Vi presentiamo un protocollo per creare celle a base di neurotrasmettitore fluorescenti reporter ingegnerizzati (CNiFERs) per la rilevazione ottica del rilascio di neurotrasmettitore volumetrico.
Basate sulle cellule neurotrasmettitore fluorescenti reporter ingegnerizzati (CNiFERs) fornire un nuovo strumento per i neuroscienziati di rilevare visivamente il rilascio di neurotrasmettitori nel cervello in vivo. Una specifica CNiFER è creata da una cellula embrionali renali umane che esprime stabilmente uno specifico recettore accoppiato alla proteina G, che le coppie di G q / 11 proteine G, e un FRET-based Ca 2+ -detector, TN-XXL. L'attivazione del recettore porta ad un aumento nel segnale FRET. CNiFERs hanno una sensibilità nm e una risposta temporale di secondi perché un clone CNiFER utilizza il recettore nativo per un particolare neurotrasmettitore, ad esempio, D2R per la dopamina. CNiFERs sono direttamente impiantati nel cervello, consentendo loro di percepire il rilascio di neurotrasmettitore con una risoluzione spaziale di meno di cento micron, che li rende ideali per misurare il volume di trasmissione in vivo. CNiFERs può anche essere usata per selezionare altri farmaci per il potenziale reattività incrociata in vivo. Recentemente abbiamo ampliato la famiglia di CNiFERs per includere GPCR quella coppia a G I / O G proteine. CNiFERs sono disponibili per rilevare acetilcolina (ACh), dopamina (DA) e noradrenalina (NE). Dato che ogni GPCR può essere utilizzato per creare un romanzo CNiFER e che ci sono circa 800 GPCR nel genoma umano, che descriviamo qui la procedura generale per progettare, realizzare e testare qualsiasi tipo di CNiFER.
Per comprendere appieno come i neuroni comunicano nel cervello, è necessario disporre di un metodo per misurare il rilascio di neurotrasmettitori in vivo. Ci sono diverse tecniche consolidate per la misurazione neurotrasmettitori in vivo. Una tecnica comunemente usata è microdialisi, in cui una cannula viene inserita nel cervello e un piccolo volume di liquido cerebrospinale viene raccolto ed analizzato mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni e rilevazione elettrochimica 1. Microdialisi ha una risoluzione spaziale dell'ordine di pochi diametri della sonda, ad esempio, ~ 0,5 mm per una microsonda 200 micron di diametro. La risoluzione temporale di questa tecnica, tuttavia, è lento a causa di intervalli di campionamento che tipicamente durano ~ 5 minuti o più 1. Inoltre, le analisi non sono fatti in tempo reale. Un'altra tecnica è scansione veloce voltammetria ciclica (FSCV), che utilizza una sonda in fibra di carbonio che viene inserito nel cervello. FSCV ha eccellenti temperaturaRisoluzione orale (in frazioni), alta sensibilità (nanomolari), e la risoluzione spaziale con diametri della sonda da 5 a 30 micron. Tuttavia, FSCV è limitato ai trasmettitori che producono ossidazione caratteristico profilo riduzione con tensione su una sonda potenziometrica carbonio 2.
Una terza tecnica per misurare neurotrasmettitori è direttamente attraverso neurotrasmettitori geneticamente codificato biosensori (NT) 3. Con questo metodo, una proteina di fusione viene creato che contiene un dominio ligando vincolante per un trasmettitore accoppiato ad un trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) accoppiamento sede di fluorofori 4 o un GFP permutati 5. A differenza delle precedenti due metodi, questi biosensori sono geneticamente codificati ed espressi sulla superficie di una cellula ospite, come un neurone, attraverso la produzione di animali transgenici o acutamente con l'uso di agenti virali per infettare le cellule. Fino ad oggi, biosensori geneticamente codificati sono stati sviluppati solo per detecting glutammato e GABA 3-5. Limitazioni con queste tecniche sono la bassa sensibilità, nell'intervallo nM, e l'incapacità di espandere il rilevamento del gran numero di trasmettitori, ad esempio, neurotrasmettitori classici, neuropeptidi e neuromodulatori, che segnalano attraverso recettori accoppiati alla proteina G (GPCR). In realtà, ci sono quasi 800 GPCR nel genoma umano.
Per far fronte a queste carenze, abbiamo sviluppato uno strumento innovativo per misura rilascio otticamente di qualsiasi neurotrasmettitore che segnala attraverso un GPCR. CNiFERs (neurotrasmettitore fluorescenti a base di cellule reporter ingegnerizzati) sono cellule HEK293 clonali ingegnerizzate per esprimere un GPCR specifico che, quando stimolato, provoca un aumento intracellulare [Ca 2+] che viene rilevata da un sensore geneticamente codificato FRET-based Ca 2+, TN-XXL. Così, CNiFERs trasformare recettore neurotrasmettitore vincolante in un cambiamento della fluorescenza, fornendo un r ottica tempo reale diretta eead-out di attività neurotrasmettitore locale. Utilizzando il recettore nativo per un determinato neurotrasmettitore, CNiFERs conservano la specificità chimica, affinità e dinamiche temporali dei recettori endogenamente espressi. Ad oggi, abbiamo creato tre tipi di CNiFERs, uno per rilevare acetilcolina usando il recettore M1, uno per rilevare dopamina utilizzando il recettore D2, e uno per rilevare noradrenalina usando l'6,7 recettore tipo a1A. La tecnologia CNiFER è facilmente espandibile e scalabile, rendendolo suscettibile a qualsiasi tipo di GPCR. In questo articolo Giove, descriviamo e illustrare la metodologia per la progettazione, la realizzazione, e la prova CNiFERs vivo per qualsiasi applicazione.
La creazione di CNiFERs fornisce una strategia innovativa e unica per misurare otticamente rilascio di neurotrasmettitori nel cervello in vivo. CNiFERs sono ideali per misurare il rilascio extrasinaptica, vale a dire, il volume di conduzione, per neurotrasmettitori. È importante sottolineare che ogni CNiFER possiede le proprietà del GPCR nativa, fornendo una misurazione ottica fisiologica dei cambiamenti nei livelli di neurotrasmettitori nel cervello. Fino ad oggi, sono stati creati per la rilevazion…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo B. Conklin (University of California, San Francisco) per fornire i qi5 G e G QS5 cDNA, A. Schweitzer per l'assistenza con l'elettronica, N. Taylor per l'assistenza con lo screening di cloni, Ian Glaaser e Robert Rifkin per correzione di bozze , e Olivier Griesbeck per TN-XXL. Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca attraverso l'Istituto nazionale degli Stati Uniti on Drug Abuse (NIDA) (DA029706; DA037170), l'Istituto Nazionale di Biomedical Imaging e Bioingegneria (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) e il "Neuroscience correlati alla droga di concessione di abuso "formazione attraverso NIDA (DA007315).
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro | System Biosciences | CD510B-1 | Cloning: for generating lentivirus |
12×75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube | BD Biosciences | 352063 | FACS |
BD 40 um Falcon cell strainers | BD Biosciences | 352340 | FACS |
0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200056 | FACS |
96 Well Plate, flat bottom, clear | Corning | 3596 | FACS |
96 well cell culture plates | Corning | CLS3997 | Flexstation |
Optilux black clear bottom | Corning | 3603 | Flexstation |
Flexstation pipet tips | Molecular Devices | 9000-0911 | Flexstation |
Acetylcholine Chloride | SimgaAldrich | A2661 | Flexstation |
Norepinephrine | SimgaAldrich | A7256 | Flexstation |
Dopamine Hydrochloride | SimgaAldrich | PHR1090 | Flexstation |
GABA | SimgaAldrich | A2129 | Flexstation |
Histamine | SimgaAldrich | H7125 | Flexstation |
Glutamate | SimgaAldrich | 49621 | Flexstation |
Epinephrine | SimgaAldrich | E4642 | Flexstation |
Somatostatin | SimgaAldrich | S1763 | Flexstation |
5HT | SimgaAldrich | H9523 | Flexstation |
VIP | Alpha Diagnostics Inc. | SP-69627 | Flexstation |
Orexin A | Alpha Diagnostics Inc. | 12-p-01 | Flexstation |
Substance P | SimgaAldrich | S6883 | Flexstation |
Adenosine | SimgaAldrich | A4036 | Flexstation |
Melatonin | SimgaAldrich | M5250C | Flexstation |
Fluorescence Plate Reader & software | Molecular Devices | Flexstation 3 | Flexstation |
DMEM (high glucose) with Glutamax | Life Technologies | 10569-010 | Tissue culture |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-139 | Tissue culture |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Tissue culture |
Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | Tissue culture |
Fibronectin | SimgaAldrich | F0895 | Tissue culture |
CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box | Bioexpress | D-3508) | Tissue culture |
cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite no. 495 | surgery and stereotaxic injection |
plastic paraffin film | VWR | Parafilm® | surgery and stereotaxic injection |
NANOINJECTOR | Drummond | 3-000-204 | surgery and stereotaxic injection |
GLASS ELECTRODES | Drummond | 3-000-203G | surgery and stereotaxic injection |
hand held drill | OSADA | Exl-M40 | surgery and stereotaxic injection |
Burrs for drill | Fine Scientific | 19007-05; 19007-07) | surgery and stereotaxic injection |
Sterilizing bath | FST | 18000-45, Hot Bead Sterilizer | surgery and stereotaxic injection |
isoflurane chamber/mask | Highland Medical Equipment | 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm | surgery and stereotaxic injection |
3D scope with arm | Zeiss | surgery and stereotaxic injection | |
fiber optic light | surgery and stereotaxic injection | ||
Betadine | surgery and stereotaxic injection | ||
70 % (v/v) isopropyl alcohol | surgery and stereotaxic injection | ||
Povidone-Iodine Prep Pads | dynarex | 1108 | surgery and stereotaxic injection |
NaCl 0.9% (INJECTION, USP, 918610) | surgery and stereotaxic injection | ||
CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) | surgery and stereotaxic injection | ||
Buprenex (INJECTION) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) | Sigma | surgery and stereotaxic injection | |
Ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | surgery and stereotaxic injection |
Surgifoam | Ethicon | surgery and stereotaxic injection | |
Grip dental cement | Dentsply | #675571, 675572 | surgery and stereotaxic injection |
Instant SuperGlue | NDindustries | surgery and stereotaxic injection | |
LOCTITE 4041 | surgery and stereotaxic injection | ||
METABOND | C&B | surgery and stereotaxic injection | |
no. 0 cover glass | Fisher | surgery and stereotaxic injection | |
stereotaxic frame | Kopf | surgery and stereotaxic injection | |
Rectal probe and heating pad | FHC | 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe | surgery and stereotaxic injection |
optical breadboard for imaging | Thorlabs | surgery and stereotaxic injection | |
Mineral oil | Fisher | S55667 | surgery and stereotaxic injection |
Kwik-Cast (Silicone elastomer) | World Precision Instruments | surgery and stereotaxic injection | |
Suture | Ethicon | 18’’, 1667, 4-0 | surgery and stereotaxic injection |
Scissors | Fine Scientific Tools | 91500-09, 15018-10 | surgery and stereotaxic injection |
Forcepts | Fine Scientific Tools | 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 | surgery and stereotaxic injection |
Student Halsted-Mosquito Hemostats | Fine Scientific Tools | 91308-12 | surgery and stereotaxic injection |
Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Scientific Tools | 18000-00 | surgery and stereotaxic injection |
Hot Bead Sterilizers | Fine Scientific Tools | 18000-45 | surgery and stereotaxic injection |
Instrument Case with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20311-21 | surgery and stereotaxic injection |
Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20810-01 | surgery and stereotaxic injection |
2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging | Olympus | FV1200 MPE | in vivo imaging |
Multiphoton laser | SpectraPhysics | Mai Tai DeepSee | in vivo imaging |
Green Laser | Olympus | 473 nm Laser | in vivo imaging |
xy translation base | Scientifica | MMBP | in vivo imaging |
FRET filter cube for YFP and CFP | Olympus | in vivo imaging | |
25-X water immersion objective | Olympus | in vivo imaging | |
air table | Newport | in vivo imaging | |
custom built light-tight cage | Thorlab | in vivo imaging |