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Neuroscience

건설 셀 기반의 신경 전달 물질의 광학 검출을위한 신경 전달 물질 형광 엔지니어링 기자 (CNiFERs) doi: 10.3791/53290 Published: May 12, 2016

Summary

우리는 체적 신경 전달 물질 방출의 광학 검출을위한 셀 기반의 신경 전달 물질의 형광 설계 기자 (CNiFERs)를 만들 수있는 프로토콜을 제시한다.

Abstract

세포 기반 신경 전달 형광 설계 기자 (CNiFERs)는 신경 과학자 광학적 생체의 뇌에서 신경 전달 물질의 방출을 검출하기위한 새로운 수단을 제공한다. 특정 CNiFER 안정적 특정 G 단백질 결합 수용체, G의 Q에 커플 / 11 G 단백질 및 FRET 기반 칼슘) 검출기 (, TN-XXL를 표현하는 인간 배아 신장 세포에서 생성됩니다. 수용체의 활성화는 FRET 신호의 증가를 이끈다. CNiFER 클론은 도파민에 대한 D2R, 예를 들어, 특정 신경 전달 물질의 고유 수용체를 이용하기 때문에 CNiFERs는 nM의 감도와 초 시간 응답이 있습니다. CNiFERs 직접 뇌에 이식 생체 내에서 볼륨 전송을 측정하기에 이상적 미만 백 ㎛의 공간 해상도와 신경 전달 물질 방출을 감지 할 수 있도록하고 있습니다. CNiFERs 또한 VI 잠재적 교차 - 반응성에 대한 다른 약물을 스크리닝하는데 사용될 수있다VO. 우리는 최근의 GPCR에게 G I / O G 단백질에 그 부부를 포함 CNiFERs의 제품군을 확장했다. CNiFERs은 아세틸 콜린 (ACH), 도파민 (DA)과 노르 에피네프린 (NE)를 검출 할 수 있습니다. 어떤 GPCR이 CNiFER 소설을 생성하는데 사용될 수 있음을 감안할 때 대략 인간 게놈 800 GPCRs에 있다는 것을 우리는 설계, 실현 및 CNiFER 임의의 타입을 테스트하기 위해 여기 일반적인 방법을 설명한다.

Introduction

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완전히 신경 뇌에서 통신하는 방법을 이해하기 위해, 생체 내에서 신경 전달 물질의 방출을 측정하는 방법을 갖는 것이 필요하다. 생체 내에서 신경 전달 물질을 측정하기위한 몇 가지 잘 확립 된 기술이있다. 하나의 일반적으로 사용되는 기술은 캐뉼라 뇌에 삽입 뇌척수액 소량의 수집 및 고성능 액체 크로마토 그래피 및 전기 검사 1을 사용하여 분석되는 미세 투석이다. 미세 투석 프로브 몇 직경 정도의 공간 분해능을 가지며, 예를 들어 ~ 200 μm의 마이크로 프로브 직경 0.5 mm. 이 기법의 시간 해상도는, 그러나, 일반적으로 ~ 5 분 1 이상을 지속 샘플링 간격으로 느립니다. 또한, 분석은 실시간으로 제작되지 않습니다. 다른 기술은 뇌에 삽입되는 탄소 섬유 프로브를 사용하여 고속 스캐닝 순환 전압 전류 법 (FSCV)이다. FSCV 우수한 온도가구강 해상도 (초 단위), 고감도 (나노 몰), 30 μm의 5의 프로브 직경 공간 해상도. 그러나 FSCV는 탄소 전위차 프로브 (2)에 전압 특성 산화 및 환원 프로파일을 생성 송신기들로 제한된다.

신경 전달 물질을 측정하는 세 번째 기술은 유 전적으로 인코딩 된 신경 전달 물질 (NT) 바이오 센서 (3)를 통해 직접입니다. 이 방법으로 융합 단백질은 형광 공명 에너지 전달 (FRET) - 기반 형광체 (4)의 쌍 또는 순열 GFP (5)에 결합 된 송신기에 대한 리간드 결합 도메인을 포함하는 생성된다. 앞의 두 방법과 달리,이 바이오 센서는 전적으로 인코딩 된 형질 전환 동물의 생산을 통해 또는 급성 세포 감염 바이러스 제제의 사용과 같은 신경 세포와 같은 숙주 세포의 표면에 발현. 현재까지 유전자 부호화 바이오 센서 만 detectin 개발되어왔다g 글루타메이트와 GABA 3-5. 이러한 기술에 대한 제한은 nM의 범위에서 낮은 감도 및 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)를 통해 신호를 예를 들어 송신기, 고전 신경 전달 물질, 신경 펩티드 및 신경 조절의 다수 검출 확대 없게되었다. 실제로, 인간 게놈에서 거의 800 GPCRs에있다.

이러한 부족을 해결하기 위해, 우리는 GPCR을 통해 신호를 어떤 신경 전달 물질의 광학적 측정 자료에 혁신적인 도구를 개발했습니다. CNiFERs (셀 기반의 신경 전달 물질의 형광 설계 기자)가 자극하면 [Ca를 2+ 즉이 유전자 부호화 FRET 계 칼슘 센서에 의해 검출되어, 세포 내에서의 증가를 유발 특정 GPCR을 발현하도록 유전자 클론 HEK293 세포이다 TN-XXL. 따라서 CNiFERs은 신경 전달 물질 수용체, 형광의 변화에​​ 직접 결합 실시간 광 (R)을 제공하는 변환지역의 신경 전달 물질 활동의 EAD 아웃. 특정 신경 전달 물질에 대한 고유 수용체를 이용하여, CNiFERs 화학 특이성, 친 화성 및 내생 발현 수용체의 시간적 동성을 보유한다. 지금까지, 우리는 CNiFERs 세 가지 유형, 도파민을 검출하는 M1 수용체를 이용하여 아세틸 콜린의 검출을 작성한 D2 수용체를 사용하고 α1a 수용체 6,7을 사용하여 노르 에피네프린을 검출하기위한 하나. CNiFER 기술은 GPCR의 유형은 의무가있어 쉽게 확장과 확장 성이다. 이 조브 기사에서, 우리는 설명하고 모든 응용 프로그램에 대한 생체 CNiFERs의 설계, 실현 방법, 테스트를 보여줍니다.

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Protocol

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본 연구에서 수행되는 모든 동물의 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 지침에 따라, 그리고 시내산에서 의학의 아이칸 학교와 캘리포니아 대학 샌디에고에서 IACUCs에 의해 승인되었습니다.

1. HEK293 세포 변형에 대한의 Lentivirus를 GPCR이 발현 생성

  1. 상용 소스, 예를 들어, cdna.org에서 특정 GPCR에 대한 cDNA를 가져옵니다. 다르게는, PCR을 이용하여 cDNA 라이브러리로부터 GPCR 유전자를 증폭한다. 이러한 pCDH-CMV-MCS-EF1-순수하지 않아 (pCDH) 등의 렌티 바이러스 발현 벡터를 얻습니다. DNA를 전파 할뿐만 아니라, 렌티 바이러스를 생성하기 위해이 벡터를 사용한다.
  2. PCR에 의한 렌티 바이러스 발현 벡터로 GPCR의 cDNA 클론. PCR의 서브 클로닝에 대한 자세한 내용은, 로렌스 (8)을 참조하십시오.
  3. 확장하고 제조업체의 지침에 따라 같은 독소가없는 '맥시'준비 키트를 사용하여 GPCR-pCDH DNA를 정화. pCDH이 mutation- 인으로 GPCR cDNA를 클로닝 확인DNA 염기 서열에 의해 무료.
    주 : 앞서 바이러스 생산을위한 DNA를 제출에 넣고 DNA의 순도의 크기를 확인하는 적절한 제한 효소로 소화 분취.
  4. 바이러스 코어 시설 솔크 연구소의 펜. 대학, 또는 노스 캐롤라이나 대학에서 같은 하나를 사용하여 렌티 바이러스를 생성, 또는 사내에서 9 생성합니다. T75 플라스크에 HEK 세포의 형질 전환을위한 내 독소없는 DNA의 약 25 μg의 (> 1 μg의 / μL)를 사용합니다. 1.8 ~의 흡광도 비율 (A 260 / A 280)를 갖는 DNA가 높은 순도를 확인하십시오.
    주 : / ㎖ 10 11 -10 12 GC는 HEK293 세포의 형질 도입을위한 최적 ~ 바이러스의 역가.

2. 체외에서 배양을 위해 HEK293 / TN-XXL 백본 세포 유형 선택

G는 I / O와 같은 G의 Q / (11), 또는 GPCR의 G의 G 단백질이 DIC, 예를 들어, G 단백질 결합 특이성을 결정 참고 :G 단백질 키메라가 CNiFER 필요 여부 tates. 예를 들어 G q를 -coupled 수용체, M1 무스 카린 수용체를 들어, HEK293 / TN-XXL 백본 HEK293 세포 유형으로 (# 3g8)을 선택합니다. G I / O -coupled 수용체를 들어, 키메라 G 단백질 G의 qi5 10를 필요합니다. G의 -coupled 수용체를 들어, G의 QS5 키메라는 10이 필요하다. 이 프로토콜에서, D2R CNiFER의 구조는 일 예로서 사용된다. I / O G 단백질과 G를 통해 D2R 신호를 안정적으로 키메라 G 단백질, G의 qi5, 예를 들어, HEK293 / TN-XXL / G의 qi5이 _ # qi5.6을 표현 HEK293 세포를 필요로한다.

  1. 연구 실험실에서 HEK293 / TN-XXL / G의 qi5 _ # qi5.6 클론 세포를 얻습니다. 참고 : 클론 세포를 다음, HEK293 / TN-XXL G q를 -coupled 수용체 (# 3g8), HEK293 / TN-XXL / G의 qi5 (# qi5.6) G에 대한 I / O -coupled 수용체 및 HEK293 / TN -XXL / G QS5 (# qs5.47) G의 -coupled 재에 대한수용체를 요청 6,7에 따라 자유롭게 사용할 수 있습니다.
  2. 성장 및 HEK293 성장 미디어 (표 1) 5 ㎖와 T25 플라스크에 ~ qi5.6에 _ # 90 % 포화 상태 HEK293 / TN-XXL / G의 qi5를 확장합니다. 5 % (v / v)의 CO 2, 37 ℃에서 가습 배양기에서 세포를 성장한다.
    주 : HEK293 세포를 배양하는 모든 작업은 표준 멸균 조직 배양 기술을 이용하여 수행되어야한다.
  3. 첫 번째 T25 플라스크에서 미디어를 흡입하여 HEK293 세포를 수확. 부드럽게 PBS 5 ㎖를 추가하고 플라스크를 흔들어 세포를 씻으십시오.
  4. PBS를을 제거하고 0.05 % (w / v)의 트립신 / EDTA (표 2) 1 ㎖를 추가합니다. 5 % (v / v)의 CO 2, 37 ℃에서 1 분 내지 2 부화.
  5. 세포를 수집하고 15 ML 원뿔 튜브를 멸균하기 위해 전송합니다. 세포 배양 원심 분리기 1000 XG에서 5 분 동안 원심 분리기. 뜨는을 대기음.
  6. HEK293 성장 배지 5 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. 사용한 혈구 세포의 개수트리 판 블루. 셀 밀도를 계산하고 3 단계로 진행합니다.

3. HEK293의 렌티 바이러스 형질 도입 / TN-XXL / Gqi5 세포

  1. 0.7 × 10 6 HEK293 / TN-XXL / G의 qi5 세포와 T25 플라스크을 시드. 후 약 1 일, 50 % 컨 플루 언트 될 때까지 ~ ​​5 % (v / v)의 CO 2, 37 ℃에서 가습 배양기에서 세포를 성장한다. 남아있는 세포를 동결 (8.2-8.3 단계). 이 세포는 GPCR이 부족 CNiFER 제어하는 CNiFER 될 것입니다.
  2. 감염 당일 HEK293 성장 배지 (표 1) 2 ㎖ 총 부피 109 GC / ㎖ ~ 최종 농도로 GPCR 발현 렌티 바이러스 (단계 1.4)을 희석. 예를 들어, T25 플라스크에 2ml의 매체에 10 11 GC / ml의 바이러스의 20 μL를 추가한다.
    주 : 바이러스 역가 정보 바이러스 핵심 기능이 제공되어야한다. 원심 분리기 튜브에 렌티 바이러스와 미디어를 결합하고 부드럽게 씹다. lentiv의 높은 역가irus는 바이오 안전성 레벨 2 (BSL-2)입니다.
  3. T25 플라스크에서 미디어를 대기음. 단계 3.2에서 바이러스 / 미디어 혼합물의 2 ML을 추가합니다. 5 % (v / v)의 CO 2와 37 ° C에서 T25 플라스크 O / N을 품어.
  4. 감염 1 일 후, 바이러스 / 미디어 혼합물을 대기음 및 HEK293 성장 미디어를 포함 퓨로 마이신로 교체 (2 μg의 / ㎖ 표 1). 퓨로 마이신은 형질 세포에 대한 선택합니다. ~ 1~2일 후, 약 90 % 컨 플루 언트 될 때까지 5 % (V / V) CO 2, 37 ℃에서 플라스크를 인큐베이션.
  5. 단계 4.1에서 10 점 작용제 / 활성 곡선을 생성하기위한, 피브로넥틴으로 피복 된 96 웰 플레이트 (투명 바닥 검정색)을 준비한다. 멸균 후드에서 96 웰 플레이트의 행 A와 B에서 잘 당 50 μL의 피브로넥틴 (5 μg의 / ㎖)를 추가합니다. 1 시간 동안 실온에서 접시를 품어. PBS와 린스 당 5 분 동안 두 번 씻어. HEK293 성장 배지의 50 μl를 첨가하고, 5 % (V / V) CO 2, 37 ℃에서 O / N을 배양한다.
    참고 : Fibron을ectin 처리 된 판은 시판되고있다.
  6. 단계 2.3-2.6 (표 2)에 설명 된대로 T25 플라스크에 세포를 수확.
  7. HEK293 성장 배지 5 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. FACS 분석을위한 세포의 1.5 ml의와 T25 플라스크을 시드. 또한, 냉동 및 저장을 위해 세포를 1 ㎖와 T75 플라스크을 시드 (단계를 참조 8.2-8.3)
  8. 10 포인트 곡선 작용제를 들어, 웰 당 세포 현탁액 100 ㎕와 함께 (단계 3.5) 피브로넥틴 - 코팅 된 96- 웰 플레이트의 처음 두 행 (A 및 B)을 시드.
  9. ~ 1-2일 후, 5 % (V / V) CO 2, 37 ℃ ~ 약 90 % 컨 플루 언트 될 때까지 HEK293 A를 T25 플라스크하는 T75 플라스크에서 성장하는 세포를 96 웰 플레이트를 인큐베이션.

4. FACS 및 단일 CNiFER 클론의 분리

  1. 10 점 작용제 활성 곡선을 생성하는 96 웰 플레이트를 사용한다.
    주 : (FACS) 분석을 형광 활성 세포 분류를 시작하기 전에,이 확인하는 것이 중요작용제 응답 (10 점 작용제 곡선)에 대한 형질 세포 검사에 의한 GPCR의 발현. 이 시험은 형광 플레이트 판독기를 사용하여 수행된다.
    1. 10 점 작용제 활성화 곡선 약물 플레이트를 준비합니다. 문헌에서 결정될 수있다 EC (50) 예측 브래킷 (10) 다른 작용제 농도를 선택합니다.
      참고 : CNiFER 판 3 희석 약물 판은 1 조정 (중복)에 각 농도의 3 배를 포함합니다. 예를 들어, D2 CNiFER를 테스트하기위한 약물 플레이트는 3 배의 농도에서 도파민 (10) 서로 다른 농도를 포함 0.2, 0.5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 50, 및 1000 nM의. CNiFER 판에 따라서 도파민의 최종 농도는 0.067, 0.167, 0.333, 1.00, 1.67, 3.33, 6.67, 10.0, 16.7, 333 nm의 수 있습니다.
    2. 인공 뇌척수액 (ACSF) (표 1)을 사용하여 효능 제 용액을 준비한다. 'ACSF', 예를 들어, A1 및 A2 두 개의 우물을 사용하여,와 '더 셀', 예를 들어, B1 및 B2 두 우물.
      주 : 일련의 희석 방법을 사용하여 약물의 상이한 농도를 준비한다. CNiFER 클론 및 약물 농도 (그림 3)을 추적하는 템플릿을 만듭니다.
    3. FRET 측정 및 솔루션 전송을 수행하기위한 96 웰 형광 플레이트 리더 프로그램 소프트웨어를 사용합니다.
      1. 37 ° C에 플레이트 리더 온도를 설정합니다.
      2. TN-XXL과 FRET을 측정, 436 ± 4.5 nm의 (중앙 ± HWHM)로 여기 파장을 설정합니다. eCFP과 황수정에 대한 527 ± 7.5 nm의 485 ± 7.5 nm의 방출 필터를 설정합니다. 각각 eCFP과 황수정의 컷오프 (475)에 필터와 515 nm의를 설정합니다.
      3. 485 nm 내지 527 nm의 180 초의 총 매 4 초에서 방출을 측정하는 플레이트 판독기 프로그램. 30 초를 수집 한 후, CNiFER 접시에 100 μL에 3 배 약물 플레이트에서 50 μl를 제공 할 수있는 옵션을 선택합니다베이스 라인 형광.
    4. 행 A와 B에서 미디어를 대기음하고있는 96 웰 CNiFER 플레이트 ~ 90 %의 합류 (단계 3.9)에 ACSF의 100 μl를 추가합니다.
    5. 96 웰 CNiFER 플레이트와 플레이트 리더로 ​​'3 배'약물 플레이트를 넣습니다. 37 ° C에서 접시를 평형 ~ 30 분을 허용합니다. 그리고, 프로그램을 시작한다.
    6. , 플레이트 리더 데이터를 분석 스프레드 시트에 형광 값을 보냅니다. CNiFERs와 우물에서 (세포없이 우물에서 각각의 신호에 대해 수행) 배경 측정을 뺄 수식을 만듭니다. 형광 강도가베이스 라인-자극 사전 정상화, F 황수정 (t)는 / F 황수정 (베이스 라인) 및 FRET 비율 (ΔR / R.,는 식 1)을 계산 피크 응답 527 nm 내지 485 nm의 배출에서를 사용하여 (단계 11 참조 ).
      참고 작용제와 ΔR / R에 큰 변화가있을 경우,이 GPCR의 발현을 나타내는 하나의 FACS 분석 (단계 4.2)로 진행할 수있다. 일 경우감수는 칼슘 2 + 반응을 테스트하고 그 FRET 기반 센서가 작동 확인, 예를 들어, A21387을 칼슘 이온 운반체를 사용하여 문제를 해결, 작용제와 더 FRET 응답하지 않습니다. 이온 운반체가 작동하는 경우, 수용체 가능성이 발현되지 않았다.
  2. FACS 하루전, 피브로넥틴으로 코팅 된 네 개의 96- 웰 플레이트를 준비 정렬 된 세포를 수집한다 (단계 3.5 참조). HEK293 성장 배지의 50 μl를 첨가하고, 5 % (V / V) CO 2, 37 ℃에서 O / N을 배양한다.
  3. 5 % 준비 (/ w를 V) BSA PBS (5 ㎍ / 100 mL) 및 멸균 병에 필터 (0.2 μm의).
  4. T25 플라스크에 성장 세포 (참조 단계 2.3-2.5, 표 2)를 수확. 5 %의 PBS (w / v)의 BSA 4 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. 5 분 동안 1,000 XG에서 세포를 원심 분리기.
  5. (/ V W) PBS에서 BSA가 ~ 5 × 106 세포 / ml의 최종 농도를 제공하는 매체를 흡인하고, 5 % ~ 5 ㎖의 세포 펠렛을 재현 탁.
    참고 : FA 확인세포 밀도 및 정렬 조건에 대한 특정 요구 사항에 대한 CS의 핵심 시설.
  6. 대단히 짧은 시간을 제거하기 위해 40 μm의 셀 스트레이너로 재현 탁 세포를 필터링합니다. 바닥 튜브 라운드 5 ml의 폴리 프로필렌에 세포를 전송합니다. FACS 시설에 전송을 위해 얼음에 튜브를 놓습니다.
  7. FACS 시설에서 형질 도입 된 HEK293 세포를 정렬한다. FACS에 매개 변수가 사이토 다음과 같이 흐름 프로그램 : 샘플 홀더, 노즐, 20 PSI 100 μm의 4 ° C를 설정합니다. 사전 정렬 분석을 바탕으로, 선택 세포, 즉, 큰 eCFP 형광 (eCFP 여기, eCFP 방출) 및 대형 FRET (eCFP 여기, 황수정 방출) 형광을 가지고 '게이트'(아래 결과, 그림 2 참조를 선택 ).
  8. 입금 개별 잘 HEK293 퓨로 마이신과 함께 성장 배지의 50 μl를 함유 한 클론 당으로, 단계 4.2에서 제조 된 96- 웰 플레이트로 정렬 셀. (퓨로 마이신에 따을 HEK293 성장 미디어의 50 μl를 추가상상력 1) 잘 당 100 μL의 총. 5 % (v / v)의 CO 2와 37 ° C에서 세포 O / N을 유지한다.
    참고 : HEK293 성장 미디어 형질 세포의 선택 퓨로 마이신이 포함되어 있습니다.

5. 배양 및 정렬 된의 확장, 클론 CNiFERs

  1. 각 웰에서 이전 미디어의 50 μL를 제거하고 신선한 HEK293 성장 배지 50 ㎕를 함유하는 퓨로 마이신 (표 1)로 교체하여 96 웰 플레이트에서 CNiFERs을 유지한다. 2-3주 후, 90 %의 합류 ~ 때까지이마다 5 ~ 7 일을 반복합니다.
  2. 부드럽게 용지를 흡입하고 PBS로 한번 부드럽게 세척하여 수확 CNiFER 세포. PBS를를 제거하고 트립신 / EDTA (/ V 승) 0.05 %의 20 μl를 추가합니다. 5 % (v / v)의 CO 2, 37 ℃에서 1 분 내지 2 부화.
  3. 트립신 처리 된 세포에 HEK293 성장 미디어 100 μl를 추가하고 세포를 재현 탁. 400 ㎕의 신선한 HEK293 성장 미디어 재치를 포함하는 24 웰 플레이트에 내용을 전송시간 퓨로 마이신. 24 웰 플레이트에 각 웰 5-7일 90 % 합류 ~까지 HEK293 성장 배지 250 μl를 대체하여 세포를 유지한다.

6. 형광 측정 플레이트 리더를 사용하여 FRET 응답을 바탕으로 후보 CNiFERs를 확인

참고 : 원래 클론의 많은 성장을 실패 이후 네 96 웰 플레이트 FACS를 다음으로> 생존과 24 웰 플레이트 단계로 확장 100 검증 가능한 클론이 있어야합니다. 잠재적 인 후보 CNiFERs를 확인하려면, 동족 작용제, 예를 들어, D2R에 대한 도파민과 FRET 응답을 3 점 분석을 사용합니다.

  1. 세포가 ~ 24 웰 플레이트에서 90 %의 합류 때, 부드럽게 미디어를 대기음. 0.05 %의 ~ 100 μl를 추가 (W / V) 트립신 / EDTA 5 % (v / v)의 CO 2와 37 ° C에서 1 ~ 2 분 동안 품어. 트립신 처리 된 세포에 HEK293 성장 미디어 400 μl를 추가하고 부드러운 분쇄하여 세포를 섞는다.
  2. CLO의 초기 스크리닝을위한 3 점 작용제 곡선 설정NES. 각 CNiFER 클론의 경우, 세 개의 웰을, 예를 들면, A1, A2, A3의 각각에 세포 현탁액 100 ㎕ (~ 4 × 103 세포 / 웰)를 24- 웰 플레이트, 분취 량의 웰 중 한 피브로넥틴 코팅 된 96 웰 플레이트 (일반 바닥 블랙) (단계 3.5 참조).
  3. HEK293 성장 매체의 1000 μL (1.2 ㎖의 최종 부피)를 함유하는 12 웰 플레이트에 세포 현탁액의 나머지 ~ 200 μl를 옮긴다. 90 % 합류 ~까지 5 % (V / V) CO 2, 37 ℃에서 두 플레이트를 인큐베이션. 96- 웰 플레이트는 형광 분석을위한 것이고 12- 웰 플레이트 성장과 복제를 확장하기위한 것이다.
  4. 3 점 분석을 위해, 0.1, 1.0-있는 작용제의 세 가지 농도 및 특정 GPCR에 대한 10 배의 EC (50)을 결정한다. 단계 4.1.1-4.1.2에 기재된 약물 플레이트 작용제 농도를 준비한다. 4.1.3-4.1.5 단계에서 설명한 바와 같이 형광 플레이트 판독기 분석법을 수행한다.
  5. FR 계산단계 4.1.6에 설명 된대로 ET 비율 (ΔR / R). 다시 동결 적절한 감도 및 확장을 위해 가장 FRET 응답이 CNiFERs을 선택하고보다 포괄적 인 분석 (7 단계).
  6. 단계 6.5에서 선택하고, 12 웰 플레이트에서 성장하는 클론의 경우, 제거하고 HEK293 성장 미디어 매 5 ~ 7 일의 600 μl를 교체 %의 합류 90 ~까지.
  7. 점차적으로 6 웰 플레이트에 12 웰 플레이트에서 클론을 확장 한 다음 T25 플라스크에 (2.3 단계 - 2.6 및 표 2). 설명 된대로 T25 플라스크 ~ 90 %의 합류, 수확 세포 인 경우 (2.3-2.5 단계). HEK293 성장 배지 5 ml의 세포 펠렛을 재현 탁.
  8. HEK293 성장 배지 9 ml를 가진 T75 플라스크에 세포 현탁액 1 ㎖를 추가한다. 액체 N 2 (8.2-8.3 단계)에 cryoprotection 및 저장에 대한 세포 현탁액의 나머지 4 ml를 사용합니다. 팔 1.5 ML의 cryotubes를 준비하고 얼음에 배치합니다.
  9. T75 플라스크에서, 미디어 w 대체하여 세포를 유지i 번째 신선한 HEK293 성장 미디어, 예를 들어 70 ~ 80 %의 합류 때까지 10 ml의 모든 3~5일, 후 ~ 1~2주.

형광 측정 플레이트 리더를 사용하여 CNiFER 클론 7. 최종 선택

  1. 플레이트 리더 분석 전날 :
    1. ~ 90 % 합류 T75 플라스크에서 수확 세포 (표 2 단계 2.3-2.6 참조). 잘 세포 현탁액의 ~ 100 μL와 5 × 10 4 /에서 96 웰 피브로넥틴 코팅 된 플레이트 (일반 바닥과 검은 색) 시드. 참고 : 하나의 복제는 하나의 96 웰 플레이트에 배포됩니다.
  2. 비 특정 CNiFER 응답에서 특정 효능 반응을 구별 CNiFER 클론의 종합 심사를위한 약물 플레이트를 준비합니다.
    1. 전체 용량 - 반응 곡선을 생성하기 위해 상기 예측 된 EC (50)의 주위에 10 개의 작용제의 농도를 선택한다. '더 셀'과 'ACSF'에 대한 두 우물 두 개의 우물을 사용합니다.
    2. 비특이적 반응을 결정하기 위해, 선택 THR12 가지 신경 전달 물질 또는 변조기 (72 웰) (그림 3)의 전자 농도. 아고 니스트처럼, 약물 판 중복의 3 배 농도가 포함되어 있습니다. 예를 들면, 100 (50)의 3 배의 농도 1,000 아세틸 글루타메이트, 오렉신, VIP, 아데노신, 세로토닌, 노르 에피네프린, GABA, 물질 P, 멜라토닌, 소마토스타틴 및 히스타민, 각각 세 가지 농도 μL 및 3000 nM의 96 웰 약물 플레이트에로드됩니다.
  3. 단계 4.1.3-4.1.5에 설명 된대로 솔루션 전송을 FRET을 측정하고 수행하는 형광 플레이트 리더의 매개 변수를 설정합니다.
  4. 전체 투여 량 반응 곡선을 분석 피크 FRET 비율 (ΔR / R) (단계 4.1.6), 로그 작용제 농도의 함수로서 플롯을 계산하고 힐 방정식 (단계 11.4)을 장착한다. EC의 50, 힐 계수 및 최대 FRET 비율을 결정합니다. 함수 오와 12 다른 신경 전달 물질 / 변조기, 플롯 피크 ΔR / R의 경우F 약물 농도.
  5. 다른 신경 전달 물질 작용제 (비 특정 응답)에 큰 FRET 비율은 동족 효능에 대한 적절한 EC (50)와 거의 또는 전혀 배경 응답이 10 ~ CNiFER 클론을 선택합니다.

8. 동결 다시 선택 CNiFER 클론

  1. 개인 CNiFER 클론의 ~ 90 % 합류 T75 플라스크를 사용합니다. 설명 된대로 수확 세포 (2.3-2.5 단계, 표 2). 세포를 냉동, HEK293 성장 배지 5 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. 열 1.5 ML의 cryotubes 레이블과 얼음에 설정합니다.
  2. 예를 들면, 20 %의 5 ml의 (V는 / v)의 DMSO / 미디어 혼합물을 부드럽게 세포 현탁액을 5 ㎖ (최종 혼합 20 % HEK293 성장 매체 (v / v)의 DMSO로 1 : cryoprotection 들어, 셀 1 믹스 DMSO 농도)는 10 %이다.
  3. cryotubes의 각으로 나누어지는 1 ml의. (자료 참조) 거품 절연 상자, -80 ° C의 냉동고 O / N 세포와 튜브를 고정. 전송 액체 비누에 cryotubes장기 보관 용 ID 질소.

마우스 텍스로 9 CNiFER 주입

  1. 수술 전에 오토 클레이브의 모든 수술 도구를 소독. 70 % 에탄올로 닦아 깨끗한 실험실 기저귀를 내려 놓고하여 수술에 대한 반 멸균 필드를 준비합니다.
  2. 수직 전극 풀러에 유리 모세관 (0.53 mm의 ID)를 잡아 당겨 CNiFER 주입 피펫을 준비합니다. 어떤 한 쌍을 사용합니다. 5 좋은 팁 집게 40 μm의 ~의 직경에 전극의 끝을 중단합니다.
    참고 :이 최고의 계수와 스테레오 줌 현미경으로 수행됩니다.
  3. 이소 플루 란과 성인 (출생 후 하루 60 ~ 90) C57BL / 6 마​​우스를 마취 : 4 % (v / v)의 유도 1.5 ~ 2.0 % (v / v)의 유지 보수를 위해. 마우스가 완전히 마취되어 있는지 확인 꼬리 또는 발가락 핀치를 사용합니다.
    다시 핀치 주기적으로 마취의 깊이를 재평가 수술을 통해 수염 경련을 평가 :합니다.
  4. 페이지에 안과 연고와 눈을 커버하지 못하 건조. 귀 막대와 정위 프레임에 마우스를 탑재합니다. 직장 프로브에 의해 조절 가열 패드를 사용하여 37 ° C에서 마우스 체온을 유지한다.
  5. 지역을 동물 전기 면도기와 12mm로 약 5mm 쉐이브. Betadine 70 % (v / v)의 이소프로판올 다음에 적용됩니다. 절단 두개골 표면 위에 피부를 제거 메스 블레이드를 사용한다. 두개골 표면으로부터 골막을 제거 메스 블레이드를 사용한다. 노출 및 정위 수술 11에서 기술 한 바와 같이, 두개골의 표면을 세정.
  6. 정수리와 안테 - 후방 (A / P) 및 메디 오 - 측면 (M / L)를 기록하는 빈 유리 피펫을 낮 춥니 조정합니다. 마우스 뇌 아틀라스를 참조하면, 주사 부위의 위치를​​ 계산한다. 표적 부위로 피펫 시프트 이후의 창 형성 용 두개골을 표시한다. 세틴 등의 알을 참조하십시오. 설치류 (11)와 정위 주사에 대한 자세한 내용은.
    참고 : 주입 및 윈도우의 사이트가 등록에 따라 달라집니다이온은 공부 피질에서 신경 전달 물질 또는 펩티드 방출 돌기의 분포한다. 예를 들어, 최근의 간행물 7에서, 정위는 +1.0 +2.0 mm의 A / P 및 +1.0 +2.0 mm M의 /에 L로 고전적 조건 중에 도파민 방출 생체 이미징 전두엽 피질에 CNiFER 세포를 주입하기 위해 사용 된 좌표 .
  7. 이전 12,13 바와 같이 2mm X 3mm 박형화 두개골 창을 형성한다.
    참고 : 창에 뼈가 15 ~ 20 μm의 두께이어야한다. 뼈가 충분히 12, 13를 얇게하는 경우 두개골 표면이 습하게되면 뼈에 작은 흰 반점이 표시되지해야합니다.
  8. 주입하는 세포를 준비하는 동안 습기를 유지하기 위해 창에 스펀지를 담가 ACSF를 놓습니다.
  9. T75 플라스크에 ~ 80 %의 포화 상태에서 재배 된 CNiFER 클론을 수확. 미디어를 기음과 멸균 PBS로 세포를 씻어.
    참고 : 트립신이 단계를 생략한다.
  10. 오 PBS를 제거하고 10 ml에 사용F ACSF 플라스크의 바닥으로부터 세포를 이동시키다. 씹다 세포는 세포 덩어리를 떼어 놓다합니다. 원심 분리기는 ACSF 100 ㎕에 펠렛을 재현 탁합니다. ACSF에 덮여 펠렛을 떠나, 1,400 XG에 30 초 동안 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. 이 단계는 정지 세포의 덩어리를 떠난다.
  11. , 미네랄 오일 단계 9.2에서 제조 된 주입 피펫을 백필 nanoinjector에 피펫을로드하고 기름의 작은 구슬을 꺼내 플런저를 전진. 마우스 제조 근처 파라핀 플라스틱 필름의 스트립 상 CNiFER 세포 현탁액의 5 μL를 넣어. 어느 CNiFERs을 그리거나 뽑아 피펫으로 CNiFER 세포를 제어 할 수 있습니다.
  12. 대상 X에 피펫을 이동하고 Y 좌표, 즉, A / P 및 M / L 단계 9.5에서 언급했다. 얇아진 두개골을 관통, 피펫을 내린 ~ 두개골 표면 아래 200 ~ 400 μm의이 층 피질의 2/3에 CNiFER 세포를 입금하는 것을 계속한다.
  13. nanoinjec와 깊은 사이트에서 ~ CNiFER 세포의 4.6 NL을 주입토르, 노트 석유와 세포 인터페이스에서 운동 후 세포를 분배하기위한 5 분을 기다립니다. ~ 100 μm의 피펫을 철회하고 CNiFER 세포의 또 다른 ~ 4.6 NL을 주입, 5 분을 기다립니다. 그런 다음 CNiFERs의 역류를 방지하기 위해 천천히 부드럽게 피펫을 철회. 하나 이상의 인접 부위에 주사를 반복합니다.
  14. 반복 주입 제어 HEK293 세포 (즉, HEK293 / TN-XXL / G의 qi5이 부족 복제 GPCR)와 9.8-9.12 단계를 반복합니다. CNiFER을 분리하고 ~ 200 μm의에 의해 세포 주입 사이트를 제어 할 수 있습니다.
  15. 세포 주입을 완료 한 후, ACSF으로 얇게-두개골 창을 씻어 두개골이 마를 때까지 기다립니다. 창 위에 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 방울 (원료 참조)를 적용하고 신속 접착제 위에 미리 잘라 멸균 커버 유리를 배치했다. 부드럽게 초간 두개골에 대해 커버 글래스를 누른다. 2 분 12, 13의 접착제 건조를 할 수 있습니다.
  16. 치과 용 시멘트 및 양식 AW와 커버 유리의 가장자리를 밀봉창 주위 엘은 침지 목적을 위해 물을 개최합니다.
  17. 촬영하는 동안 마우스의 머리를 고정를 들어, (치수 및 재료에 대한 자세한 내용은 14 참조) 창 뒤에 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 작은 방울을 가진 맞춤형 헤드 막대를 연결합니다. 접착제가 완전히 건조 후 추가로 맞춤형 헤드 막대를 강화하기 위해 추가 치과 용 시멘트를 추가 할 수 있습니다.
  18. 치과 용 시멘트의 층으로 창을 제외한 두개골 표면의 나머지 부분을 커버. 피부의 가장자리는 시멘트에 포함되어 있는지 확인하고 20 분 동안은 건조 할 수 있습니다.
  19. 수술 후, 이소 플루 란 투여를 중지하고 완전히 마취에서 회복 될 때까지 장에 가열 패드에 마우스를 둡니다. 수술 후 진통제 5 재수에 대한 % 식염수 (SC)에서 (w / v)의 포도당과 0.05 mg의 0.1 / kg 프레 노르 핀 (IP, 인스턴트 버전)를 주입한다.
    인간 CNiFERs에 대한 잠재적 인 면역 반응을 최소화하기 위해 20 μL / 100g의 시클로 매일 마우스를 주입 참고 :sporine (IP) CNiFERs의 주입 전에 하루를 시작.
  20. 음식과 물에 대한 자신의 홈 케이지에 마우스를 돌려줍니다.

CNiFER 클론의 생체 내 이미징에서 (10)

참고 : 라이브 영상이 이광자 현미경 및 헤드의 고정 장치를 사용하여 마우스를 행한다. 어떤 마취는 영상 세션 동안 필요하지 않습니다. 웨이크 상태에서 동물을 묘화 할 때, 응력 수준을 감소시키기 위해 한 번에 몇 시간에 머리 받침을 제한한다. 음식과 물을 위해 그것을 이미징 세션 사이의 홈 케이지 동물을 돌려줍니다. 잠재적 인 스트레스는 인클로저에 마우스의 일부를 실내 조명을 어둡게하고 주변에 의해 최소화된다.

  1. 수술 후 당일, 헤드 고정 프레임에 두개골에 이식 금속 헤드 막대를 돌려서 이미징 플랫폼에 마우스를 탑재합니다.
    주 : 웨이크 마우스 촬상하면, 촬상 세션 인해 헤드 구속 장치에 의한 전위 응력에 몇 시간을 초과해서는 안된다.
  2. 10 배 (0.30 NA)와 40 배 (0.80 NA) 침수 목표에 장착 된 두 개의 광자 이미징 현미경 헤드 억제 마우스로 영상 플랫폼을 놓습니다.
  3. 460 nm의 황수정을 측정 내지 560 nm의 측정 eCFP에 대한 nm의 500 및 520에 걸쳐 505 nm의 대역 통과 필터에서 이색 거울을 가지고 FRET 영상 (eCFP과 황수정)에 대한 필터 큐브를 삽입합니다.
  4. 잘 포함 얇게-두개골 창에 ACSF를 추가하고 ACSF에 침수 목표를 내립니다. 창 아래의 피질과 혈관의 표면을 찾을 수은 램프와 GFP 필터 큐브와 함께 접안 렌즈를 사용합니다.
    참고 : 혈관의 패턴은 영상의 반복 일 동안 이미지를 동일한 지역을 찾아하는 데 도움이됩니다. 수동으로 GFP 필터 큐브와 수은 램프를 사용하여 세포를 통해 피질의 표면에 초점을 맞춤으로써 CNiFERs를 찾습니다 40X 물 침지 목표로 전환합니다.
  5. 두 광자 이미징 설정합니다. 액세스 포인트를 선택두 광자 이미징을위한 propriate 빛의 경로입니다. 전형적인 상업적 시스템에있어서, 두 개의 광자 촬상 모드로 전환하여 비 descanned 검출기의 광전자 증 배관 튜브 (PMT가)에 광을 리디렉션하도록 소프트웨어를 사용한다. , 근적외선 펨토초 펄스 레이저를 켜고 820 nm의 파장 5-15 %의 전력 설정을 선택합니다. 주 : 5 %의 전력은 일반적으로 시료에서 ~ 25 mW의 제공.
  6. 최대 값에 가까운 PMT1 & PMT2 전압의 PMT에 따라 일반적으로 700-1,000 V를 설정합니다. 각 채널에 대한 1 게인을 설정 상기 목적을위한 Z 위치를 제로.
  7. ~ 대뇌 피질의 표면에서 100 ~ 200 μm의 목적을 내리고 XY 스캔을 시작합니다. CNiFER 형광의 신호 대 잡음비를 최적화하기 위해, 레이저 전력, 이득, 각각의 채널의 PMT 전압, eCFP 및 레몬을 조정한다.
  8. backgroun에뿐만 아니라 CNiFER 세포를 포함하는 영역에 화상을 제한하는 소프트웨어에서 줌 기능을 사용하여D 지역. 픽셀 당 4 μs의 하나의 프레임을 2 초마다 (0.5 Hz에서)보다 더 느린 스캔 속도를 사용합니다. 적당한 신호대 잡음비, 예를 들어, 칼만 2 라인 평균화 평균화 라인을 조정한다.
  9. 비행기 당 약 3 ~ 4 세포를 둘러싸고, 관심 영역 CNiFER 세포 주위 (ROI)을 그립니다. 투자 수익 (ROI) 평균 강도의 설정 실시간 분석. 시간이 지남에 CNiFER 형광을 모니터링하는 인수를 시작합니다.
  10. 전에 실험 조작, 예를 들어, 사용자의 결정에 따라 전기 자극, ChR2 자극, 행동, 중 CNiFERs에서 형광을 수집합니다.
  11. 촬상 실험이 완료 될 때, 홈 케이지에 마우스를 반환한다. 원하는대로 일에 걸쳐 이미지를 반복합니다. 경우 셀이 같은 영상 필드 (단계 10.4)로 다시 방향을 미리 획득 낮은 배율 혈관 화상을 참조 이미지 다시.
    주 : 이식 CNiFERs 적어도 7 일간 묘화 될 수있다.

11. 데이터 분석

  • 오픈 이미지 파일은 투자 수익 (ROI)의 CNiFERs과 배경에 대해 하나의 투자 수익 (ROI)을 선택합니다. 각 ROI의 두 채널에 대한 '시리즈 분석'을 선택합니다. 탭으로 구분 된 파일로 각각의 투자 수익 (ROI)에 대한 수출 평균 형광 강도.
  • 형광 값을 분석하는 수학적 소프트웨어 (자료 참조) 프로그램을 사용하십시오. 저역 통과 필터 (0.3 Hz에서) 각각의 신호는 다음과 eCFP 시트린 형광 강도로부터 각 ROI의 배경 형광을 뺄.
  • 기준선 평균 형광을 계​​산하고 FRET 비 ΔR (t) / R을 측정하기 위해 수학 식 1에 기재된 비율을 계산한다.
  • CNiFERs의 감도를 결정하기 위해 로그 작용제 농도의 함수로서 FRET 비율을 플롯. 과학적 통계 소프트웨어 및 힐 식 (식 2)를 사용하여 EC (50) 및 힐 계수 (n)를 결정하는 힐 식으로 장착한다.
  • Equation1

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    Representative Results

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    특정 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)와 유전자 코드 [칼슘 2 +] 센서, TN-XXL하십시오 CNiFER 안정적 적어도 두 개의 단백질을 발현하도록 유전자 조작 된 인간 배아 신장 (HEK293) 세포에서 파생됩니다. TN-XXL은 칼슘 이온 -6,15-의 질문에 답변 시안과 노란색 형광 단백질 각각 eCFP과 황수정, 사이의 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 겪는다. 내생 G q를 G 단백질에 그 부부의 GPCR의 활성화는 [칼슘 2 +]를 PLC / IP 3 경로를 통해 TNXXL 칼슘 검출기에서 FRET의 증가로 이어지는 (그림 1) 세포질의 증가를 발생시킨다.

    그림 1
    그림 1 :. 개발 CNiFERs에 대한 계획 탑, GPCR-칼슘 2 +을 만드는 데 필요한 신호 전달 경로CNiFER 셀. 바닥, HEK293 세포를 사용 CNiFERs를 구성하는 기본 단계. 1. 형질 도입 유전자 인코딩 FRET 기반 칼슘) 검출기 ((TN-XXL)와 단계. 2 단계 즉, 형질 도입 Gα G 단백질 키메라, G의 QS5, G의 qi5, 필요한 경우. CNiFER을 만들 3. 형질 도입 독특한 GPCR 단계. 두 광자 여기 광 (빨간색)의 eCFP 방출 (시안)과 황수정 방출 (노란색)을 모두 생산, FRET을 거쳐 eCFP을 흥분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    FRET 증가는 신경 전달 물질의 농도 변화의 신속한 광학적 판독을 제공한다. 신경 전달 물질의 특정 유형에 대한 CNiFER을 개발하기 위해, 제 G 단백질의 유형을 결정하는 것을 GPCR에 결합. G의 Q는 GPCR에 -coupled를 들어, GPCR은 내생 발현 G Q의 단백질을 사용하여HEK293 세포. G 들어 I / O는 -coupled 된 GPCR하는 클론 HEK293 라인은 먼저 G q를 -PLC / IP 3 경로로 GPCR을 리디렉션 키메라 G 단백질을 표현 만들어집니다. 이것은 주로 Gα Q 시퀀스와 G I의 카복실 말단 다섯 아미노산을 포함하는 키메라 G 단백질 G의 qi5로 이루어진다. G의 qi5이 G I / O -coupled 된 GPCR과 통신하지만 G Q의 경로를 통해 신호를 위해이 다섯 아미노산은 충분하다. G의 -coupled 된 GPCR를 들어, G의 QS5 키메라 (10)를 사용한다. CNiFER를 제조하기위한 일반적인 전략이다 : 1), 2) 안정 G 단백질 키메라를 발현 HEK 세포의 렌티 바이러스 형질 도입을 이용하여, 안정적으로 광 칼슘 검출기를 발현하는 클론 HEK293 세포, 즉, TN-XXL를 만들 필요한 경우, HEK293 세포 클론 TN-사이즈를 나타내는, 3) HEK293 세포에서 안정하게 발현하는 클론을 GPCR에 만들TN-XXL 및 키메라 G 단백질을 발현하는 복제. TN-XXL 및 키메라 G 단백질을 GPCR이 부족하지만있는 클론 HEK293 라인은 '제어 CNiFER'역할을한다. 제어 CNiFER는 CNiFER 응답 구체적 D2R 아닌 내생 HEK293 세포에서 발현 다른 수용체의 활성화로 설계 수용체의 활성화에 기인 것을 확인할 필요가있다.

    렌티 바이러스를 생성하기 위해, lentivector 발현 시스템이 사용되며, 예를 들어, 대상의 포장, 전달, 바이러스 표현의 안정적인 통합 게놈 DNA로 구성, 표현에 대한 책임이있는 유전 적 요소가 포함 pCDH-CMV-MCS-EF1-순수하지 않아, 유전자 서열. 바이러스 입자, 발현 및 포장 벡터의 높은 역가를 생성하는 일시적 제조자 포유류 세포 내로 공동 형질 감염되어 바이러스가 수집된다. 높은 TI를 생성 할 수 있습니다 미국의 여러 바이러스의 핵심 시설이 있습니다 터 렌티 바이러스. HEK293 세포의 감염 후, 순수하지 않아 유전자가 형질 도입 된 HEK293 세포를 식별하기위한 항생제 내성을 제공한다.

    클론 특정 행을 식별하기 위하여, HEK293 세포는 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 시스템을 이용하여 정렬 형질. 목적은 FRET 계 칼슘 검출기의 높은 발현 수준 및 FRET을 진행하는 능력을 포함하는 클론을 분리한다. FACS 분석이 예에서, eCFP 방출 형광은 FRET 신호 (eCFP 여기 및 발광 직사각)에 대해 도시된다. 상자는 이후 96 웰 플레이트에 (그림 2) 정렬 ( "문") 선택됩니다 영역 (P2와 P3)를 표시합니다. 일반적으로, 약 4 96 웰 플레이트 CNiFERs의 성공적인 생성을 선별하기에 충분하다. 이들 4 판에서 약 100 클론 형광 플레이트 리더 분석에 적합하다.

    1 "> :"유지 - together.within 페이지 = FO "e_content 그림 2
    그림 2 : FACS 분석의 예 FACS 분석 다음과 같은 출력의 샘플.. 시트린 방출의 함수로서 그래프는 eCFP 발광 ( "20분의 475-A") ( "FRET V-30분의 530-A"), 각 셀 eCFP 여기를 사용. 지역 P2와 P3 쇼 영역은 개별 셀에 정렬, 게이트, 즉, 선택했습니다. 색상은 임의입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    정렬 된 셀이 충분한 밀도로 성장 후에 작용제 활성화 다음 FRET 반응 용액 처리를 구비 한 96 웰 형광 플레이트 판독기 시스템을 사용하여 결정된다. 공부하는 클론의 수를 좁히려는 "3 점"작용제 곡선은 화면하는 데 사용됩니다 ~최고의 응답 100 클론을 선택 CNiFERs. 12 다른 신경 전달 물질 또는 조절제와 프로브 비특이적 반응은 약 10 개의 클론은 동족 인 작용제와 전체 용량 - 반응을 결정하여 상기 분석 및. 약물 (예, 작용제, 길항제 등)에 ACSF : 96- 웰 약물 플레이트 (플레이트 (3)의 최종 농도는 1 희석) 3 배의 농도로 제조한다. 이 예에서, 약물 플레이트는 다른 신경 전달 물질 및 펩티드 작동 제의 다양한 동종 작용제, 도파민, 잠재적 비특이적 반응 (도 3)와 D2 CNiFER 테스트 용으로 설정된다. GPCR이 부족 백본 CNiFER는 새로 만든 CNiFER의 중요한 제어 역할을합니다.

    그림 3
    그림 3 :. 96 웰 플레이트의 레이아웃의 예 맨의 layou의 테이블, 형광 플레이트 리더의 3 배 약물 플레이트를로드하는 다양한 신경 전달 물질과 펩타이드의 3 배 농도를 사용하는 t. 아래, 투명한 플라스틱 96 웰 약물 플레이트와 CNiFERs 시드 및 플레이트 리더로 측정 블랙 96 웰 플레이트의 예입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    GPCR 자극은 TN-XXL 의한 세포 내 [칼슘] 및 검출의 상승의 결과, FRET 반응을 증가시킬 것으로 예상된다. 이러한 조건에서 FRET은 eCFP의 여기가 작은 eCFP 방출 큰 황수정 방출을 생산하도록 eCFP과 황수정이, 가까이 이동하여 생성된다. 이 예에서, 여자는 436 nm의 및 배출 필터로 설정이 eCFP 485 ± 7.5 nm의 황수정에 대한 527 ± 7.5 nm의 (그림 4)로 설정됩니다. 바 삼십 초seline 형광을 측정하고 ACSF 판에서 "3 배"작용제에서 다음 50 μL 각 잘 포함 된 100 μL의 ACSF에 전달된다 (1 : 3 희석). eCFP과 황수정 방출 형광 180 초마다 3.8 초를 측정한다. 배경 측정없이 셀 웰에서 촬영하고, 필요한 경우, 감산된다. 형광 강도를 정상화하기 위해 사전에 자극 기준선이다 (F (t) / F (기준)), 피크 응답은 527의 FRET 비율 (ΔR / R)을 F (t)를 사용하여 / F (기준)을 계산하기 위해 측정 nm 내지 485 nm의 채널 (식 1). 투여 량 반응 곡선은 다른 작용제의 농도의 함수로서 FRET 비율을 플롯 팅하고, EC (50) 및 힐 계수 (도 5) (식 2)를 결정하기 위해 힐 방정식에 적합하여 구성된다. 최적 CNiFER 큰 FRET 비와 동족 작용제에 적합한 EC (50)를 나타내고, 기타 neurotransmit 거의 또는 전혀 배경 응답을 나타낸다터 작용제. 대조적으로, 제어 CNiFER은 동족 작용제에 거의 반응을 보여 주어야한다.

    그림 4
    그림 4 :. 해결책 전달 시스템과 플레이트 리더 측정 작용제에 의한 FRET 응답 D2R CNiFER FRET 응답의 예. D2 CNiFERs에 (A) 도파민 (빨간색 막대)의 응용 프로그램 중 FRET 응답의 플롯, 즉, eCFP과 황수정 배출량 eCFP 여기. 그 eCFP 방출 감소를 참고 작용제 (도파민)와 레몬 방출 증가있다. (B) 뮬러 등.에서 수정 (A) 그림의 응답을 FRET 비율 (식 1)의 플롯은 2014 년 7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


    그림 5 :. D2 CNiFER에 대한 용량 반응 곡선의 예는 (A) (녹색 NE) 도파민 D2에 CNiFERs의 응답 (DA, 검은 색)과 노르 에피네프린에 대한 반응 곡선을 선량. 또한 D2R 부족 "컨트롤"CNiFERs의 응답이 도시되어있다. (B) 막대 그래프는 50 nM 내지 1 μM에서 다른 신경 전달 물질 및 변조기에 대한 FRET 비 반응을 나타낸다. 값은 ± SEM 평균입니다. 뮬러 외. 2014 년 7에서 수정 된 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    CNiFER 클론 프레젠테이션 판별 더 가능 수용체 의존성에 대해 둔감 및 시간적 해상도에 대해 평가할 수있다두 개의 서로 다른 효능 펄스의 (자세한 내용은 참조 뮬러 외. 2014 년 7). CNiFER 클론을 생성하는 데, 그 다음 단계는 생체 내에서의 기능을 테스트하는 것이다. 생체 내에서의 형광을 모니터링하기 위해, 두 개의 광자 현미경을 사용하는 것이 필요하다. 시닝 두개골 창을 준비한 후 CNiFERs 유리 피펫에로드 및 피질 층의 2/3를 주입. 마우스는 (그림 6)에 얇은 두개골에 유리 커버 슬립을 부착, 및 이미징 동안 머리를 고정하는 헤드 줄을 주입하여 생체 내 이미징을위한 준비가되어 있습니다.

    이식 CNiFERs는 생체 내에서 실행 가능한 것을 확인하려면 작용제의 알려진 농도는 이식 부위 근처에 주입 될 수 있으며, FRET 비율은 7 결정했다. 또한 이식 CNiFERs의 활성을 확인하려면, 입력 뉴런을 자극하는 검사해야합니다. D2 CNiFER의 효과를 예를 들어피질로 투사 중뇌 도파민 신경 세포의 전기 자극 조사 하였다. 500 ㎛의 선단을 분리하는 전극을 자극하는 0.1 MΩ 텅스텐 바이폴라 (-3.2 mm의 A / P, -1.3 mm의 M / L가 -4.4 mm의 D는 / V).도 6을 흑질 주입 전기의 일례를 도시 한 다른 강도의 흑색질 자극 및 D2 CNiFERs 7 대한 FRET 비율의 증가를 관찰. D2 수용체 길항제 eticlopride (1 ㎎ / ㎏), 차단 D2 CNiFER 응답의 전신 복강 내 (IP) 주입을 참고. 도파민 재 흡수 차단이 전기적으로 유발 D2 CNiFER 응답 7 향상 한편, 코카인 주사 (15 ㎎ / ㎏)에.

    그림 6
    그림 6 : D2 CNiFER 응답 I의 Substantia 그라의 전기 자극에 따라 옹> N 생체. (A) 만화는 생체 내 두 광자 이미징 및 전기 자극을 준비 머리 고정 마우스를 보여줍니다. 여기에 대 한 두 개의 광자 빛 (빨강, 820 ㎚) 및 eCFP (파란색)과 황수정 (녹색) 530 nm의 방출에 대한 475 nm의 방출. (B)는 라인 플롯 D2 CNiFER 대한 FRET 비가 흑색질의 전기 자극, 다음 피질 주입 도시 즉, D2R의 존재하에 전기 자극 다음 50~500 밀리 대한 ㎐, 및 50 내지 300 μA의 200 마이크로 초 펄스 길항제 (eticlopride) 또는 코카인. 뮬러 외. 2014 년 7에서 수정 된 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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    표 1 : HEK293 성장 매체와 ACSF를 만들기위한 화학 물질 및 시약의 목록입니다.

    표 2
    표 2 : 크기가 다른 문화 판 또는 술병에서 수확 세포에 대한 볼륨.

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    Discussion

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    CNiFERs의 생성은 광학적으로 생체 내에서 뇌의 신경 전달 물질의 방출을 측정하기위한 혁신적이고 독특한 전략을 제공합니다. CNiFERs 이상적으로 신경 전달 물질에 대한 extrasynaptic 해제, 볼륨 전도를 측정하기에 적합합니다. 중요한 것은, 각 CNiFER은 뇌의 신경 전달 물질의 농도의 변화 생리 광 측정을 제공하는 천연 GPCR의 특성을 가지고있다. 지금까지 CNiFERs은 아세틸 콜린을 검출 생성 된 (M1-CNiFER) (6), 도파민 (D2-CNiFER) (7)과 노르 에피네프린 (α1a-CNiFER) 7.

    주에서, CNiFER는 GPCR을 통해 신호하는 신경 전달 물질 생성 할 수 있습니다. G의 Q G 단백질을 통해 GPCR 신호가 더 이상 수정이 HEK293 세포에 필요하지 않은 경우에 대해. G 통해 신호의 GPCR은 I / O는, 그러나, G의 qi5 키메라 G 단백질의 동시 발현을 필요로부부의 G의 Q / PLC 경로의 7, 10에 GPCR. 마찬가지로, G 용의를 통해 신호의 GPCR은 키메라 G QS5 G 단백질 (10)의 동시 발현이 필요합니다. 완료되면, 각 CNiFER 클론 선별되고 천연 수용체 비교 친화력들만 CNiFER 클론이 거의 또는 전혀 탈감작을 나타내고 생체 이광자 현미경 측정에 적합 신호 대 잡음비를 제공하는, 생체 내 연구에 선택됩니다.

    생체 내 연구를 들어, 높은 잠재적 인 면역 반응을 최소화하는 사이클로스포린과 쥐를 치료하는 데 추천된다. 거부 반응의 가능성 또는 설치류 내로 인간 뇌 CNiFER 세포 주입으로 면역 반응이있다. 이것은 CNiFER 주입 다음, GFAP 및 MAC1 7의 발현을 조사함으로써 이전에 조사 하였다. CNiFERs은 아교 흉터를 생산하는 표시 또는 유의을 생성하지 않았다ficant MAC1 7 염색.

    CNiFERs를 구성에서 고려해야 할 두 가지 주요 문제가 감도와 둔감하다. EC의 50 고유 수용체에 대하여, 즉, 낮은 친 화성이 너무 높다면 그 CNiFER은 생체 내에서 신경 전달 물질의 방출을 검출하기에 충분한 민감도를 가질 수 없다. 한 가지 해결책은 클론을 rescreen 높은 친 화성이 다른 CNiFER 클론을 선택하는 것입니다. 또 다른 전략은 GPCR 활성화에 대한 EC (50)를 전환 할 수 있습니다 높은 칼슘 감도를 가질 수있다 유전자 인코딩 된 형광 칼슘 탐지기, 다른 유형을 테스트하는 것입니다. CNiFER 디자인 모듈러이므로 쉽게 GCaMP 16 유전자 인코딩 칼슘 탐지기의 다른 유형에 적응된다. 같은 수용체하지만 다른 EC (50)의와 CNiFER 클론을 분리하는 것은 내생 NEU의 검출 릴리스의 동적 범위를 확장하는 장점이 될 수있다생체 내에서 rotransmitters.

    CNiFER의 탈감작은 생체 내에서의 사용을 제한합니다. 최대 반응이 서서히 작용제의 각각의 펄스가 감소하는 경우, 그 수용체 탈감작 될 수있다. 이 경우, 다른 복제본을 검사하고 동일한 방식으로 대응하는지 확인. 수용체의 아미노산 서열 또는 다른 수용체 서브 타입의 사용에 대한 수정 작용제 의존 탈감작을 해결하기 위해 필요할 수있다. G 단백질 수용체 키나제 (GRKs)와 그 동료가 인산화 또는 아미노산 위치가 식별 알려진 경우, 하나 이상의 부위를 돌연변이함으로써 GPCR의 비 탈감작 변이체를 생성하는 것이 바람직 할 것이다. 탈감작 기전은 경우에 따라 각 수용체에 대해 결정되어야한다.

    지금까지 CNiFERs는 두 광자 마일과 이미징 형광에 제한을 분광하는 피질 6,7의 표면 층으로 인해 이식 된(17, 18)를 croscopy. 향후 그 CNiFERs는 피질 하 뇌 영역에 이식 될 수 있도록 형광 (19)의 섬유 기반 측정과 CNiFER 기술을 적용하는 것이 가능하다.

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    Disclosures

    저자는 공개 아무것도 없어.

    Acknowledgments

    우리는 전자 제품에 대한 지원은 G의 qi5 및 G QS5 cDNA를, A. 슈바이처를 제공 B. 콘 클린 (캘리포니아 대학 샌프란시스코)를 감사, N. 테일러 증거 읽기 클론, 이안 Glaaser 로버트 리프킨의 심사에 대한 지원 및 TN-XXL에 대한 올리비에 Griesbeck. (; DA037170 DA029706), 바이오 메디컬 이미징 및 생물의 국립 연구소 (NIBIB) (EB003832), 호프만 - 라 로슈 (88610A)과 "신경 과학이 작품은 약물 남용에 미국 국립 연구소 (NIDA)를 통해 연구비에 의해 지원되었다 NIDA (DA007315)를 통해 남용 "훈련 보조금의 마약 관련.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro  System Biosciences CD510B-1 Cloning: for generating lentivirus
    12 x 75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube BD Biosciences 352063 FACS
    BD 40 um Falcon cell strainers BD Biosciences 352340 FACS
    0.05% Trypsin EDTA  Invitrogen 25200056 FACS
    96 Well Plate, flat bottom, clear  Corning  3596 FACS
    96 well cell culture plates  Corning  CLS3997 Flexstation
    Optilux black clear bottom  Corning  3603 Flexstation
    Flexstation pipet tips Molecular Devices 9000-0911 Flexstation
    Acetylcholine Chloride   Sigma-Aldrich A2661 Flexstation
    Norepinephrine   Sigma-Aldrich A7256 Flexstation
    Dopamine Hydrochloride   Sigma-Aldrich PHR1090 Flexstation
    GABA   Sigma-Aldrich A2129 Flexstation
    Histamine   Sigma-Aldrich H7125 Flexstation
    Glutamate   Sigma-Aldrich 49621 Flexstation
    Epinephrine   Sigma-Aldrich E4642 Flexstation
    Somatostatin    Sigma-Aldrich S1763 Flexstation
    5HT    Sigma-Aldrich H9523 Flexstation
    VIP  Alpha Diagnostics Inc.    SP-69627 Flexstation
    Orexin A Alpha Diagnostics Inc.    12-p-01 Flexstation
    Substance P   Sigma-Aldrich S6883 Flexstation
    Adenosine Sigma-Aldrich A4036 Flexstation
    Melatonin  Sigma-Aldrich M5250C Flexstation
    Fluorescence Plate Reader & software Molecular Devices Flexstation 3 Flexstation
     DMEM (high glucose) with Glutamax   Life Technologies 10569-010 Tissue culture
     Fetal bovine serum Life Technologies 10082-139 Tissue culture
     Pen/Strep  antibiotics Life Technologies 15140-122 Tissue culture
     Puromycin   InvivoGen ant-pr-1 Tissue culture
     Fibronectin  Sigma-Aldrich F0895 Tissue culture
    CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box Bioexpress D-3508) Tissue culture
    cyanoacrylate glue  Loctite Loctite no. 495 surgery and stereotaxic injection
    plastic paraffin film  VWR Parafilm® surgery and stereotaxic injection
    Nanoinjector Drummond 3-000-204 surgery and stereotaxic injection
    Glass electrodes Drummond 3-000-203G surgery and stereotaxic injection
    hand held drill OSADA Exl-M40 surgery and stereotaxic injection
    Burrs for drill Fine Scientific 19007-05; 19007-07) surgery and stereotaxic injection
    Sterilizing bath FST 18000-45, Hot Bead Sterilizer surgery and stereotaxic injection
    isoflurane chamber/mask Highland Medical Equipment 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm surgery and stereotaxic injection
    3D scope with arm Zeiss surgery and stereotaxic injection
    fiber optic light surgery and stereotaxic injection
    Betadine  surgery and stereotaxic injection
    70 % (v/v) isopropyl alcohol surgery and stereotaxic injection
    Povidone-Iodine Prep Pads dynarex 1108 surgery and stereotaxic injection
    NaCl 0.9% (injection, USP, 918610) surgery and stereotaxic injection
    CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) surgery and stereotaxic injection
    Buprenex (injection) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) Sigma-Aldrich surgery and stereotaxic injection
    Ophthalmic ointment  Akorn NDC 17478-235-35 surgery and stereotaxic injection
    Surgifoam Ethicon surgery and stereotaxic injection
    Grip dental cement Dentsply #675571, 675572 surgery and stereotaxic injection
    Instant SuperGlue  NDindustries surgery and stereotaxic injection
    LOCTITE 4041 surgery and stereotaxic injection
    METABOND C&B surgery and stereotaxic injection
    no. 0 cover glass Fisher surgery and stereotaxic injection
    stereotaxic frame  Kopf surgery and stereotaxic injection
    Rectal probe and heating pad FHC 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe surgery and stereotaxic injection
    optical breadboard for imaging Thorlabs surgery and stereotaxic injection
    Mineral oil Fisher S55667 surgery and stereotaxic injection
    Kwik-Cast (Silicone elastomer) World Precision Instruments surgery and stereotaxic injection
    Suture   Ethicon 18’’, 1667, 4-0 surgery and stereotaxic injection
    Scissors Fine Scientific Tools 91500-09, 15018-10 surgery and stereotaxic injection
    Forcepts Fine Scientific Tools 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 surgery and stereotaxic injection
    Student Halsted-Mosquito Hemostats Fine Scientific Tools 91308-12 surgery and stereotaxic injection
    Small Vessel Cauterizer Kit Fine Scientific Tools 18000-00 surgery and stereotaxic injection
    Hot Bead Sterilizers Fine Scientific Tools 18000-45 surgery and stereotaxic injection
    Instrument Case with Silicone Mat Fine Scientific Tools 20311-21 surgery and stereotaxic injection
    Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat Fine Scientific Tools 20810-01 surgery and stereotaxic injection
    2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging Olympus FV1200 MPE in vivo imaging
    Multiphoton laser SpectraPhysics Mai Tai DeepSee in vivo imaging
    Green Laser Olympus 473 nm Laser in vivo imaging
    xy translational base Scientifica MMBP in vivo imaging
    FRET filter cube for YFP and CFP Olympus in vivo imaging
    10x and 40x water immersion objectives Olympus in vivo imaging
    air table Newport in vivo imaging
    custom built light-tight cage Thorlab in vivo imaging

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    References

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    건설 셀 기반의 신경 전달 물질의 광학 검출을위한 신경 전달 물질 형광 엔지니어링 기자 (CNiFERs)<em&gt; 생체</em
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    Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J. Vis. Exp. (111), e53290, doi:10.3791/53290 (2016).More

    Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J. Vis. Exp. (111), e53290, doi:10.3791/53290 (2016).

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