हम बड़ा न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के ऑप्टिकल पता लगाने के लिए सेल आधारित न्यूरोट्रांसमीटर फ्लोरोसेंट इंजीनियर ने संवाददाताओं (CNiFERs) बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
सेल आधारित न्यूरोट्रांसमीटर फ्लोरोसेंट इंजीनियर ने संवाददाताओं (CNiFERs) neuroscientists ऑप्टिकली विवो में मस्तिष्क में न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई का पता लगाने के लिए एक नए उपकरण प्रदान करते हैं। एक विशिष्ट CNiFER एक मानव भ्रूण गुर्दे सेल कि स्थिरतापूर्वक एक विशिष्ट जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर, जो जी क्यू के लिए जोड़ों / 11 ग्राम प्रोटीन, और एक झल्लाहट आधारित सीए 2 -detector, तमिलनाडु-XXL व्यक्त से बनाई गई है। रिसेप्टर के सक्रियण संकेत झल्लाहट में वृद्धि हो जाती है। CNiFERs एनएम संवेदनशीलता और सेकंड के एक अस्थायी प्रतिक्रिया क्योंकि एक CNiFER क्लोन मूल निवासी रिसेप्टर एक विशेष न्यूरोट्रांसमीटर के लिए, जैसे, D2R डोपामाइन के लिए इस्तेमाल किया है। CNiFERs सीधे मस्तिष्क में प्रत्यारोपित कर रहे हैं, कम से कम एक सौ मीटर की एक स्थानिक संकल्प के साथ न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज भावना के लिए उन्हें सक्षम करने के लिए, उन्हें इन विवो में संचरण मात्रा को मापने के लिए आदर्श बना रही है। CNiFERs भी छठी में संभावित पार जेट के लिए अन्य दवाओं स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताVO। हमने हाल ही में GPCRs जी आई / ओ जी प्रोटीन के लिए है कि कुछ शामिल करने के लिए CNiFERs के परिवार का विस्तार किया। CNiFERs acetylcholine (आक), डोपामाइन (डीए) और norepinephrine (पूर्वोत्तर) का पता लगाने के लिए उपलब्ध हैं। यह देखते हुए कि किसी भी GPCR एक उपन्यास बनाने के लिए CNiFER इस्तेमाल किया जा सकता है और वहाँ लगभग मानव जीनोम में 800 GPCRs हैं कि, हम यहाँ सामान्य प्रक्रिया का वर्णन है, डिजाइन का एहसास है, और CNiFER के किसी भी प्रकार का परीक्षण करने के लिए।
पूरी तरह से समझने के लिए कैसे न्यूरॉन्स मस्तिष्क में संवाद, यह विवो में न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई को मापने के लिए एक विधि के लिए आवश्यक है। वहाँ विवो में न्यूरोट्रांसमीटर को मापने के लिए कई अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है। एक सामान्य तकनीक का इस्तेमाल microdialysis, जिसमें एक प्रवेशनी मस्तिष्क में डाला जाता है और मस्तिष्कमेरु द्रव की एक छोटी मात्रा एकत्र की है और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी और विद्युत का पता लगाने 1 का उपयोग कर विश्लेषण किया जाता है। MICRODIALYSIS जांच के कुछ ही व्यास के आदेश पर एक स्थानिक संकल्प किया है, जैसे, ~ एक 200 मीटर व्यास microprobe के लिए 0.5 मिमी। इस तकनीक का अस्थायी समाधान है, तथापि, अंतराल नमूना है कि आमतौर पर ~ पिछले 5 मिनट या उससे अधिक समय 1 के कारण धीमी है। इसके अलावा, विश्लेषण वास्तविक समय में नहीं बना रहे हैं। एक और तकनीक तेजी से स्कैनिंग चक्रीय voltammetry (FSCV), जो एक कार्बन फाइबर जांच है कि मस्तिष्क में डाला जाता है का उपयोग करता है। FSCV उत्कृष्ट अस्थायी हैमौखिक संकल्प (subsecond), उच्च संवेदनशीलता (nanomolar), और 30 माइक्रोन से 5 की जांच व्यास के साथ स्थानिक संकल्प। हालांकि, FSCV ट्रांसमीटरों कि एक कार्बन potentiometric जांच 2 पर एक विशेषता ऑक्सीकरण और वोल्टेज के साथ कमी प्रोफ़ाइल उत्पादन करने के लिए सीमित है।
न्यूरोट्रांसमीटर को मापने के लिए एक तीसरा तकनीक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग न्यूरोट्रांसमीटर (एनटी) biosensors 3 के माध्यम से सीधे है। इस विधि के साथ, एक संलयन प्रोटीन बनाई गई है एक ट्रांसमीटर एक प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) fluorophores 4 की आधारित जोड़ी या एक permutated GFP 5 के लिए युग्मित के लिए एक ligand बाध्यकारी डोमेन शामिल है। पिछले दो विधियों के विपरीत, इन biosensors आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग और ट्रांसजेनिक जानवरों के उत्पादन के माध्यम से या तीव्रता से वायरल एजेंटों के उपयोग कोशिकाओं को संक्रमित करने के साथ, इस तरह के एक न्यूरॉन के रूप में मेजबान कोशिका की सतह पर व्यक्त कर रहे हैं। तिथि करने के लिए, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग biosensors केवल detectin के लिए विकसित किया गया हैजी ग्लूटामेट और गाबा 3-5। इन तकनीकों के साथ सीमाओं एनएम रेंज में कम संवेदनशीलता, और ट्रांसमीटरों, जैसे, शास्त्रीय न्यूरोट्रांसमीटर, neuropeptides और neuromodulators, जो जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) के माध्यम से संकेत का पता लगाने के लिए बड़ी संख्या में विस्तार करने के लिए असमर्थता किया गया है। वास्तव में, वहाँ मानव जीनोम में लगभग 800 GPCRs हैं।
इन खामियों को संबोधित करने के लिए, हम किसी भी न्यूरोट्रांसमीटर है जो एक GPCR के माध्यम से संकेतों के ऑप्टिकली उपाय के रिलीज के लिए एक अभिनव उपकरण विकसित किया है। CNiFERs (सेल आधारित न्यूरोट्रांसमीटर फ्लोरोसेंट इंजीनियर ने संवाददाताओं से), एक विशिष्ट GPCR कि, जब उत्तेजित, intracellular में वृद्धि [सीए 2 +] कि एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग झल्लाहट आधारित सीए 2 संवेदक द्वारा पता चला है चलाता है व्यक्त करने के लिए इंजीनियर प्रतिरूप HEK293 कोशिकाओं रहे हैं तमिलनाडु XXL। इस प्रकार, CNiFERs न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर, प्रतिदीप्ति में एक परिवर्तन में बाध्यकारी एक सीधा और वास्तविक समय ऑप्टिकल आर उपलब्ध कराने बदलनास्थानीय न्यूरोट्रांसमीटर गतिविधि के EAD-out। एक दिया न्यूरोट्रांसमीटर के लिए देशी रिसेप्टर का उपयोग करके, CNiFERs रासायनिक विशिष्टता, आत्मीयता और endogenously व्यक्त रिसेप्टर्स के अस्थायी गतिशीलता बरकरार रहती है। तिथि करने के लिए, हम CNiFERs के तीन प्रकार, डोपामाइन का पता लगाने के लिए एम 1 रिसेप्टर, एक का उपयोग कर acetylcholine का पता लगाने के लिए एक बनाया है डी 2 रिसेप्टर का उपयोग कर, और α1a रिसेप्टर 6.7 का उपयोग कर norepinephrine का पता लगाने के लिए एक। CNiFER प्रौद्योगिकी यह GPCR के किसी भी प्रकार के लिए उत्तरदायी बनाने, आसानी से विस्तार योग्य और स्केलेबल है। इस जौव लेख में, हम का वर्णन है और किसी भी आवेदन के लिए, डिजाइन का एहसास करने के लिए पद्धति, और इन विवो CNiFERs में परीक्षण दर्शाते हैं।
CNiFERs के निर्माण के ऑप्टिकली विवो में मस्तिष्क में न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई को मापने के लिए एक अभिनव और अद्वितीय रणनीति प्रदान करता है। CNiFERs आदर्श extrasynaptic रिहाई, यानी, मात्रा चालन, न्यूरोट्रांसमीटर ?…
The authors have nothing to disclose.
हम इलेक्ट्रॉनिक्स के साथ सहायता के लिए जी qi5 और जी qs5 cDNAs, ए Schweitzer प्रदान करने के लिए बी Conklin (कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन फ्रांसिस्को) धन्यवाद, एन टेलर क्लोन, इयान Glaaser और रॉबर्ट रिफ़्कीन सबूत पढ़ने के लिए की स्क्रीनिंग के साथ सहायता के लिए और तमिलनाडु XXL के लिए ओलिवर Griesbeck। (; DA037170 DA029706), बायोमेडिकल इमेजिंग और बायोइन्जिनियरिंग के राष्ट्रीय संस्थान (NIBIB) (EB003832), हॉफमैन-ला रॉश (88610A) और 'न्यूरोसाइंस इस काम नशीली दवाओं के सेवन पर अमेरिका के नेशनल इंस्टीट्यूट (NIDA) के माध्यम से अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया NIDA (DA007315) के माध्यम से दुर्व्यवहार "प्रशिक्षण अनुदान की दवाओं से संबंधित।
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro | System Biosciences | CD510B-1 | Cloning: for generating lentivirus |
12×75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube | BD Biosciences | 352063 | FACS |
BD 40 um Falcon cell strainers | BD Biosciences | 352340 | FACS |
0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200056 | FACS |
96 Well Plate, flat bottom, clear | Corning | 3596 | FACS |
96 well cell culture plates | Corning | CLS3997 | Flexstation |
Optilux black clear bottom | Corning | 3603 | Flexstation |
Flexstation pipet tips | Molecular Devices | 9000-0911 | Flexstation |
Acetylcholine Chloride | SimgaAldrich | A2661 | Flexstation |
Norepinephrine | SimgaAldrich | A7256 | Flexstation |
Dopamine Hydrochloride | SimgaAldrich | PHR1090 | Flexstation |
GABA | SimgaAldrich | A2129 | Flexstation |
Histamine | SimgaAldrich | H7125 | Flexstation |
Glutamate | SimgaAldrich | 49621 | Flexstation |
Epinephrine | SimgaAldrich | E4642 | Flexstation |
Somatostatin | SimgaAldrich | S1763 | Flexstation |
5HT | SimgaAldrich | H9523 | Flexstation |
VIP | Alpha Diagnostics Inc. | SP-69627 | Flexstation |
Orexin A | Alpha Diagnostics Inc. | 12-p-01 | Flexstation |
Substance P | SimgaAldrich | S6883 | Flexstation |
Adenosine | SimgaAldrich | A4036 | Flexstation |
Melatonin | SimgaAldrich | M5250C | Flexstation |
Fluorescence Plate Reader & software | Molecular Devices | Flexstation 3 | Flexstation |
DMEM (high glucose) with Glutamax | Life Technologies | 10569-010 | Tissue culture |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-139 | Tissue culture |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Tissue culture |
Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | Tissue culture |
Fibronectin | SimgaAldrich | F0895 | Tissue culture |
CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box | Bioexpress | D-3508) | Tissue culture |
cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite no. 495 | surgery and stereotaxic injection |
plastic paraffin film | VWR | Parafilm® | surgery and stereotaxic injection |
NANOINJECTOR | Drummond | 3-000-204 | surgery and stereotaxic injection |
GLASS ELECTRODES | Drummond | 3-000-203G | surgery and stereotaxic injection |
hand held drill | OSADA | Exl-M40 | surgery and stereotaxic injection |
Burrs for drill | Fine Scientific | 19007-05; 19007-07) | surgery and stereotaxic injection |
Sterilizing bath | FST | 18000-45, Hot Bead Sterilizer | surgery and stereotaxic injection |
isoflurane chamber/mask | Highland Medical Equipment | 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm | surgery and stereotaxic injection |
3D scope with arm | Zeiss | surgery and stereotaxic injection | |
fiber optic light | surgery and stereotaxic injection | ||
Betadine | surgery and stereotaxic injection | ||
70 % (v/v) isopropyl alcohol | surgery and stereotaxic injection | ||
Povidone-Iodine Prep Pads | dynarex | 1108 | surgery and stereotaxic injection |
NaCl 0.9% (INJECTION, USP, 918610) | surgery and stereotaxic injection | ||
CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) | surgery and stereotaxic injection | ||
Buprenex (INJECTION) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) | Sigma | surgery and stereotaxic injection | |
Ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | surgery and stereotaxic injection |
Surgifoam | Ethicon | surgery and stereotaxic injection | |
Grip dental cement | Dentsply | #675571, 675572 | surgery and stereotaxic injection |
Instant SuperGlue | NDindustries | surgery and stereotaxic injection | |
LOCTITE 4041 | surgery and stereotaxic injection | ||
METABOND | C&B | surgery and stereotaxic injection | |
no. 0 cover glass | Fisher | surgery and stereotaxic injection | |
stereotaxic frame | Kopf | surgery and stereotaxic injection | |
Rectal probe and heating pad | FHC | 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe | surgery and stereotaxic injection |
optical breadboard for imaging | Thorlabs | surgery and stereotaxic injection | |
Mineral oil | Fisher | S55667 | surgery and stereotaxic injection |
Kwik-Cast (Silicone elastomer) | World Precision Instruments | surgery and stereotaxic injection | |
Suture | Ethicon | 18’’, 1667, 4-0 | surgery and stereotaxic injection |
Scissors | Fine Scientific Tools | 91500-09, 15018-10 | surgery and stereotaxic injection |
Forcepts | Fine Scientific Tools | 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 | surgery and stereotaxic injection |
Student Halsted-Mosquito Hemostats | Fine Scientific Tools | 91308-12 | surgery and stereotaxic injection |
Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Scientific Tools | 18000-00 | surgery and stereotaxic injection |
Hot Bead Sterilizers | Fine Scientific Tools | 18000-45 | surgery and stereotaxic injection |
Instrument Case with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20311-21 | surgery and stereotaxic injection |
Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20810-01 | surgery and stereotaxic injection |
2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging | Olympus | FV1200 MPE | in vivo imaging |
Multiphoton laser | SpectraPhysics | Mai Tai DeepSee | in vivo imaging |
Green Laser | Olympus | 473 nm Laser | in vivo imaging |
xy translation base | Scientifica | MMBP | in vivo imaging |
FRET filter cube for YFP and CFP | Olympus | in vivo imaging | |
25-X water immersion objective | Olympus | in vivo imaging | |
air table | Newport | in vivo imaging | |
custom built light-tight cage | Thorlab | in vivo imaging |