Vi præsenterer en protokol til at skabe celle-baserede neurotransmitter fluorescerende manipuleret reportere (CNiFERs) til optisk detektion af volumetrisk neurotransmitter frigørelse.
Cell-baserede neurotransmitter fluorescerende manipuleret reportere (CNiFERs) give et nyt værktøj til neuroforskere til optisk at detektere frigivelse af neurotransmittere i hjernen in vivo. Et specifikt CNiFER er skabt ud fra en human embryonal nyrecelle, som stabilt udtrykker et specifikt G-protein-koblede receptorer, som kobler til G q / 11 G-proteiner, og et FRET-baserede Ca2 + -detector, TN-XXL. Aktivering af receptoren fører til en stigning i FRET signal. CNiFERs har nM følsomhed og en tidsmæssig respons sekunder, fordi en CNiFER klon udnytter den native receptor for en bestemt neurotransmitter, f.eks D2R for dopamin. CNiFERs direkte implanteret i hjernen, så de kan fornemme neurotransmitter frigørelse med en rumlig opløsning på mindre end et hundrede um, hvilket gør dem ideelle til at måle volumen transmission in vivo. CNiFERs kan også anvendes til at screene andre lægemidler til potentiel krydsreaktivitet i VIvo. Vi har for nylig udvidet familien af CNiFERs at omfatte GPCR'er som kobler til G i / o G-proteiner. CNiFERs er tilgængelige til påvisning acetylcholin (ACh), dopamin (DA) og noradrenalin (NE). Eftersom enhver GPCR kan bruges til at skabe et hidtil ukendt CNiFER og at der findes omkring 800 GPCR'er i det humane genom, vi beskriver her den generelle fremgangsmåde til at designe, realisere og teste enhver type CNiFER.
For helt at forstå, hvordan neuroner kommunikere i hjernen, er det nødvendigt at have en metode til at måle frigivelsen af neurotransmittere in vivo. Der er flere veletablerede teknikker til måling neurotransmittere in vivo. En almindeligt anvendt teknik er mikrodialyse, i hvilken en kanyle er indsat ind i hjernen og et lille volumen af cerebrospinalvæske opsamles og analyseres under anvendelse af højtydende væskekromatografi og elektrokemisk detektion 1. Mikrodialyse har en rumlig opløsning i størrelsesordenen nogle få diametre af proben, fx ~ 0,5 mm for en mikrosonde 200 um diameter. Den midlertidige opløsning af denne teknik er imidlertid langsom på grund af prøveudtagning intervaller, typisk varer ~ 5 min eller længere 1. Desuden er analyser ikke foretages i realtid. En anden teknik er hurtig scanning cyklisk voltammetri (FSCV), som bruger en carbon-fiber probe, der indsættes i hjernen. FSCV har fremragende temporal opløsning (subsecond), høj følsomhed (nanomolær), og rumlig opløsning med sondens diameter på 5 til 30 um. Imidlertid er FSCV begrænset til sendere, der producerer en karakteristisk oxidation og reduktion Profilen med spænding på et carbonatom potentiometrisk føler 2.
En tredje teknik til at måle neurotransmittere er direkte gennem genetisk kodet neurotransmitter (NT) biosensorer 3. Med denne metode er et fusionsprotein skabt, der indeholder en ligand-bindende domæne til en sender koblet til en fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) -baseret par fluoroforer 4 eller et permuteret GFP 5. I modsætning til de to foregående metoder, er disse biosensorer genetisk kodet og udtrykt på overfladen af en værtscelle, såsom en neuron, gennem produktion af transgene dyr eller akut med anvendelsen af virale midler til at inficere celler. Til dato er genetisk kodet biosensorer kun blevet udviklet til detecting glutamat og GABA 3-5. Begrænsninger med disse teknikker har været lav følsomhed, i nM-området, og den manglende evne til at udvide påvisningen af det store antal sendere, f.eks klassiske neurotransmittere, neuropeptider og neuromodulatorer, som signalerer gennem G-protein-koblede receptorer (GPCR'er). I virkeligheden er der næsten 800 GPCR'er i det humane genom.
For at løse disse mangler, har vi udviklet et innovativt redskab til optisk foranstaltning frigivelse af enhver neurotransmitter, der signalerer gennem en GPCR. CNiFERs (cellebaseret neurotransmitter fluorescerende manipuleret reportere) er klonale HEK293-celler manipuleret til at udtrykke et specifikt GPCR, at når stimuleres, udløser en stigning i intracellulær [Ca2 +], der detekteres af en genetisk kodet FRET-baserede Ca2 + sensor, TN-XXL. Således CNiFERs omdanne neurotransmitter receptorbinding til en ændring i fluorescens, der direkte og real-time optisk rEAD-out af lokale neurotransmitter aktivitet. Ved at udnytte den native receptor for en given neurotransmitter, CNiFERs bevarer kemisk specificitet, affinitet og tidsmæssige dynamik endogent udtrykte receptorer. Til dato har vi skabt tre typer CNiFERs, en for detektering acetylcholin ved anvendelse af M1-receptoren, en for påvisning dopamin ved hjælp af D2-receptoren, og en til detektering noradrenalin ved hjælp af a1a receptor 6,7. Den CNiFER teknologien er let udvides og skalerbar, hvilket gør det muligt at foretage en hvilken som helst form for GPCR. I denne JOVE artikel beskriver vi og illustrere den metode til at designe, realisere og test in vivo CNiFERs for enhver ansøgning.
Oprettelsen af CNiFERs giver en innovativ og unik strategi for optisk måling frigivelse af neurotransmittere i hjernen in vivo. CNiFERs er ideelt egnede til måling ekstrasynaptiske frigivelse, dvs., volumen ledning, for neurotransmittere. Vigtigt er det, hver CNiFER besidder egenskaberne af det native GPCR, hvilket giver en fysiologisk optisk måling af ændringerne i niveauerne af neurotransmittere i hjernen. Til dato er der blevet oprettet CNiFERs til påvisning acetylcholin (M1-CNiFER) 6,</su…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker B. Conklin (University of California, San Francisco) for at levere de G qi5 og G qs5 cDNA'er A. Schweitzer for assistance med elektronik, N. Taylor for at få hjælp med screening af kloner, Ian Glaaser og Robert Rifkin til korrekturlæsning , og Olivier Griesbeck for TN-XXL. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger gennem det amerikanske National Institute on Drug Abuse (Nida) (DA029706, DA037170), National Institute of Biomedical Imaging og Bioengineering (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) og "Neuroscience relateret til Drugs af misbrug "uddannelse tilskud gennem Nida (DA007315).
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro | System Biosciences | CD510B-1 | Cloning: for generating lentivirus |
12×75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube | BD Biosciences | 352063 | FACS |
BD 40 um Falcon cell strainers | BD Biosciences | 352340 | FACS |
0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200056 | FACS |
96 Well Plate, flat bottom, clear | Corning | 3596 | FACS |
96 well cell culture plates | Corning | CLS3997 | Flexstation |
Optilux black clear bottom | Corning | 3603 | Flexstation |
Flexstation pipet tips | Molecular Devices | 9000-0911 | Flexstation |
Acetylcholine Chloride | SimgaAldrich | A2661 | Flexstation |
Norepinephrine | SimgaAldrich | A7256 | Flexstation |
Dopamine Hydrochloride | SimgaAldrich | PHR1090 | Flexstation |
GABA | SimgaAldrich | A2129 | Flexstation |
Histamine | SimgaAldrich | H7125 | Flexstation |
Glutamate | SimgaAldrich | 49621 | Flexstation |
Epinephrine | SimgaAldrich | E4642 | Flexstation |
Somatostatin | SimgaAldrich | S1763 | Flexstation |
5HT | SimgaAldrich | H9523 | Flexstation |
VIP | Alpha Diagnostics Inc. | SP-69627 | Flexstation |
Orexin A | Alpha Diagnostics Inc. | 12-p-01 | Flexstation |
Substance P | SimgaAldrich | S6883 | Flexstation |
Adenosine | SimgaAldrich | A4036 | Flexstation |
Melatonin | SimgaAldrich | M5250C | Flexstation |
Fluorescence Plate Reader & software | Molecular Devices | Flexstation 3 | Flexstation |
DMEM (high glucose) with Glutamax | Life Technologies | 10569-010 | Tissue culture |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-139 | Tissue culture |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Tissue culture |
Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | Tissue culture |
Fibronectin | SimgaAldrich | F0895 | Tissue culture |
CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box | Bioexpress | D-3508) | Tissue culture |
cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite no. 495 | surgery and stereotaxic injection |
plastic paraffin film | VWR | Parafilm® | surgery and stereotaxic injection |
NANOINJECTOR | Drummond | 3-000-204 | surgery and stereotaxic injection |
GLASS ELECTRODES | Drummond | 3-000-203G | surgery and stereotaxic injection |
hand held drill | OSADA | Exl-M40 | surgery and stereotaxic injection |
Burrs for drill | Fine Scientific | 19007-05; 19007-07) | surgery and stereotaxic injection |
Sterilizing bath | FST | 18000-45, Hot Bead Sterilizer | surgery and stereotaxic injection |
isoflurane chamber/mask | Highland Medical Equipment | 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm | surgery and stereotaxic injection |
3D scope with arm | Zeiss | surgery and stereotaxic injection | |
fiber optic light | surgery and stereotaxic injection | ||
Betadine | surgery and stereotaxic injection | ||
70 % (v/v) isopropyl alcohol | surgery and stereotaxic injection | ||
Povidone-Iodine Prep Pads | dynarex | 1108 | surgery and stereotaxic injection |
NaCl 0.9% (INJECTION, USP, 918610) | surgery and stereotaxic injection | ||
CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) | surgery and stereotaxic injection | ||
Buprenex (INJECTION) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) | Sigma | surgery and stereotaxic injection | |
Ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | surgery and stereotaxic injection |
Surgifoam | Ethicon | surgery and stereotaxic injection | |
Grip dental cement | Dentsply | #675571, 675572 | surgery and stereotaxic injection |
Instant SuperGlue | NDindustries | surgery and stereotaxic injection | |
LOCTITE 4041 | surgery and stereotaxic injection | ||
METABOND | C&B | surgery and stereotaxic injection | |
no. 0 cover glass | Fisher | surgery and stereotaxic injection | |
stereotaxic frame | Kopf | surgery and stereotaxic injection | |
Rectal probe and heating pad | FHC | 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe | surgery and stereotaxic injection |
optical breadboard for imaging | Thorlabs | surgery and stereotaxic injection | |
Mineral oil | Fisher | S55667 | surgery and stereotaxic injection |
Kwik-Cast (Silicone elastomer) | World Precision Instruments | surgery and stereotaxic injection | |
Suture | Ethicon | 18’’, 1667, 4-0 | surgery and stereotaxic injection |
Scissors | Fine Scientific Tools | 91500-09, 15018-10 | surgery and stereotaxic injection |
Forcepts | Fine Scientific Tools | 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 | surgery and stereotaxic injection |
Student Halsted-Mosquito Hemostats | Fine Scientific Tools | 91308-12 | surgery and stereotaxic injection |
Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Scientific Tools | 18000-00 | surgery and stereotaxic injection |
Hot Bead Sterilizers | Fine Scientific Tools | 18000-45 | surgery and stereotaxic injection |
Instrument Case with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20311-21 | surgery and stereotaxic injection |
Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20810-01 | surgery and stereotaxic injection |
2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging | Olympus | FV1200 MPE | in vivo imaging |
Multiphoton laser | SpectraPhysics | Mai Tai DeepSee | in vivo imaging |
Green Laser | Olympus | 473 nm Laser | in vivo imaging |
xy translation base | Scientifica | MMBP | in vivo imaging |
FRET filter cube for YFP and CFP | Olympus | in vivo imaging | |
25-X water immersion objective | Olympus | in vivo imaging | |
air table | Newport | in vivo imaging | |
custom built light-tight cage | Thorlab | in vivo imaging |