Summary

Um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante Natural Killer T de Rato Spleen

Published: October 29, 2015
doi:

Summary

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Abstract

A capacidade de secretar citocinas rapidamente com a estimulação é uma característica funcional da invariante natural killer T (iNKT) linhagem celular. iNKT células são portanto caracterizado como uma população de células T capazes de activar inata e adaptativa direcção respostas imunes. O desenvolvimento de técnicas melhoradas para a cultura e expansão de células iNKT murino facilita o estudo de biologia celular iNKT in vitro e em sistemas modelo in vivo. Aqui, descrevemos um processo aperfeiçoado para o isolamento e a expansão de células esplénicas murinas iNKT.

Os baços de ratinhos C57BL / 6 são removidos, dissecados e tenso e a suspensão celular resultante é colocado em camadas sobre meios de gradiente de densidade. Após centrifugação, as células mononucleares esplénicas (MNCs) são recolhidos e linfócitos CD5-CD5 positivas (+) são enriquecidos para usando esferas magnéticas. iNKT células dentro da fracção CD5 + são subsequentemente corados com ^5; GalCer-carregado CD1d tetrâmero e purificou-se por selecção de células activadas de fluorescência (FACS). Separadas por FACS, em seguida, as células são iNKT inicialmente cultivadas in vitro, utilizando uma combinação de citocinas recombinantes de murideo e receptor de células T de placa ligado (TCR), antes de ser expandido estímulos em presença de murino IL-7 recombinante. Usando esta técnica, aproximadamente 10 8 iNKT células pode ser gerada dentro de 18-20 dias de cultura, após o que eles podem ser utilizados para ensaios funcionais in vitro, ou para experiências in vivo em ratinhos de transferência.

Introduction

Murino células T assassinas naturais invariante (iNKT) são uma população distinta de linfócitos T inatas selecionados no timo por expressando CD1d timócitos corticais 1,2. iNKT células expressam um receptor de células T (TCR) composta de uma cadeia Vα14-Jα18 TCR invariante emparelhado com qualquer Vβ8, Vβ7 Vβ2 TCRs ou 3, que é capaz de reconhecer endógena, bem como os antigénios de lípidos estranhos no contexto da CD1d. Por exemplo, células de murino iNKT reconhecer e são activados por um chamado lípido isoglobotrihexosylceramide antigénio endógeno (iGb3) 4, bem como α-galactosilceramida (αGalCer) 5,6, um glicolípido isolado a partir de esponjas marinhas. TCR-dependente de activação de células iNKT promove a iniciação de respostas imunitárias adaptativas, e como um resultado, as células iNKT foram mostrados para ser funcionalmente envolvidos na melhoria ou o desenvolvimento de uma variedade de patologias incluindo a doença reumática 7 e cancro <sup> 8. Actualmente, os ligandos celulares iTNK sintéticos constituem novos adjuvantes de vacinas promissoras, que podem ser capazes de regular a um número de condições imunopatológicas.

Foi previamente demonstrado que as células iNKT podem ser gerados in vitro após isolamento a partir de tecido de rato no entanto; muitos destes estudos emprega a utilização de células primárias de apresentação de antigénio (APCs) e / ou linhas de células 9, Vα14 TCR transgénicos (Tg) de 10 ratinhos, timomas ou para a geração de iNKT derivadas de células hibridomas 11,12. Além disso, um grande número de ratos, altos volumes de reagentes, tais como dímeros CD1d αGalCer-carregados, e tempos de cultivo longas fazer alguns protocolos publicados há menos de forma ética e economicamente atraente 9,13.

Neste relatório nós descrevemos um método adaptado para o isolamento e expansão in vitro de células de rato iNKT baço. Mais especificamente, o protocolo descreve um métodopara o enriquecimento de células de baço de ratinho iNKT que reduz os ratos, os reagentes e tempo necessários para FACS separação de células, e propõe uma abordagem otimizada para expansão de células esplênicas iNKT ordenados in vitro.

Protocol

Neste estudo, foram utilizados para adultos (6-8 semanas) fêmeas C57BL / 6. Os ratos foram alojados e produzido de acordo com as diretrizes do biotério da Universidade de Ghent. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética e Cuidado Animal Institucional. 1. Preparação de células mononucleares (MNC) a partir de baço de murganho Sacrifique o rato por deslocamento cervical. Posicione o mouse de volta para baixo na placa de dissecação e c…

Representative Results

Isolamento de células mononucleares esplénicas utilizando um gradiente de densidade leva cerca de 1 hora e elimina a utilização de reagentes necessários para a lise de glóbulos vermelhos (RBC). Um elevado rendimento de células viáveis ​​é obtida usando este método e detritos gerados durante a deformação do órgão é removido. Tipicamente, a frequência de células iNKT dentro do conjunto de linfócitos do baço varia entre 1 e 5% de linfócitos T totais no entanto, isto pode variar, dependendo do estado…

Discussion

Etapas críticas do protocolo atual incluem o isolamento e enriquecimento posterior de CD5 + linfócitos (Seção 1 & 2), FACS classificação (Seção 3) eo revestimento inicial de células iNKT (Seção 4). Dos passos realizados na Seção 1, lembre-se para a camada cuidadosamente a suspensão celular splenic a médio gradiente de densidade tal que uma interfase celulares distintos é gerado após a centrifugação. O enriquecimento posterior para CD5 + linfócitos por separação magnética …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.

Materials

Material
recombinant murine IL-2 eBiosciences 14-8021
recombinant murine IL-12 eBiosciences 39-8122-65
recombinant murine IL-7 eBiosciences 14-8071
purified anti-mouse CD3e (145-2C11) eBiosciences 16-0032-86
purified anti-mouse CD28 (37.51) eBiosciences 16-0281-85
e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) eBiosciences 48-0193-82
e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) eBiosciences 48-0081-82
FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) eBiosciences 11-0051-81
V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) BD biosciences 560771
anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads Macs Miltenyi Biotec 130-049-301
purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) Macs Miltenyi Biotec 130-092-575
MACS MS Columns Macs Miltenyi Biotec 130-042-201
Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) Gibco 15250-061
RPMI 1640 medium Gibco 12633-020
1x PBS Gibco 10010-056 [Ca2+/Mg2+ – free]
Fetal calf serum Gibco 10270
L-Glutamine Gibco 25030-123
Penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich P4458-100ML
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906-100MG
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma-Aldrich EDS-1KG
Ficoll-Paque plus GE Healthcare 71-7167-00 AF
Equipment
96-well plate F-bottom Greiner-bio one 657-160
24-well plate Greiner-bio one 665-180
6-well plate Greiner-bio one 655-180
15 ml falcon tube Greiner-bio one 188-271
50 ml falcon tube Greiner-bio one 227-261
70 µm filter Greiner-bio one 542-070
30 µm filter Millipore SVGP01050
MiniMACS separator Macs Miltenyi Biotec 130-042-102
MS Columns Macs Miltenyi Biotec 130-042-201
Water-jacketed CO2 incubator VWR
Hemocytometer VWR
Dissection Kit VWR
BD FACSAria III BD Biosciences

References

  1. Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
  2. Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
  3. Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
  4. Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
  5. Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
  6. Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
  7. Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
  8. Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
  9. Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
  10. Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
  11. Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
  12. Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
  13. Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
  14. Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. . BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
  15. Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in ‘real time’. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
  16. Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).

Play Video

Cite This Article
Govindarajan, S., Elewaut, D., Drennan, M. An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen. J. Vis. Exp. (104), e53256, doi:10.3791/53256 (2015).

View Video