マウスの脾臓から不変ナチュラルキラーT細胞を単離および拡張するための最適化方法
Summary
Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.
Abstract
急速に刺激によりサイトカインを分泌する能力は、インバリアントナチュラルキラーT（iNKT細胞）細胞系統の機能的な特徴です。 iNKT細胞は、したがって、免疫応答を活性化し、ステアリング適応可能な生来のT細胞集団として特徴づけられます。マウスiNKT細胞の培養および増殖のための改良された技術の開発は 、in vitro および in vivo モデル系でのiNKT細胞生物学の研究を容易にします。ここでは、マウスの脾臓iNKT細胞の単離および拡張のための最適化された手順を説明します。
C57BL / 6マウスから脾臓を取り出し、解剖し、緊張し、得られた細胞懸濁液を、密度勾配媒体を介して積層されています。遠心分離後、脾臓単核細胞（MNC）収集され、CD5陽性（CD5 +）リンパ球は、磁気ビーズを使用するために濃縮されます。 CD5 +画分内のiNKT細胞は、その後^で染色します5; GalCerを負荷されたCD1d四量体および蛍光活性化細胞選別（FACS）によって精製しました。 FACSは、組換えマウスサイトカインの組み合わせを用いてインビトロで、その後、最初に培養し、プレートに結合したT細胞受容体（TCR）の刺激を、マウス組換えIL-7の存在下で拡張される前に、iNKT細胞を選別しました。この技術を用いて、約10 8 iNKT細胞は、それらが、インビトロでの機能アッセイのために、または、マウスにおけるインビボ移入実験のために使用することができ、その後、培養の18-20日以内に発生することができます。
Introduction
ネズミ不変ナチュラルキラーT（iNKT細胞）細胞は、CD1dの発現皮質胸腺細胞1,2-によって胸腺内で選択された生来のTリンパ球の異なる集団です。 iNKT細胞は、Vβ8、Vβ7またはのCD1dの文脈における内因性ならびに外来脂質抗原を認識することができるVβ2TCRは3のいずれかと対に不変Vα14-Jα18TCR鎖からなるT細胞受容体（TCR）を発現します。例えば、マウスのiNKT細胞を認識し、内因性isoglobotrihexosylceramide（のiGb3）4と呼ばれる脂質抗原と同様に、αガラクトシルセラミド（αGalCerの）5,6、海綿から単離された糖脂質によって活性化されます。 iNKT細胞のTCR依存性活性化は、適応免疫応答のプライミングを促進し、その結果、iNKT細胞は、リウマチ性疾患7及び癌を含む病理の範囲の改善や開発に機能的関与することが示されています<SUP> 8。現在、合成のiNKT細胞リガンドは、免疫病理学的条件の数を調節することが可能である有望な新しいワクチンアジュバントを構成しています。
これは、以前にiNKT細胞しかしマウス組織から単離した後、in vitroで生成することができることが実証されています。これらの研究の多くは、Vα14TCRトランスジェニック（Tg）は、マウス10、またはのiNKT細胞由来のハイブリドーマ11,12を生成するための胸腺腫、主要な抗原提示細胞（APC）、及び/又は細胞株の使用9を用います 。さらに、マウスの多くは、αGalCerのロードされたCD1dダイマー、および長い培養時間などの試薬 の高いボリュームがいくつか公開されたプロトコル少ない倫理的および経済的に9,13をアピールしてください。
この報告では、単離のために、マウスの脾臓からiNKT細胞の体外拡大して適応する方法を説明します。より具体的には、プロトコルは、方法が記載されていますFACS細胞選別のために必要なマウス、試薬および時間を減少させ、in vitroで 、ソート脾臓iNKT細胞を拡大するために最適化されたアプローチを提案しているマウス脾臓からiNKT細胞を濃縮します。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在のプロトコルにおける重要なステップは、分離およびCD5 +リンパ球 （第1＆2）、（3節）とiNKT細胞の初期めっき（第4節）をFACSソーティングのその後の濃縮を含みます。第1節で実行されるステップの、慎重に異なる細胞間期を遠心分離後に生成されるような密度勾配媒体を介して脾臓細胞懸濁液をレイヤーすることを忘れないでください。磁気細胞分離（第2節）により、CD5 +?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.
Materials
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ – free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
- Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
- Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
- Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
- Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
- Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
- Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
- Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
- Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
- Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
- Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. . BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
- Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in ‘real time’. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
- Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).
