En optimalisert metode for å isolere og utvide Invariant Natural Killer T-celler fra mus Spleen
Summary
Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.
Abstract
Evnen til hurtig utskille cytokiner ved stimulering er en funksjonell egenskap ved invariant natural killer T (iNKT) celle avstamning. iNKT celler er derfor karakterisert som en medfødt T-cellepopulasjon stand til å aktivere og styring adaptive immunresponser. Utvikling av forbedrede teknikker for kulturen og utvidelse av murine iNKT celler muliggjør studium av iNKT cellebiologi i in vitro og in vivo-modellsystemer. Her beskriver vi en optimalisert fremgangsmåte for isolering og utvidelse av murine milt-iNKT celler.
Milter fra C57Bl / 6-mus er fjernet, dissekert og anstrengt og den resulterende cellesuspensjonen blir lagt over densitetsgradient media. Etter sentrifugering, er milt-mononukleære celler (MNC) oppsamlet og CD5-positive (CD5) + lymfocytter er anriket for ved hjelp av magnetiske kuler. iNKT celler i CD5 + fraksjonen blir deretter farget med ^5; GalCer belastede CD1d tetramer og renset ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS). FACS-sortert iNKT celler blir deretter dyrket in vitro i utgangspunktet ved anvendelse av en kombinasjon av rekombinante muse-cytokiner og plate-bundet T-cellereseptoren (TCR) stimuli før den blir ekspandert i nærvær av rekombinant murint IL-7. Ved hjelp av denne teknikken, ca 10 8 iNKT celler kan genereres i løpet av 18-20 dagers dyrking, hvoretter de kan benyttes til funksjonelle forsøk in vitro eller in vivo for overføring eksperimenter i mus.
Introduction
Muse invariant naturlig killer T (iNKT-celler) er en distinkt populasjon av medfødte T-lymfocytter valgt i thymus ved CD1d-uttrykke kortikale thymocyttene 1,2. iNKT celler uttrykker en T-celle-reseptor (TCR) utgjøres av en invariant Vα14-Jα18 TCR kjede forbundet med enten Vβ8, Vβ7 eller Vβ2 TCR 3, som er i stand til å gjenkjenne endogen samt fremmede antigener lipid i sammenheng med CD1d. For eksempel, murine iNKT celler gjenkjenner og blir aktivert ved en endogen lipid antigen kalt isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, samt α-galaktosylceramid (αGalCer) 5,6, et glykolipid isolert fra marine svamper. TCR-avhengig aktivering av iNKT celler fremmer grunning av adaptive immunresponser, og som et resultat har iNKT-celler blitt vist å være funksjonelt involvert i forbedring eller utvikling av en rekke patologiske tilstander, inkludert reumatisk sykdom og cancer 7 <sup> 8. For tiden, syntetiske iNKT celle ligander utgjør lovende nye vaksineadjuvanser som kan være i stand til å regulere en rekke immunpatologiske tilstander.
Det har tidligere blitt vist at iNKT celler kan genereres in vitro følgende isolert fra mus vev imidlertid; mange av disse studier anvender bruken av primær antigenpresenterende celler (APC) og / eller cellelinjer 9, Vα14 TCR transgene (Tg) -mus 10, eller thymomas for generering av iNKT-celle-hybridomer avledet 11,12. Videre store mengder mus, høye volumer av reagenser som αGalCer lastede CD1d dimerer og lange kultur ganger gjøre noen publiserte protokoller mindre etisk og økonomisk attraktivt 9,13.
I denne rapporten beskriver vi en tilpasset metode for isolering og in vitro ekspansjon av iNKT celler fra musemilt. Mer spesifikt beskriver den protokollen en fremgangsmåtefor anrikning iNKT celler fra musemilt som reduserer mus, reagenser og tid som kreves for FACS-cellesortering, og foreslår en optimalisert metode for ekspandering av sorterte iNKT miltceller in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trinn i den aktuelle protokollen omfatter isolering og påfølgende anriking av CD5 + lymfocytter (§ 1 & 2), FACS sortering (§ 3) og den første plating av iNKT-celler (§ 4). Av trinnene som utføres i punkt 1, må du huske å nøye lag miltcellesuspensjonen over densitetsgradient medium slik at en distinkt mobilinter genereres etter sentrifugering. Den påfølgende berikelse for CD5 + lymfocytter av magnetiske cellen separasjon (§ 2) minimerer reagenser og tid som kreves for å fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.
Materials
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ – free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
- Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
- Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
- Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
- Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
- Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
- Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
- Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
- Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
- Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
- Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. . BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
- Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in ‘real time’. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
- Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).
