Ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Ausbau unveränderlichen natürlichen Killer T-Zellen aus der Milz der Maus
Summary
Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.
Abstract
Die Fähigkeit, schnell zu sezernieren Zytokine bei Stimulation ist ein funktionelles Merkmal der invarianten natürlichen Killer-T (iNKT) Zelllinie. iNKT Zellen werden daher als einer angeborenen T-Zellpopulation in der Lage, die Aktivierung und Steuerung der adaptiven Immunantwort aus. Die Entwicklung von verbesserten Techniken zur Kultivierung und Expansion murine iNKT Zellen erleichtert die Untersuchung der Zellbiologie iNKT in in vitro und in vivo-Modellsystemen. Hier beschreiben wir ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Expansion von murinen Milz iNKT Zellen.
Milz von C57BL / 6-Mäusen entfernt, seziert und gespannt, und die resultierende Zellsuspension wird über Dichtegradientenmedien geschichtet. Nach der Zentrifugation werden Milz mononuklearen Zellen (MNC) gesammelt und CD5-positive (CD5 +) Lymphozyten werden für die Verwendung von magnetischen Kügelchen angereichert. iNKT Zellen innerhalb des CD5 + -Fraktion anschließend mit gefärbten ^5; GalCer belasteten CD1d Tetramer und durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) gereinigt. FACS sortiert iNKT Zellen werden dann zunächst in vitro unter Verwendung einer Kombination von rekombinanten murinen Zytokine und plattengebundenen T-Zell-Rezeptor (TCR) Stimuli, bevor sie in der Gegenwart von rekombinantem murinem IL-7 erweitert. Unter Verwendung dieser Technik etwa 10 8 iNKT Zellen können innerhalb von 18-20 Tagen Kultur, wonach sie für funktionelle Assays in vitro, oder in vivo Transferexperimente bei Mäusen verwendet werden, erzeugt werden.
Introduction
Murine invarianten natürlichen Killer-T (iNKT) Zellen sind eine deutliche Bevölkerung von angeborenen T-Lymphozyten im Thymus durch CD1d-exprimierenden kortikalen Thymozyten 1,2 ausgewählt. iNKT Zellen einen T-Zellrezeptor (TCR) von einer invarianten Vα14-Jα18 TCR-Kette gepaart mit entweder Vβ8, Vβ7 oder Vβ2 TCRs 3, die in der Lage ist Erkennung von endogenem sowie fremde Lipidantigene im Kontext von CD1d ist besteht. B. murine iNKT Zellen erkennen und werden durch eine endogene Lipid Antigen genannt isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, sowie α-Galactosylceramid (αGalCer) 5,6, einem Glykolipid aus marinen Schwämmen isoliert aktiviert. TCR-abhängige Aktivierung von iNKT Zellen fördert die Grundierung von der adaptiven Immunantwort, und als ein Ergebnis haben iNKT Zellen gezeigt wurde in der Linderung oder Entwicklung einer Reihe von Erkrankungen, einschließlich rheumatischen Erkrankungen und Krebs 7 funktionell beteiligt werden <sup> 8. Derzeit synthetischen iNKT Zellliganden bilden vielversprechende neue Impfstoff-Adjuvantien, die in der Lage, die Regulierung eine Reihe von immunpathologischen Bedingungen sein kann.
Es ist zuvor gezeigt worden, daß iNKT Zellen können in vitro nach der Isolierung aus Mausgewebe jedoch erzeugt werden; viele dieser Untersuchungen beschäftigen die Verwendung von primären Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) und / oder Zelllinien 9, Vα14 TCR transgenen (Tg) Mäuse 10 oder thymomas zur Erzeugung iNKT Zellen abgeleiteten Hybridome 11,12. Darüber hinaus eine große Anzahl von Mäusen, stellen große Mengen an Reagenzien, wie αGalCer belasteten CD1d Dimere, und langwierige Kultur mal einige veröffentlichten Protokollen weniger ethisch und wirtschaftlich attraktiv 9,13.
In diesem Bericht beschreiben wir ein angepasstes Verfahren zur Isolierung und in vitro-Expansion der iNKT Zellen aus der Milz der Maus. Genauer gesagt, das Protokoll beschreibt ein Verfahrenzur Anreicherung iNKT Zellen aus der Milz der Maus, die die Mäuse, Reagenzien und Zeit für FACS Zellsortierung erforderlich, reduziert, und schlägt vor, einen optimierten Ansatz für den Ausbau der sortierten Milz iNKT Zellen in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte in der aktuellen Protokoll gehören die Isolierung und anschließende Anreicherung von CD5 + Lymphozyten (Abschnitt 1 & 2), FACS-Sortierung (Abschnitt 3) und die anfängliche Plattierung iNKT Zellen (Abschnitt 4). Der Schritte in Abschnitt 1 durchgeführt wird, denken Sie daran, vorsichtig Schicht die Milz-Zellsuspension über das Dichtegradienten-Medium, so dass eine deutliche zelluläre Interphase wird nach der Zentrifugation generiert. Die anschließende Bereicherung für CD5 +<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.
Materials
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ – free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
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