1x PBS.
  8. Tilsæt 3 ml Ficoll-Paque til et 15 ml rør og overtrække den densitetsgradient medium med 5 ml cellesuspension.
  9. Centrifuger ved 400 xg i 20 minutter ved stuetemperatur uden bremse.
  10. Overfør interfasen til et frisk 15 ml rør, tilsættes 10 ml koldt 1x PBS og centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
  11. Resuspender cellerne i 2 ml 1x PBS indeholdende 0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) (FACS buffer). Transfer 10 pi af cellesuspensionen til et lille rør, blandes med 10 pi 0,4%

2. Tilsætning, Detektion og oprensning af Mouse iNKT Cells

  1. Berigelse af muse milt CD5positive (CD5 +) lymfocytter.
    1. (Valgfrit) Stain 10 5 celler med FITC-konjugeret anti-CD5 (4 pi på 1:30 fortynding / 10 6 celler)i 30 minutter ved 4 ° C i mørke og vaskes med 200 pi FACS buffer og resuspender i 500 pi FACS buffer. Der fremstilles en 20 uM arbejdsopløsning af 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i 1 x PBS, tilsættes 1 ul deraf til 10 5 celler i FACS buffer og inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter. Erhverve 10 4 pre-berigede celler på flowcytometeret.
      1. Brug af FCS-H og FCS-W, elektronisk gate på FSC-wlo celler at udelukke celledubletter og aggregater (figur 1A). Så elektronisk gate ud DAPI + (døde) celler i FSC-W lo befolkning (figur 1B), og brug SSC-A og FCS-A til elektronisk vælge lymfocytpopulationen efter størrelse (figur 1C).
      2. Anvendelse af celler inden lymfocytgaten, plot SSC-A versus CD5 og elektronisk gate CD5 + lymfocytter som vist i figur 1D. Erhverve den resterende del af præ-beriget prøve på flowcytometer.
      3. Juster celletal til 10 7 celler pr 90 pi i FACS buffer og tilsættes 10 pi anti-CD5 mikroperler.
      4. Der inkuberes ved 4 ° C i 15 minutter, vaskes en gang med 4 ml FACS buffer og resuspender i 500 pi kold FACS-buffer. Berige for CD5 + lymfocytter ved hjælp af magnetisk celle separation (MACS) kolonner efter producentens anbefalinger.
      5. Valgfrit) Stain 10 5 celler med FITC-konjugeret anti-CD5 (4 pi 01:30 fortynding / 10 6 celler) og DAPI som i 2.1.1. Erhverve 10 4 berigede lymfocytter på flowcytometeret og kontrollere, at de elektroniske porte oprettet i 2.1.1. Vælg CD5 + lymfocytter i den berigede cellefraktion. Erhverve 10 5 celler på flowcytometeret og analysere den procentvise CD5 + lymfocytter til stede i den berigede fraktion som vist i figur 1E - H.
    2. Påvisning og isolering af mus iNKT ceLLS ved FACS.
      1. Resuspender berigede CD5 + lymfocytter ved en koncentration på ca. 10 6 celler pr 20 pi i FACS buffer indeholdende anti-CD16 / CD32 (4 pi 1:50 / 10 6 celler) og PE-konjugeret αGalCer / CD1d tetramer (1 ug / 10 6 celler).
      2. Der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
      3. Fortynd museantistoffer (mAb'er) anti-CD3e V500 (4 pi fortyndet 1:20 / 10 6 celler), anti-CD19 E450 (4 pi på 1:50 fortynding / 10 6 celler) og anti-CD8a E450 (4 pi 1:50 / 10 6 celler) i FACS-buffer tilsættes til CD5 + lymfocytter og inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C i mørke.
      4. Vask cellerne med 1 ml FACS buffer ved centrifugering ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C og resuspenderes i 4 ml FACS puffer ved en slutkoncentration på 10 7 celler / ml.
      5. Filtrer cellerne gennem en 30 um si og celle placere cellerne på is.
      6. Kalibrer flowcytometeret for cellesortering ifølge producentens anbefalinger 14,15.
        Bemærk: Kalibrering af et flowcytometer til cellesortering kræver træning og kan udføres af en erfaren operatør eller en uddannet tekniker.
      7. Tilsæt 10 gl af en 20 pM arbejdsopløsning af DAPI pr 10 6 celler og inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter. Anskaf ca. 10 4 beriget CD5 + lymfocytter på flowcytometeret. Elektronisk gate på FSC-wlo celler at udelukke celledubletter og aggregater (figur 2A). Derefter elektronisk gate ud DAPI + CD8 + CD19 + celler (dump kanal) inden for FSC-W lo population (figur 2B), og bruge SSC-A og FCS-A til elektronisk vælge lymfocytter (figur 2C) som beskrevet i 2.1.1.1 .
        1. Plot αGalCer / CD1d tetrameren af ​​CD3e og elektronisk gate αGalCer / CD1dtetramer + CD3e + iNKT celler som vist i figur 2D. Ikke erhverve mere end 2 x 10 5 CD5 + beriget lymfocytter til at bestemme den procentvise αGalCer / CD1d tetramer + CD3e + iNKT celler til stede i berigede cellulære fraktion.
      8. Brug af elektroniske porte er oprettet i 2.2.7., FACS sortering αGalCer / CD1d tetramer + CD3e + iNKT celler på flowcytometeret ved 70 psi under anvendelse af en 70 um dyse ved en strømningshastighed på "1,5". Saml sorterede iNKT celler i en FACS-rør indeholdende 1 ml 100% FCS. Efterfølgende skylles ud iNKT celler fra siden af ​​FACS rør under anvendelse af 10 ml RMPI 1640 medium og centrifugeres cellerne ved 300 x g i 10 min ved 4 ° C.
      9. Resuspender sorteret iNKT celler i 1 ml RPMI 1640-medium og erhverve 40 pi deraf på et flowcytometer at vurdere renheden af ​​sorterede iNKT celler. Vælg FSC-W lo DAPI - lymfocyts som beskrevet i 2.2.7. (Figur 2E - G) og elektronisk gate αGalCer / CD1d tetramer + CD3e + iNKT celler som vist i figur 2H.

    3. Kultur og Udvidelse af Mouse iNKT Cells

    Dag 0

    1. Coat en fladbundet plade med 96 brønde med oprenset anti-CD3e (3 ug / ml) pr i 1 time ved stuetemperatur. Vask to gange med 200 pi 1x PBS og en gang med 200 ul komplet RPMI 1640-medium (10% vol / vol FCS, 100 U / ml penicillin-streptomycin, 5,5 uM β-mercaptoethanol).
    2. Tæl antallet af levedygtige celler sorteret iNKT (trin 2.2.8) under anvendelse af 0,4% et hæmocytometer som i 1.11., Centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C og resuspender på 5 x 10 5 celler / ml i komplet RPMI 1640 medium indeholdende rekombinant murint IL-2 (10 ng / ml), rekombinant murint IL-12 (1 ng / ml) og opløselig anti-muse CD28 (5 pg / ml). Plade sorted iNKT celler ved 10 5 celler / brønd i anti-CD3e overtrukne plader og inkuberes ved 37 ° C i en CO2-inkubator i 2 dage.

    Dag 2

    1. Overfør cellerne til et frisk ubestrøget fladbundet plade med 96 brønde og dyrke cellerne under hvilebetingelser i komplet RPMI 1640 medium ved 37 ° C i en CO2-inkubator i 2 dage.

    Dag 4

    1. Løsne cellerne fra pladen ved forsigtig pipettering og overføre cellerne til et frisk 15 ml rør. Centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C, resuspender på 5 x 10 5 celler / ml i komplet RPMI 1640 medium indeholdende rekombinant murin IL-7 (5 ng / ml), og pladen 10 5 celler / brønd i en flad- bund 96-brønds plade i 4 dage ved 37 ° C i en CO2-inkubator.

    Dag 8

    1. Opsamle cellerne i et frisk rør, centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C og resuspender med 5 x 10 5 celler / ml i komplet RPMI 1640-medium indeholdende opløseligt anti-CD28 (5 pg / ml).
    2. Coat en fladbundet plade med 96 brønde med renset anti-CD3e (3 ug / ml) per brønd og vask som i 3.1. Plate 10 5 celler / brønd i anti-CD3e overtrukne plader og inkuberes ved 37 ° C i en CO2-inkubator indtil dag 11.

    Dag 11 - 18

    1. Gentag trin 3.4 til 3.6.

    Dag 19-20

    1. Overfør cellerne til et frisk 15 ml rør, centrifugeres ved 300 xg og resuspender med 5 x 10 5 celler / ml i komplet RPMI 1640 medium.
    2. Plate cellerne ved 10 5 celler / brønd i en fladbundet plade med 96 brønde og tillader cellerne at hvile i 2 dage ved 37 ° C i en CO2-inkubator før anvendelse i et forsøg.

    4. cytokinproduktion af Mouse iNKT Celler Brug af en CD1d Plate-bundet assay

    1. Coat en fladbundet plade med 96 brønde med 100 pi rekombinant murint CD1d (10 ug / ml i 1 x PBS) pr brønd og inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
    2. Udvaskes fire gange med 200 pi 1x PBS, tilsættes 200 pi 2% FCS i 1 x PBS (blokerende opløsning) pr brønd og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C.
    3. Den blokerende opløsning fjernes, der tilsættes 200 pi αGalCer (5 ng / pl) pr, og inkuber pladen ved 37 ° C i 16 timer. [Til fremstilling af αGalCer opløsningen, tilsættes 1,085 μ 1x PBS til 55 ug αGalCer opløst i vehikel indeholdende 96 mg / ml saccharose, 10 mg / ml natriumdeoxycholat og 5 mg / ml Tween 20].
    4. Efter inkubation kasseres αGalCer opløsningen og vask godt to gange med 200 pi 1x PBS efterfulgt af 200 pi komplet RPMI 1640 medium.
    5. Saml in vitro ekspanderede iNKT celler på dag 21, centrifugeres cellerne ved 300 x g i 10 min ved 4 ° C og resuspenderes i komplet RPMI 1640 medium i en koncentration på 0,5 x 10 6 celler / ml.
    6. Tilsæt 200 pi af iNKT celle resuspension per brønd og inkuberes i 72 timer ved 37 ° C i en CO2-inkubator.
    7. Den ovenstående væske opsamles og måle cytokiner af interesse ved enzymbundet immunsorbentassay (ELISA) ifølge producentens protokol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Isolering af mononukleære celler milt under anvendelse af en densitetsgradient tager ca. 1 time og eliminerer brugen af ​​reagenser, der er nødvendige for at lysere røde blodlegemer (RBC). Et højt udbytte af levedygtige celler opnås ved hjælp af denne fremgangsmåde og affaldsrester dræning af organet fjernes. Typisk frekvensen af ​​iNKT celler i milten lymfocyt pool i området mellem 1 og 5% af den samlede T-lymfocytter men dette kan variere afhængigt af alder, køn og sundhedstilstand de anvendte dyr. Cirka 10 6 iNKT celler kan erhverves fra de samlede milt fra 3 mus og det højeste udbytte af iNKT celler opnås fra milten af 6-8 uger gamle mus.

Anvendelsen af muse-anti-CD5 magnetiske perler væsentligt beriger for iNKT celler i milt MNC fraktion og, bortset fra en mindre population af B-lymfocytter, som udtrykker CD5 antigen, de fleste celler isoleres under anvendelse af denne procedure udgør CD5 + Lymphocytes. For eksempel 5-8% af MNCs opnået efter CD5 berigelse er CD5-negative (figur 1H). For iNKT celle FACS-sortering, der kombinerer αGalCer / CD1d tetramer og anti-muse CD3e giver iNKT celle renheder over 98% bør imidlertid anvendes FACS dump kanaler til milt B og CD8 T-celler at eliminere "klæbrige" lymfocytpopulationer i løbet af slags. Desuden gate eventuelle dubletter, der kan være dannet under CD5 berigelse trin. Brug af denne FACS setup, vi opnåede iNKT celle renheder post-sortering i størrelsesordenen 99% (figur 2H).

Stimulering 10 6 Weaver iNKT celler med pladebundet anti-CD3e i nærværelse af IL-2, IL-12 og opløselig anti-CD28 resulterede i en 3-fold udvidelse af iNKT tal efter 2 dages dyrkning (figur 3). Efterfølgende ekspansion iNKT celler i nærvær af IL-7 resulterer i en 3- til 4-fold stigning i antallet af celler til stede iNKT på dag 4 i kultur. Notably kan gentage disse dyrkningsbetingelser gav et gennemsnit på 7 x 10 7 iNKT celler efter to runder af udvidelse uden nogen synlig tab af celler mellem ændringer i dyrkningsmedier på forskellige dage (figur 3). Således kan murine milt iNKT celler udvides mindst 70 gange ved anvendelse af disse betingelser i 18 dage.

Vi vurderede også cytokinproducerende kapacitet ekspanderede iNKT celler ved stimulering med plade-bundne rekombinant muse CD1d læsset med αGalCer. Ved 48 timer efter stimulering, IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α og IL-6 kunne let påvises i kultursupernatanter ved ELISA (figur 4). Udvidet iNKT celler derfor bevarer evnen til at producere Th1 og Th2 cytokiner efter ekspansion.

Figur 1
Figur 1. Enrichment for CD5 +Lymfocytter fra mus milt MNC'er. Gating strategi til analyse procentdelen af CD5 + lymfocytter til stede i præ-beriget (AD) og magnetisk celleseparering-beriget (EH) mus milt MNC suspensioner. Cell dubletter (A, E) og døde celler (B, F) er blevet udelukket ved hjælp af FSC-H versus FCS-W og DAPI versus FSC-A plots, hhv. Den procentvise CD5 + celler til stede i lymfocyt gate (C, G), både før og efter berigelse er vist i D og H, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2

Fig ure 2. FACS-sortering iNKT celler fra CD5-berigede milt MNC'er. Gating strategi til analyse procentdelen αGalCer / CD1d tetramer + CD3e + iNKT celler til stede før (A - D) og efter (E - H) FACS-sortering. Den gating strategi eliminerer celle dubletter (A, E), døde celler og CD8 + CD19 + lymfocytter (B, F) fra analysen ved at plotte FSC-H versus FCS-W og DAPI, CD8 og CD19 (dump kanal) versus FSC- A hhv. Procentdelen αGalCer / CD1d tetramer + CD3e + iNKT celler til stede inden lymfocytgaten (C, G) før og efter FACS-sortering er vist i (D) og (H), henholdsvis. CD1d-Tet., ΑGalCer / CD1d Tetramer.få = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. absolutte antal iNKT celler frembragt in vitro. Fold stigning i antallet af iNKT celler på de angivne tidspunkter efter 3 ugers ekspansion in vitro. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. cytokinproducerende kapacitet in vitro ekspanderede iNKT celler. Dag 20 ekspanderede iNKT celler blev stimuleret in vitro med muse αGalCer-loaded CD1d. Efter 72 timer blev supernatanterne opsamlet og analyseret for tilstedeværelsen af ​​IFN-γ, IL-4, TNF-α, IL-2 og IL-6 ved ELISA. Søjler repræsenterer betyder SEM (n = 2). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kritiske trin i den nuværende protokol omfatter isolering og efterfølgende berigelse af CD5 + lymfocytter (Afsnit 1 & 2), FACS sortering (afsnit 3) og den indledende udpladning af iNKT celler (afsnit 4). Af de trin, der udføres i afsnit 1, så husk at omhyggeligt lag den milten cellulære suspension over densitetsgradient medium, således at en distinkt cellulær interfase genereres efter centrifugering. Den efterfølgende berigelse for CD5 + lymfocytter ved magnetisk celleseparation (afsnit 2) minimerer reagenser og tid, der kræves for at farve efter og FACS sortering iNKT celler (afsnit 3), som hjælper med at øge iNKT celleudbytter efter sortering. Endelig er det vigtigt at frø ikke mere end 10 5 iNKT celler pr godt for de første 2 dage af kultur (afsnit 4) som såning brønde med højere antal iNKT celler kan resultere i cellulær apoptose.

En række overvejelser er vigtige, når ændre og / eller troubleshooTing denne protokol: For det første, alder anvendte dyr er vigtig. Dyr, der enten er for gammel, eller have tilbehør infektioner, kan hæmme din evne til at isolere, skelne, og FACS sortering tilstrækkelige celler fra milten. For det andet, når farvning med αGalCer / CD1d tetramerer, er det vigtigt at holde mængden af celler resuspenderet i PBS-buffer lav som for høj en mængde fortynder ud farvningen effektiviteten af αGalCer / CD1d tetramer, hvilket igen reducerer ophobning af tetramer + iNKT celler ved FACS. Ideelt set tilstedeværelsen af stramt grupperet αGalCer / CD1d tetramer + iNKT celler under FACS købet giver mulighed for mere præcis gating ved FACS og giver højere renhedsgrad iNKTs under post-sortering analyse. Dette er vigtigt, da lavere sorterede iNKT celleudbytter vil resultere i udvækst af andre forurenende T cellepopulationer under dyrkning. For det tredje løbende opdatere medium, der bliver gult under kultur og udvidelse af iNKT ceLLS. For eksempel erstatte 50% af gulnet medium med nyt medium, der indeholder de relevante cytokiner, især under dage 8 og dag 11 af kulturen. iNKT celleudbytter kan maksimeres på denne måde.

Så vidt vi ved er dette første iNKT ekspansion protokollen til at omfatte en densitetsgradient og CD5 + lymfocyt berigelse trin til isolering og berigelse af iNKT celler fra muse milt. En række alternative muligheder er udtømt at berige for milt iNKT celler, herunder αGalCer / CD1d dimerer 13, Vα14 TCR Tg mus 10 samt udtømning af ikke-T-celler ved magnetisk celleseparation 9. Men selv om iNKT celler kan med succes udvidet in vitro ved hjælp af disse metoder, sådanne metoder kræver, enten store mængder αGalCer / CD1d dimerer at berige for iNKTs 13, kun generere transgene iNKT celler 10, eller samtidigt give anledning til nogle ikke-iNKT cellelinjer 9 </ sup>. Desuden til brugen af pladebundet anti-CD3e fastholde og udbygge sorterede iNKT celler (afsnit 4) er til hinder et krav om aktiverede APC'er under iNKT ekspansion in vitro 9. I denne sammenhæng er et APC-fri iNKT ekspansion protokol har den fordel ikke at skulle skille APC'er fra udvidede iNKT celler før injektion in vivo. Vi bør dog også tilføje, at protokollen beskrevet er begrænset af det faktum, at investigator kræver let adgang til, samt den relevante uddannelse, til at kalibrere og drive et FACS sorteringsanlæg. Desværre FACS sorteringsanlæg er dyre, og de er ikke altid tilgængelige i alle laboratorier. Ikke desto mindre, selv om den nuværende protokol er blevet optimeret til at isolere og kultur murine iNKT celler, trinene berigelse beskrevet heri kan også anvendes til at isolere og studere iNKT seneste thymiske emigranter (Rtes) 16 og kan tilpasses til at berige for og karakterisere andre sjældne T cellepopulationer ved FACS.

8 iNKT celler fra milten fra tre mus inden for 3 uger. iNKT celler genereret på denne måde bevarer evnen til at udskille cytokiner ved stimulering, hvilket gør dem anvendelige til adoptiv overførsel eksperimenter og undersøgelser af iNKT cellebiologi in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
recombinant murine IL-2 eBiosciences 14-8021
recombinant murine IL-12 eBiosciences 39-8122-65
recombinant murine IL-7 eBiosciences 14-8071
purified anti-mouse CD3e (145-2C11) eBiosciences 16-0032-86
purified anti-mouse CD28 (37.51) eBiosciences 16-0281-85
e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) eBiosciences 48-0193-82
e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) eBiosciences 48-0081-82
FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) eBiosciences 11-0051-81
V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) BD biosciences 560771
anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads Macs Miltenyi Biotec 130-049-301
purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) Macs Miltenyi Biotec 130-092-575
MACS MS Columns Macs Miltenyi Biotec 130-042-201
Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) Gibco 15250-061
RPMI 1640 medium Gibco 12633-020
1x PBS Gibco 10010-056 [Ca2+/Mg2+ - free]
Fetal calf serum Gibco 10270
L-Glutamine Gibco 25030-123
Penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich P4458-100ML
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906-100MG
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma-Aldrich EDS-1KG
Ficoll-Paque plus GE Healthcare 71-7167-00 AF
Equipment
96-well plate F-bottom Greiner-bio one 657-160
24-well plate Greiner-bio one 665-180
6-well plate Greiner-bio one 655-180
15 ml falcon tube Greiner-bio one 188-271
50 ml falcon tube Greiner-bio one 227-261
70 µm filter Greiner-bio one 542-070
30 µm filter Millipore SVGP01050
MiniMACS separator Macs Miltenyi Biotec 130-042-102
MS Columns Macs Miltenyi Biotec 130-042-201
Water-jacketed CO2 incubator VWR
Hemocytometer VWR
Dissection Kit VWR
BD FACSAria III BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
  2. Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
  3. Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
  4. Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
  5. Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
  6. Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
  7. Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
  8. Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
  9. Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
  10. Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
  11. Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
  12. Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
  13. Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
  14. Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9, (4), (2004).
  15. Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
  16. Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).
En optimeret fremgangsmåde til isolering og udvidelse Invariant Natural Killer T-celler fra musemilt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Govindarajan, S., Elewaut, D., Drennan, M. An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen. J. Vis. Exp. (104), e53256, doi:10.3791/53256 (2015).More

Govindarajan, S., Elewaut, D., Drennan, M. An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen. J. Vis. Exp. (104), e53256, doi:10.3791/53256 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter