Vi presenterar ett protokoll för att skapa cellbaserad signalsubstans fluorescerande manipulerade reportrar (CNiFERs) för optisk detektering av volymetriska neurotransmittorfrisättning.
Cellbaserad signalsubstans fluorescerande manipulerade reportrar (CNiFERs) tillhandahålla ett nytt verktyg för neuroforskare att optiskt detektera frisättningen av signalsubstanser i hjärnan in vivo. En specifik CNiFER skapas från en human embryonal njurcell som stabilt uttrycker en specifik G-proteinkopplade receptorer, som kopplas till Gq / 11 G-proteiner, och en FRET-baserad Ca2 + -detector, TN-XXL. Aktivering av receptorn leder till en ökning i FRET-signalen. CNiFERs har nM känslighet och en tids svar sekunder eftersom en CNiFER klon utnyttjar den nativa receptorn för en viss signalsubstans, till exempel, D2R för dopamin. CNiFERs direkt implanteras i hjärnan, så att de kan känna frisättningen av neurotransmittorer med en rumslig upplösning på mindre än hundra um, vilket gör dem idealiska för att mäta volym överföring in vivo. CNiFERs kan också användas för att screena andra droger för potentiell korsreaktivitet i vivo. Vi utökade nyligen familjen CNiFERs att inkludera GPCR som kopplar till Gi / o G-proteiner. CNiFERs finns tillgängliga för detektering av acetylkolin (ACh), dopamin (DA) och norepinefrin (NE). Med tanke på att alla GPCR kan användas för att skapa en ny CNiFER och att det finns ungefär 800 GPCR i det mänskliga genomet, beskriver vi här det allmänna förfarandet för att utforma, förverkliga och testa någon typ av CNiFER.
För att till fullo förstå hur nervceller kommunicerar i hjärnan, är det nödvändigt att ha en metod för att mäta frisättningen av signalsubstanser in vivo. Det finns flera väletablerade metoder för att mäta signalsubstanser in vivo. En vanligen använd teknik är mikrodialys, i vilket en kanyl införes in i hjärnan och en liten volym av cerebrospinalvätska uppsamlas och analyseras med användning av HPLC och elektrokemisk detektion 1. Mikrodialys har en rumslig upplösning av storleksordningen några få diametrar av sonden, t.ex., ~ 0,5 mm för en mikrosond 200 ^ m diameter. Den temporala upplösningen av denna teknik är emellertid långsamt på grund av provtagningsintervall som vanligtvis varar ~ 5 min eller längre en. Dessutom är analyser inte görs i realtid. En annan teknik är snabb scanning cyklisk voltametri (FSCV), som använder en kolfiber sond som sätts in i hjärnan. FSCV har utmärkt temporal upplösning (subsecond), hög känslighet (nanomolar) och spatial upplösning med sond diametrar av 5 till 30 ^ m. Dock är FSCV begränsad till sändare som producerar en karakteristisk oxidation och reduktion profil med spänning på ett kol potentiometrisk prob 2.
En tredje teknik för att mäta signalsubstanser är direkt genom genetiskt kodad neurotransmittor (NT) biosensorer 3. Med denna metod, är ett fusionsprotein som skapats som innehåller en ligand-bindande domän för en sändare som är kopplad till en fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) -baserad par av fluoroforer 4 eller en permuterade GFP 5. Till skillnad från de två föregående metoderna är dessa biosensorer genetiskt kodas och uttryckas på ytan av en värdcell, såsom en neuron, genom produktionen av transgena djur eller akut med användningen av virala medel för att infektera celler. Hittills har genetiskt kodade biosensorer har endast utvecklats för detecting glutamat och GABA 3-5. Begränsningar med dessa tekniker har varit den låga känsligheten, i nM-området, och oförmågan att expandera detekteringen till det stora antal sändare, t.ex. klassiska neurotransmittorer, neuropeptider och neuromodulatorer, som signalerar genom G-proteinkopplade receptorer (GPCR). I själva verket finns det nästan 800 GPCR i det mänskliga genomet.
För att åtgärda dessa brister, har vi utvecklat ett innovativt verktyg för att optiskt mått frisättning av någon signalsubstans som signalerar genom en GPCR. CNiFERs (cellbaserad signalsubstans fluorescerande manipulerade reportrar) är klonala HEK293-celler manipulerade för att uttrycka en specifik GPCR som, när de stimuleras, utlöser en ökning av intracellulär [Ca2 +] som detekteras av en genetiskt kodad FRET-baserade Ca2 + sensor, TN-XXL. Sålunda CNiFERs omvandla neurotransmittorreceptorbindning in i en förändring i fluorescens, vilket ger en direkt och i realtid optiska read-slut lokal neurotransmittoraktivitet. Genom att utnyttja den nativa receptorn för ett givet neurotransmittor, CNiFERs behålla den kemiska specificitet, affinitet och tidsmässig dynamik hos de endogent uttryckta receptorer. Till dags dato har vi skapat tre typer av CNiFERs, en för detektering av acetylkolin med hjälp av M1-receptorn, en för att detektera dopamin med hjälp av D2-receptorn, och ett för att detektera noradrenalin med hjälp av a1a receptor 6,7. Den CNiFER tekniken är lätt expanderbar och skalbar, vilket gör det mottagligt för någon typ av GPCR. I detta JUPITER artikeln beskriver vi och illustrerar metoden att utforma, förverkliga och testa in vivo CNiFERs för alla program.
Skapandet av CNiFERs erbjuder en innovativ och unik strategi för att optiskt mäta frisättning av signalsubstanser i hjärnan in vivo. CNiFERs är idealiskt lämpade för att mäta extrasynaptic release, dvs volymledning, för neurotransmittorer. Viktigare, varje CNiFER besitter egenskaperna hos den nativa GPCR, vilket ger en fysiologiskt optisk mätning av förändringarna i nivåer av signalsubstanser i hjärnan. Hittills har CNiFERs skapats för att detektera acetylkolin (M1-CNiFER) 6, …
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar B. Conklin (University of California, San Francisco) för att ge G qi5 och G qs5 cDNA, A. Schweitzer för att få hjälp med elektroniken, N. Taylor för att få hjälp med screening av kloner, Ian Glaaser och Robert Rifkin för korrekturläsning och Olivier Griesbeck för TN-XXL. Detta arbete stöddes av forskningsanslag genom US National Institute on Drug Abuse (NIDA) (DA029706, DA037170), National Institute of Biomedical Imaging och Bioengineering (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) och "Neuroscience relaterade till droger "utbildningsstipendium genom NIDA (DA007315).
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro | System Biosciences | CD510B-1 | Cloning: for generating lentivirus |
12×75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube | BD Biosciences | 352063 | FACS |
BD 40 um Falcon cell strainers | BD Biosciences | 352340 | FACS |
0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200056 | FACS |
96 Well Plate, flat bottom, clear | Corning | 3596 | FACS |
96 well cell culture plates | Corning | CLS3997 | Flexstation |
Optilux black clear bottom | Corning | 3603 | Flexstation |
Flexstation pipet tips | Molecular Devices | 9000-0911 | Flexstation |
Acetylcholine Chloride | SimgaAldrich | A2661 | Flexstation |
Norepinephrine | SimgaAldrich | A7256 | Flexstation |
Dopamine Hydrochloride | SimgaAldrich | PHR1090 | Flexstation |
GABA | SimgaAldrich | A2129 | Flexstation |
Histamine | SimgaAldrich | H7125 | Flexstation |
Glutamate | SimgaAldrich | 49621 | Flexstation |
Epinephrine | SimgaAldrich | E4642 | Flexstation |
Somatostatin | SimgaAldrich | S1763 | Flexstation |
5HT | SimgaAldrich | H9523 | Flexstation |
VIP | Alpha Diagnostics Inc. | SP-69627 | Flexstation |
Orexin A | Alpha Diagnostics Inc. | 12-p-01 | Flexstation |
Substance P | SimgaAldrich | S6883 | Flexstation |
Adenosine | SimgaAldrich | A4036 | Flexstation |
Melatonin | SimgaAldrich | M5250C | Flexstation |
Fluorescence Plate Reader & software | Molecular Devices | Flexstation 3 | Flexstation |
DMEM (high glucose) with Glutamax | Life Technologies | 10569-010 | Tissue culture |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-139 | Tissue culture |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Tissue culture |
Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | Tissue culture |
Fibronectin | SimgaAldrich | F0895 | Tissue culture |
CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box | Bioexpress | D-3508) | Tissue culture |
cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite no. 495 | surgery and stereotaxic injection |
plastic paraffin film | VWR | Parafilm® | surgery and stereotaxic injection |
NANOINJECTOR | Drummond | 3-000-204 | surgery and stereotaxic injection |
GLASS ELECTRODES | Drummond | 3-000-203G | surgery and stereotaxic injection |
hand held drill | OSADA | Exl-M40 | surgery and stereotaxic injection |
Burrs for drill | Fine Scientific | 19007-05; 19007-07) | surgery and stereotaxic injection |
Sterilizing bath | FST | 18000-45, Hot Bead Sterilizer | surgery and stereotaxic injection |
isoflurane chamber/mask | Highland Medical Equipment | 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm | surgery and stereotaxic injection |
3D scope with arm | Zeiss | surgery and stereotaxic injection | |
fiber optic light | surgery and stereotaxic injection | ||
Betadine | surgery and stereotaxic injection | ||
70 % (v/v) isopropyl alcohol | surgery and stereotaxic injection | ||
Povidone-Iodine Prep Pads | dynarex | 1108 | surgery and stereotaxic injection |
NaCl 0.9% (INJECTION, USP, 918610) | surgery and stereotaxic injection | ||
CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) | surgery and stereotaxic injection | ||
Buprenex (INJECTION) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) | Sigma | surgery and stereotaxic injection | |
Ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | surgery and stereotaxic injection |
Surgifoam | Ethicon | surgery and stereotaxic injection | |
Grip dental cement | Dentsply | #675571, 675572 | surgery and stereotaxic injection |
Instant SuperGlue | NDindustries | surgery and stereotaxic injection | |
LOCTITE 4041 | surgery and stereotaxic injection | ||
METABOND | C&B | surgery and stereotaxic injection | |
no. 0 cover glass | Fisher | surgery and stereotaxic injection | |
stereotaxic frame | Kopf | surgery and stereotaxic injection | |
Rectal probe and heating pad | FHC | 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe | surgery and stereotaxic injection |
optical breadboard for imaging | Thorlabs | surgery and stereotaxic injection | |
Mineral oil | Fisher | S55667 | surgery and stereotaxic injection |
Kwik-Cast (Silicone elastomer) | World Precision Instruments | surgery and stereotaxic injection | |
Suture | Ethicon | 18’’, 1667, 4-0 | surgery and stereotaxic injection |
Scissors | Fine Scientific Tools | 91500-09, 15018-10 | surgery and stereotaxic injection |
Forcepts | Fine Scientific Tools | 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 | surgery and stereotaxic injection |
Student Halsted-Mosquito Hemostats | Fine Scientific Tools | 91308-12 | surgery and stereotaxic injection |
Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Scientific Tools | 18000-00 | surgery and stereotaxic injection |
Hot Bead Sterilizers | Fine Scientific Tools | 18000-45 | surgery and stereotaxic injection |
Instrument Case with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20311-21 | surgery and stereotaxic injection |
Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20810-01 | surgery and stereotaxic injection |
2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging | Olympus | FV1200 MPE | in vivo imaging |
Multiphoton laser | SpectraPhysics | Mai Tai DeepSee | in vivo imaging |
Green Laser | Olympus | 473 nm Laser | in vivo imaging |
xy translation base | Scientifica | MMBP | in vivo imaging |
FRET filter cube for YFP and CFP | Olympus | in vivo imaging | |
25-X water immersion objective | Olympus | in vivo imaging | |
air table | Newport | in vivo imaging | |
custom built light-tight cage | Thorlab | in vivo imaging |