Wir stellen ein Protokoll zellbasierten Neurotransmitter fluoreszierenden Reportern engineered (CNiFERs) zur optischen Erfassung der volumetrischen Neurotransmitter-Freisetzung zu schaffen.
Zell-basierte Neurotransmitter fluoreszierende entwickelt Reporter (CNiFERs) bieten ein neues Werkzeug für die Neurowissenschaftler die Freisetzung von Neurotransmittern im Gehirn in vivo zu optisch erfassen. Eine spezifische CNiFER wird aus einer humanen embryonalen Nierenzelle geschaffen , die stabil mit einer spezifischen G Protein-gekoppelten Rezeptor, der Paare G q / 11 G – Proteine und ein FRET-basierten Ca 2+ -Detektor, TN-XXL ausdrückt. Aktivierung des Rezeptors führt zu einer Erhöhung in der Signal FRET. CNiFERs haben nM Empfindlichkeit und eine zeitliche Reaktion von Sekunden , weil ein CNiFER Klon mit dem nativen Rezeptor für einen bestimmten Neurotransmitter verwendet, zum Beispiel D2R für Dopamin. CNiFERs werden direkt in das Gehirn implantiert, so dass sie die Freisetzung von Neurotransmittern mit einer räumlichen Auflösung von weniger als hundert & mgr; m, so dass sie ideal zur Messung der Volumentransmissions in vivo zu erfassen. CNiFERs kann auch für mögliche andere Arzneimittel zu screenen Kreuzreaktivität in vi verwendet werdenvo. Wir vor kurzem erweitert die Familie der CNiFERs GPCRs , dass Paar G i / o G – Proteine enthalten. CNiFERs zum Erfassen Acetylcholin (ACh), Dopamin (DA) und Norepinephrin (NE) verfügbar. Da jede GPCR verwendet werden kann, ein neues CNiFER zu schaffen, und dass es etwa 800 GPCRs im menschlichen Genom sind, beschreiben wir hier das allgemeine Verfahren zu entwerfen, zu erkennen und zu testen, jede Art von CNiFER.
Um vollständig zu verstehen , wie Nervenzellen im Gehirn zu kommunizieren, ist es notwendig , ein Verfahren zu haben , die Freisetzung von Neurotransmittern in vivo zu messen. Es gibt mehrere gut etablierte Techniken für Neurotransmitter in vivo zu messen. Eine üblicherweise verwendete Technik besteht darin , Mikrodialyse, in denen eine Kanüle in das Gehirn eingeführt wird , und ein kleines Volumen von Liquor wird gesammelt und analysiert unter Verwendung von Hochleistungs-Flüssigkeits – Chromatographie und elektrochemische Nachweis 1. Microdialysis hat eine räumliche Auflösung in der Größenordnung von wenigen Durchmesser der Sonde, zB ~ 0,5 mm für einen 200 & mgr; m Durchmesser Mikro. Die zeitliche Auflösung dieses Verfahrens ist jedoch langsam aufgrund Abtastintervalle , die typischerweise dauern ~ 5 min oder länger 1. Darüber hinaus werden Analysen nicht in Echtzeit durchgeführt. Eine andere Technik ist schnelles Scannen cyclischer Voltammetrie (FSCV), die eine Kohlenstoff-Fasersonde verwendet, die in das Gehirn eingeführt ist. FSCV hat eine ausgezeichnete Temperaturorale Auflösung (Subsekunden), hohe Empfindlichkeit (nanomolar) und räumliche Auflösung mit Sondendurchmesser von 5 bis 30 um. Allerdings ist FSCV auf Sender begrenzt , die eine charakteristische Oxidations- und Reduktionsprofil mit Spannung auf einem Kohlenstoff – potentiometrischen Sonde 2 herzustellen.
Eine dritte Technik Neurotransmitter zu messen , ist direkt über genetisch kodierten Neurotransmitter (NT) Biosensoren 3. Mit diesem Verfahren wird ein Fusionsprotein geschaffen , das eine Liganden-Bindungsdomäne für einen Sender enthält , der mit einem Fluoreszenz – Resonanz – Energietransfer (FRET) basierende Paar von Fluorophoren 4 oder einem permutierten GFP 5. Im Gegensatz zu den vorherigen beiden Verfahren werden diese Biosensoren genetisch codiert und exprimiert auf der Oberfläche einer Wirtszelle, wie beispielsweise ein Neuron, durch die Produktion von transgenen Tieren oder akut mit der Verwendung von viralen Mitteln Zellen zu infizieren. Bis heute genetisch kodierten Biosensoren nur wurden für detectin entwickeltg Glutamat und GABA 3-5. Einschränkungen mit diesen Techniken haben die geringe Empfindlichkeit, im nM – Bereich gewesen, und die Unfähigkeit , den Nachweis der großen Anzahl von Sendern, zum Beispiel klassische Neurotransmitter, Neuropeptide und Neuromodulatoren, die durch G – Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) Signal zu erweitern. In der Tat gibt es fast 800 GPCRs in das menschliche Genom.
Um diese Defizite ansprechen, haben wir ein innovatives Werkzeug zur optischen Messung Freisetzung von Neurotransmitter entwickelt, die einen GPCR-Signale durch. CNiFERs (zellbasierten Neurotransmitter fluoreszierenden Reportern engineered) sind klonale Zellen HEK293 engineered einen bestimmten GPCR zu exprimieren, der , wenn er stimuliert, eine Erhöhung der intrazellulären auslöst [Ca 2+], die durch eine genetisch kodierte FRET-basierten Ca 2+ Sensor erfasst wird, TN-XXL. So verwandeln CNiFERs Neurotransmitter-Rezeptor in eine Veränderung der Fluoreszenz-Bindung, eine direkte und Echtzeit-optischen r die Bereitstellungead-out der lokalen Neurotransmitteraktivität. Durch Verwendung des nativen Rezeptors für einen bestimmten Neurotransmitter, behalten CNiFERs die chemische Spezifität, Affinität und zeitliche Dynamik der endogen exprimierter Rezeptoren. Bis heute haben wir geschaffen drei Arten von CNiFERs, einer zum Detektieren Acetylcholin unter Verwendung des M1 – Rezeptor, einer zum Detektieren Dopamin Verwendung des D2 – Rezeptors, und ein zur Erfassung des & alpha; 1A – Rezeptor 6,7 Noradrenalin verwenden. Die CNiFER Technologie ist leicht erweiterbare und skalierbare es zugänglich für jede Art von GPCR machen. In diesem JoVE Artikel, wir beschreiben und veranschaulichen die Methodik zu entwickeln, erkennen, und in vivo Test CNiFERs für jede Anwendung.
Die Schaffung von CNiFERs bietet eine innovative und einzigartige Strategie zur optischen Messung Freisetzung von Neurotransmittern im Gehirn in vivo. CNiFERs zur Messung extrasynaptischen Freisetzung ideal geeignet, dh Volumenleitung, für Neurotransmitter. Wichtig ist, besitzt jede CNiFER die Eigenschaften des nativen GPCR, eine physiologische optischen Messung der Veränderungen der Konzentrationen von Neurotransmittern im Gehirn bereitstellt. Bisher wurden CNiFERs Acetylcholin (M1-CNiFER) 6,</…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken B. Conklin (University of California, San Francisco) für die Bereitstellung der G qi5 und G qs5 cDNAs, A. Schweitzer für die Unterstützung bei der Elektronik, N. Taylor für die Unterstützung bei Screening von Klonen, Ian Glaaser und Robert Rifkin für Korrekturlesen und Olivier Griesbeck für TN-XXL. (; DA037170 DA029706), dem National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) (EB003832), Hoffmann-La Roche (88610A) und der "Neuroscience Diese Arbeit wurde durch Forschungsförderung durch den US-amerikanischen National Institute on Drug Abuse (NIDA) unterstützt Bezug zu Drogen von Missbrauch "Ausbildungsförderung durch NIDA (DA007315).
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro | System Biosciences | CD510B-1 | Cloning: for generating lentivirus |
12×75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube | BD Biosciences | 352063 | FACS |
BD 40 um Falcon cell strainers | BD Biosciences | 352340 | FACS |
0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200056 | FACS |
96 Well Plate, flat bottom, clear | Corning | 3596 | FACS |
96 well cell culture plates | Corning | CLS3997 | Flexstation |
Optilux black clear bottom | Corning | 3603 | Flexstation |
Flexstation pipet tips | Molecular Devices | 9000-0911 | Flexstation |
Acetylcholine Chloride | SimgaAldrich | A2661 | Flexstation |
Norepinephrine | SimgaAldrich | A7256 | Flexstation |
Dopamine Hydrochloride | SimgaAldrich | PHR1090 | Flexstation |
GABA | SimgaAldrich | A2129 | Flexstation |
Histamine | SimgaAldrich | H7125 | Flexstation |
Glutamate | SimgaAldrich | 49621 | Flexstation |
Epinephrine | SimgaAldrich | E4642 | Flexstation |
Somatostatin | SimgaAldrich | S1763 | Flexstation |
5HT | SimgaAldrich | H9523 | Flexstation |
VIP | Alpha Diagnostics Inc. | SP-69627 | Flexstation |
Orexin A | Alpha Diagnostics Inc. | 12-p-01 | Flexstation |
Substance P | SimgaAldrich | S6883 | Flexstation |
Adenosine | SimgaAldrich | A4036 | Flexstation |
Melatonin | SimgaAldrich | M5250C | Flexstation |
Fluorescence Plate Reader & software | Molecular Devices | Flexstation 3 | Flexstation |
DMEM (high glucose) with Glutamax | Life Technologies | 10569-010 | Tissue culture |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-139 | Tissue culture |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Tissue culture |
Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | Tissue culture |
Fibronectin | SimgaAldrich | F0895 | Tissue culture |
CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box | Bioexpress | D-3508) | Tissue culture |
cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite no. 495 | surgery and stereotaxic injection |
plastic paraffin film | VWR | Parafilm® | surgery and stereotaxic injection |
NANOINJECTOR | Drummond | 3-000-204 | surgery and stereotaxic injection |
GLASS ELECTRODES | Drummond | 3-000-203G | surgery and stereotaxic injection |
hand held drill | OSADA | Exl-M40 | surgery and stereotaxic injection |
Burrs for drill | Fine Scientific | 19007-05; 19007-07) | surgery and stereotaxic injection |
Sterilizing bath | FST | 18000-45, Hot Bead Sterilizer | surgery and stereotaxic injection |
isoflurane chamber/mask | Highland Medical Equipment | 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm | surgery and stereotaxic injection |
3D scope with arm | Zeiss | surgery and stereotaxic injection | |
fiber optic light | surgery and stereotaxic injection | ||
Betadine | surgery and stereotaxic injection | ||
70 % (v/v) isopropyl alcohol | surgery and stereotaxic injection | ||
Povidone-Iodine Prep Pads | dynarex | 1108 | surgery and stereotaxic injection |
NaCl 0.9% (INJECTION, USP, 918610) | surgery and stereotaxic injection | ||
CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) | surgery and stereotaxic injection | ||
Buprenex (INJECTION) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) | Sigma | surgery and stereotaxic injection | |
Ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | surgery and stereotaxic injection |
Surgifoam | Ethicon | surgery and stereotaxic injection | |
Grip dental cement | Dentsply | #675571, 675572 | surgery and stereotaxic injection |
Instant SuperGlue | NDindustries | surgery and stereotaxic injection | |
LOCTITE 4041 | surgery and stereotaxic injection | ||
METABOND | C&B | surgery and stereotaxic injection | |
no. 0 cover glass | Fisher | surgery and stereotaxic injection | |
stereotaxic frame | Kopf | surgery and stereotaxic injection | |
Rectal probe and heating pad | FHC | 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe | surgery and stereotaxic injection |
optical breadboard for imaging | Thorlabs | surgery and stereotaxic injection | |
Mineral oil | Fisher | S55667 | surgery and stereotaxic injection |
Kwik-Cast (Silicone elastomer) | World Precision Instruments | surgery and stereotaxic injection | |
Suture | Ethicon | 18’’, 1667, 4-0 | surgery and stereotaxic injection |
Scissors | Fine Scientific Tools | 91500-09, 15018-10 | surgery and stereotaxic injection |
Forcepts | Fine Scientific Tools | 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 | surgery and stereotaxic injection |
Student Halsted-Mosquito Hemostats | Fine Scientific Tools | 91308-12 | surgery and stereotaxic injection |
Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Scientific Tools | 18000-00 | surgery and stereotaxic injection |
Hot Bead Sterilizers | Fine Scientific Tools | 18000-45 | surgery and stereotaxic injection |
Instrument Case with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20311-21 | surgery and stereotaxic injection |
Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20810-01 | surgery and stereotaxic injection |
2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging | Olympus | FV1200 MPE | in vivo imaging |
Multiphoton laser | SpectraPhysics | Mai Tai DeepSee | in vivo imaging |
Green Laser | Olympus | 473 nm Laser | in vivo imaging |
xy translation base | Scientifica | MMBP | in vivo imaging |
FRET filter cube for YFP and CFP | Olympus | in vivo imaging | |
25-X water immersion objective | Olympus | in vivo imaging | |
air table | Newport | in vivo imaging | |
custom built light-tight cage | Thorlab | in vivo imaging |