Abstract
Während die Transkriptionsregulation der Protein-kodierenden Gene ausgiebig untersucht wurde, ist nur wenig bekannt darüber, wie Transkriptionsfaktoren in der Transkription von nicht-kodierenden RNAs beteiligt sind, insbesondere von Mikro-RNAs. Hier schlagen wir eine Strategie, um die potentielle Rolle des Transkriptionsfaktors zu studieren an der Transkription von microRNAs regulieren öffentlich verfügbaren Daten, Rechenressourcen und hohem Durchsatz Daten. Wir verwenden die epigenetischen Signatur H3K4me3 zu microRNA Promotoren und Chromatinimmunpräzipitation (Chip-) -sequencing Daten aus dem ENCODE-Projekt identifizieren zu microRNA Promotoren zu identifizieren, die mit Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen angereichert sind. Durch Transfektion von Zellen von Interesse mit shRNA einen Transkriptionsfaktor von Interesse und Aussetzen der Zellen an microRNA Array Targeting untersuchen wir die Wirkung dieses Transkriptionsfaktors auf der microRNA Transkriptom. Als anschauliches Beispiel verwenden wir unsere Studie über die Wirkung von STAT3 auf der microRNA Transkriptom der chronischen lymphocytic Leukämie (CLL) Zellen.
Introduction
MicroRNAs sind endogene kleine, nicht kodierende regulatorische RNAs, die typischerweise als negative Regulatoren der mRNA-Expression auf der posttranskritionelle Ebene funktionieren. Etwa 1000 nicht-codierende 20 bis 25 Nucleotide langen mikroRNAs im menschlichen Genom zu finden sind 1,2. MicroRNAs regulieren die Genexpression durch kanonische Basenpaarungen zwischen dem Keimsequenz des mikroRNA und sein komplementärer seed Übereinstimmung Sequenz, die üblicherweise am 3'-untranslatierten Region (UTR) der Ziel-mRNAs befindet. Zusammenfassend regulieren mikroRNAs mehr als 30% der Protein - codierenden Gene 3, aber nur wenig über die Transkription von DNA von mikroRNAs bekannt. Es wurde vorgeschlagen, dass die Regulation der Transkription MikroRNA , die der mRNA 4,5 ähnlich ist. Insbesondere ähnlich wie seine Aktivität Transkription von Protein - kodierenden Gene bei der Förderung, sind Transkriptionsfaktoren gedacht 6 Transkription von microRNAs zu aktivieren. Der Transkriptionsfaktor-microRNA Zusammenspiel wurde als Modulator Faktor der Genexpression 7, berichtet und kann auch Feedback- und Feedforward - Schleifen bilden. Zum Beispiel Yamakuchi et al. Berichteten von einer Rückkopplungsschleife , in der p53 die Expression von microRNA34a induziert, die wiederum Translation des p53 - Repressor SIRT hemmt und dadurch Erhöhung p53 Aktivität 8.
Während spezifische Beispiele von Transkriptionsfaktor-abhängige Expression von microRNAs berichtet worden, die eine anerkannte Methode, um Informationen darüber, wie ein Transkriptionsfaktor von Interesse reguliert die Expression des microRNA-Transkriptom bietet fehlt. Der Zweck des Protokolls hier vorgeschlagen ist, eine eingehende Beschreibung der Transkriptionsfaktor-abhängige Regulation der microRNA-Transkriptom zu liefern. öffentlich verfügbaren Daten, Bioinformatik-Tools Durch die Kombination und Microarray-Technologie, die Forscher, die diesen Algorithmus folgen zu erfassen wäre in der Lage zu einer genomischen Maßstab, wie jederTranskriptionsfaktor in jedem Zelltyp von Interesse reguliert die Expression des microRNA-Transkriptom und ein mutmaßliches Beitrag des Transkriptionsfaktors-mRNA bei der Regulierung der microRNA Ausdruck zu erkunden.
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Protocol
1. Identifizieren Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen in dem Promoter von microRNA Gene, Data Mining-Ansatz
- Verwenden Sie die University of California Santa Cruz (UCSC) Genom-Browser Chromatinimmunpräzipitation (CHIP) Sequenzierungsdaten als Teil der Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) Projekt erzeugt zu extrahieren.
- Öffnen Sie die Tabelle Browser im UCSC Genom-Browser.
- Verwenden Sie die folgenden Spezifikationen, die Tabelle zu extrahieren: Clade: (Säugetiere), Genom: (Mensch), Montage: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), Gruppe: (Verordnung), Schiene (TxnFactorChIP), Tabelle: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), Region : (Genome), Ausgabeformat (alle aus ausgewählten Tabelle Gene).
- Speichern Sie die Ausgabe von 1.1.2 als TXT-Datei und in eine Tabelle.
- Sortieren und Filtern für den Transkriptionsfaktor von Interesse (zB STAT2).
- Verwenden Sie die Liste von microRNA Vermittler auf Basis von H3K4me3 Epigenetik Signatur verfügbar bei Baeer et al. 9
- Zur Anpassung nach Koordinaten auf dem menschlichen Genom, zeichnen sie die Daten von 1.1 und 1.2 (zB Bindung von STAT3 auf mutmaßliche microRNA - Promotoren) und bestimmen Sie die mittlere Bindungsaffinität mit dem Code in C geschrieben scharf wie in ergänzenden skizzierte Codierung Datei 1.
2. Verwenden Sie shRNA Down-Regulierung der Expression eines Transkriptionsfaktors von Interesse
- Platte 1.5 x 10 6 Zellen von humanen embryonalen 293 - Nierenzelllinie in 10 cm Platte bei etwa 50% Konfluenz (DMEM mit 10% FBS).
- Transfizieren Zellen von humanen embryonalen 293-Nierenzelllinie mit 5 ug grüne Fluoreszenz-Protein (GFP) Lentivirus shRNA enthält gerichtet an den Transkriptionsfaktor von Interesse und mit 5 ug Verpackungsvektoren Transfektionsreagenz für adhärente Zellen unter Verwendung von dem Protokoll des Herstellers entsprechend.
- Als Kontrolle mit den Zellen aus 293 menschlichen embryonalen Nierenzelllinie zu transfizierenverwürfelten shRNA und die Verpackungsvektoren dem Protokoll des Herstellers entsprechend.
- Halten Sie Transfektionsgemisch auf Zellen für 16 Stunden (bei 37 ° C, CO 2 Inkubator), dann wird ein neues Medium 10% DMEM - Medium mit 10% FBS auf 10 ml geändert werden .
- Warten Sie 48 Stunden nach der Transfektion Zentrifugation der Zellkultur (300 × g, 5 min) und sammeln infektiösen Überstand. Filtriere den Überstand durch ein 0,45 & mgr; m-Spritzenfilter (25 mm tensidfrei Celluloseacetat-Membran), um alle schwebenden Zellen zu entfernen.
- Konzentrieren Sie den Überstand und sammeln die Lentiviren ein Ultrazentrifugalmühle Filtervorrichtung mit Schwellenwert von 100 kDa. Spin bei 950 xg für 30 - 60 min, bis das Volumen hat Konzentrats auf weniger als 250 & mgr; l. Lagern Sie das konzentrierte Virus bei -80 ° C.
- Transfizieren der Zellen mit der lentivirus. Entfernen Sie gefrorene Lentiviren von -80 ° C Gefrierschrank und tauen auf Raumtemperatur. Übertragen Sie 100 ul Virusüberstand in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Bring das Volumen in dem Rohr zu 1 ml mit reduziertem Serum-Medium auf. In Hexadimethrinbromid zu 1 ml Virussuspension für die endgültige Konzentration von 10 ng / ml, vorsichtig mischen und lassen Sie die Mischung für 5 Minuten stehen.
- Zentrifuge 5 x 10 6 Zellen für jede Transduktion und sanft das Zellpellet in 0,5 ml Medium , das Virus resuspendieren. Lassen Sie die Zellen für 4 im Inkubator bleiben - 24 Stunden, dann wurden 0,5 ml Medium in einer Endkonzentration von 10% FBS mit 20% FBS hinzufügen.
- Warten Sie 48 bis 72 Stunden und färben die Zellen mit Propidiumiodid (PI) und grün fluoreszierendem Protein (GFP) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Schützen Sie die Zellen , die aus Licht und mit einem FACS - Sorter die Raten der GFP + / PI zu messen - Zellen. Da PI Flecken nur tote Zelle, ist diese Rate eine Schätzung der Transfektionseffizienz in lebenden Zellen.
- Sortieren Sie die positive Zellpopulation auf GFP - Expression (GFP +) durch FACS - Sorter wie zuvor 10 beschrieben.
- Verwenden Western Immun Blotting wie zuvor beschrieben 10 die Pegel eines Transkriptionsfaktors von Interesse vor und nach der Infektion der Zellen von Interesse (zB CLL - Zellen) mit den benannten shRNA zu bestimmen.
3. Bestimmen Sie die Expression von microRNA Transkriptom in Zellen, die mit Transcription Factor-shRNA
- Isolieren RNA Kommerzielle Kits nach Herstellerprotokoll.
- Beschriften Sie die RNA und hybridisieren es zu microRNA Microarray - 11.
- Bestimmen Sie die differentiell exprimierte microRNA in Zellen , die mit Transkriptionsfaktor-shRNA oder mit leerem Vektor Kontrollen 5.
- Überprüfen Sie die Microarray - Ergebnisse für die meisten differentiell exprimierten microRNAs unter Verwendung von Echtzeit - PCR - 5.
4. Bestimmen Sie die Überlappung zwischen den Bioinformatik und der shRNA-Ansatz in der Transkriptionsfaktor abhängige Transkriptom beschreiben
- detHermelin die erwarteten und beobachteten Verhältnisse von microRNA Gene , die Transkriptionsfaktor - Bindungsstellen in ihren Promotoren und wurden downregulated in Transkriptionsfaktor-shRNA transfizierten Zellen beherbergen, gehen Sie wie folgt vor :
- Beziehen Sie das Verhältnis von Genen, die den Transkriptionsfaktor von Interesse an ihrem Promotor / Gesamt microRNA aus der Liste erzeugt in 1.3 Hafen. Diese Liste ist das erwartete Verhältnis (zB microRNA Gene mit STAT3 - Bindungsstellen / Gesamt microRNA Gene getestet = 0,25).
- Bestimmen Sie die Anzahl von Genen , die in Transkriptionsfaktor-shRNA transfizierten Zellen aus der Liste in 3.3 erzeugt downregulated wurden und hat Transkriptionsfaktor von Interesse Bindungsstellen aus der Liste in 1.3 erzeugt. Diese Nummer / Gesamtzahl der nach unten reguliert Gene ist das beobachtete Verhältnis (zB microRNA Gene mit STAT3 sites / Gesamtzahl der downregulated microRNAs = 0,6 Bindung).
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Representative Results
STAT3 ist ein Transkriptionsfaktor , der typischerweise die Transkription von Genen induziert , die anti apoptotischen und proliferative Wirkungen 12. Ob STAT3 wirken sich auch auf die nicht-kodierende RNA Transkriptom derzeit nicht bekannt ist. In allen CLL - Zellen ist STAT3 konstitutiv phosphoryliert an Serin 707 Reste 10,13. Phosphoserin STAT3 Shuttles zum Kern, bindet an DNA und aktiviert Gene bekannt 10 durch Tyrosin pSTAT3 in anderen Zelltypen aktiviert werden. Da CLL durch globale Deregulierung des microRNA - Netzwerk 14 gekennzeichnet ist, die Hypothese aufgestellt , dass die Anwesenheit von Serin pSTAT3 die Expression von microRNAs in CLL - Zellen beeinflusst.
Um dies zu testen Förderer von microRNAs Hypothese, dass STAT3-Bindungsstellen Hafen hatte identifiziert werden. Durch die Daten , die von Baer et al kreuzen. 9 von Regionen mit dem H2K4me3 Histon modifiKation , das Promotorstellen zu charakterisieren, mit identifiziert durch ChIP-seq Experiment ermittelten Gebiete 15, mutmaßliche STAT3 - Bindungsstellen wurden STAT3 verbindlich. Mit diesem Ansatz 160 mutmaßliche Promotoren in fast 25% der microRNA Gene untersucht , entdeckt wurden (N = 200) mit Bindungs Noten im Bereich von 100 (die niedrigste Note) bis 1000 (die höchste Punktzahl) (Tabelle 1).
Anschließend CLL - Zellen wurden mit STAT3-shRNA oder mit einem leeren Vektor transfiziert und unter Verwendung von Array microRNA und identifiziert 63 microRNAs , die nach unten nach der Transfektion geregelt wurden (Abbildung 1) darauf hindeutet , dass STAT3 die Transkription dieser microRNAs fördert. 60% der 63 abreguliert mikroRNA-Gene (n = 38) -Chip-seq Daten bestätigt STAT3 in einer putativen Promotorbindungs stromauf der Genort, deutlich mehr als zufällig erwartet (p <0,0001). Neun microRNAs, die wurden herunterreguliert nach der Transfektionwas darauf hindeutet, dass STAT3 negativ seine Niveaus der Transkription regulieren.
Abbildung 1. Transfektion von CLL - Zellen mit STAT3-shRNA reduziert die Expression von STAT3 - Protein und STAT3 mRNA. A:. Nach der Transfektion von CLL - Zellen mit STAT3-shRNA Ebenen der STAT3 - mRNA (linkes Bild, nachgewiesen durch quantitative RT-PCR) und Ebenen des STAT3 - Protein (rechtes Bild, durch Western - Immunblot nachgewiesen) signifikant verringert B: microRNA Array von CLL Zellen 23 microRNAs, deren Expression dargestellt signifikant zwischen CLL-Zellen, die mit STAT3-shRNA und CLL-Zellen, die mit einem leeren Vektor unterschieden. P - Wert von weniger als 0,01 wurde als statistisch signifikant . C: Die mittlere Expression quantifiziert mittels RT-PCR von 7 microRNAs , die unterschiedliche Expression nach STAT3-shRNA Behandlung hatte die Verwendung vonmicroRNA Array. Die Balken stellen den Standardfehler des Mittelwerts. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Supplemental Coding - Datei 1. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.
| Micro - RNA - Gen | Chromosom | Promoter Startkoordinaten | Promoter Endkoordinaten | Median (Bereich) STAT3 Bindungswert * |
| miR-1205, miR-1206, miR-1207 | 8 q24.21 | 128961454 | 128962791 | 1000 (1000-1000) | 1 q42.3 | 236045425 | 236047415 | 1000 (1000-1000) |
| miR-21 | 17 q23.1 | 57901872 | 57921277 | 1000 (112-1000) |
| miR-3124 | 1 Q44 | 249115404 | 249123965 | 1000 (1000-1000) |
| miR-451 | 17q11.2 | 27222251 | 27224114 | 1000 (1000-1000) |
| miR-92b | 1 q22 | 155162340 | 155168439 | 1000 (1000-1000) |
| miR-3197 | 21 q22.2 | 42537544 | 42543023 | 943 (943-943) |
| miR-646 | 20 q13.33 | 58712550 | 58715320 | 789 (789-789) |
| miR-629 | 15 q23 | 70383751 | 70394586 | 773 (661-885) |
| miR-30e, miR-30c-1 | 1 p34.2 | 41173077 | 41177703 | 759 (759-759) |
| miR-3125 | 2 p24.3 | 12855381 | 12862915 | 756 (756-756) |
| miR-3145 | 6 q23.3 | 138776942 | 138779365 | 743 (487-1000) |
| miR-645 | 20 q13.13 | 49199911 | 49201187 | 743 (743-743) |
| miR-1256 | 1 p36.12 | 21346830 | 21350211 | 725 (725-725) |
| miR-619 | 12 q24.11 | 109248263 | 109253306 | 719 (719-719) |
| miR-181a-2, miR-181b-2 | 9 q33.3 | 127418928 | 127426139 | 710 (710-710) |
| miR-29a, miR-29b-1 | 7 q32.3 | 130583383 | 130597803 697 (482-1000) | |
| miR-202 | 10 q26.3 | 135069499 | 135077337 | 696 (393-1000) |
| miR-3142, miR-146a | 5 q34 | 159890882 | 159899475 | 671 (671-671) |
| miR-548c | 12 q14.2 | 65000968 | 65011503 | 660 (660-660) |
| miR-630 | 15 q24.1 | 72764289 | 72769197 | 627 (255-1000) |
| miR-135b | 1 q32.1 | 205416952 | 205452990 | 622 (245-1000) |
| miR-29c, miR-29b-2 | 1 q32.2 | 207991044 | 208002382 | 608 (608-608) |
| miR-1825 | 20 q11.21 | 30791020 | 30798310 | 604 (209-1000) |
| miR-548h-1 | 14 q23.2 | 64578834 | 64581657 | 587 (174-1000) |
| miR-612 | 11 q13.1 | 65183633 | 65198528 | 581 (157-1000) |
| miR-148b | 12 q13.13 | 54717640 | 54721204 | 578 (578-578) |
| miR-3174 | 15 q26.1 | 90543381 | 90549092 | 576 (152-1000) |
| let7a-3, let7b | 22 | 46480680 | 46481826 | 573 (146-1000) |
| miR-1255a | 4 q24 | 102263848 | 102272541 | 557 (557-557) |
Tabelle 1 : Vermeintliche microRNA Promotoren mit STAT3 - Bindungsstellen. Das Protokoll stellt eine Methode Transkriptionsfaktor zu identifizieren , auf mutmaßliche Promotoren von microRNAs Bindung unter Verwendung von Data - Mining von veröffentlichten Daten. Als Beispiel stellen wir hier eine Tabelle, die die Bindung von STAT3 zu vermeintlichen microRNA Promotoren darstellt. Die Bindung Punktzahl wird bei einer 0 bis 1000 Skala von gesamten Genoms ChIP seq Daten veröffentlicht als Teil des ENCODE - Projekt 15 gegeben. Die Promotoren werden durch die Anwesenheit der 9 epigenetischen Signatur H3K4me3 identifiziert.
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Discussion
Der Mechanismus der RNA-Polymerase II- abhängige Transkription von Protein-codierenden Genen zugrunde liegenden wurde ausgiebig untersucht. Während diese Elemente nur 1% ausmachen - 2% des menschlichen Genoms, Beweise aus dem ENCODE - Projekt legen nahe , dass mehr als 80% des menschlichen Genoms 17 Transkription unterzogen werden kann und was reguliert die Transkription der nicht-kodierenden DNA - Elemente , bleibt weitgehend unbekannt 6 .
Mehrere Studien, die zeigten , dass Pol II für die Transkription von einigen nicht-Protein-kodierenden Gene einschließlich microRNAs 6 zuständig ist, führte uns eine Strategie zu entwickeln , die Daten aus öffentlich verfügbaren Ressourcen, Rechenalgorithmen und in - vitro - Studien verbinden das Potenzial zu entziffern Funktion eines Transkriptionsfaktors von Interesse in der Transkription von microRNAs regulieren. Die Strategie vorgeschlagen umfasst hier zwei wichtige Schritte. Erstens verwenden wir öffentlich verfügbaren Daten Transkriptionsfaktor b zu identifiziereninding in microRNA Veranstalter. Zu diesem Zweck verwenden wir Chip-seq der ENCODE-Konsortium veröffentlichten Daten Transkriptionsfaktor-Bindungs und epigenetischen Signatur zu identifizieren, die Promoter als indirekter Marker der microRNA-Promoter versinnbildlicht. Quer durch die genetischen Koordinaten aus diesen Datensätzen stellt eine grobe Schätzung, wie häufig ein Transkriptionsfaktor von Interesse bindet an microRNA-Promotor. Zweite von shRNA-Technologie, die Expression eines Transkriptionsfaktors und Aussetzen der Zellen mikroRNA-Array zum Schweigen zu bringen, ist es möglich, die funktionelle Bedeutung eines Transkriptionsfaktors auf der MikroRNA-Transkriptom zu erkunden.
Die Variabilität in microRNA-Expression wird durch Transkriptionsfaktor abhängige Regelung nur teilweise erklärt. Stöchiometrische Variabilität und anderen zellulären oder extrazellulären Faktoren spielen eine wichtige Rolle und werden in dem vorgeschlagenen Algorithmus nicht simuliert. Weitere Einschränkungen sind die folgenden: Die Promotoranalyse auf der Basis der H3K4me3Unterschrift wurde auf 939 kommentierte microRNAs getan. Seitdem haben die genomische Standorte vieler mehr microRNAs identifiziert worden. Doch nach bestem Wissen eine umfassendere Liste, die auf einer aktualisierten Datenbank basiert wurde noch nicht veröffentlicht worden. Von den 939 microRNA Gene, die die H3K4me3 die Promotorregion typisiert wurde in 781 microRNA Gene (83%) identifiziert. Während also diese Analyse eindeutig auf einer unvollständigen Datensatzes basiert fängt es einen signifikanten Bruchteil der MikroRNA-Transkriptom.
Darüber hinaus ist die Epigenetik Unterschrift teilweise bedruckt und teilweise zellspezifisch. die generability mutmaßlicher Veranstalter deshalb, dass durch die Epigenetik Marker definiert wurden, können in Frage gestellt werden. Da H3K4me3 18 unabhängig von der Transkription weiterhin besteht ist es in der Regel eine Markierung der geprägten Promotoren betrachtet. Die analytische Algorithmus, den wir hier vorschlagen können daher zellspezifische microRNA Veranstalter verpassen, wenn diese Promotoren an einem anderen zell- identifiziert wurdenArt. Schließlich sollte jede Schlussfolgerung empirisch geprüft und bestätigt werden. Vor allem der Zusammenhang zwischen Down-Regulation eines Transkriptionsfaktors (unter Verwendung von shRNA-Ansatz) und microRNA-Expression (durch microRNA Array) kann nur eine direkte Transkriptions Rolle vorschlagen, die von akzeptablen Assays wie Chromatinimmunpräzipitation (Chip-) oder elektrophoretische Mobilität bestätigt werden sollte, Shift Assay (EMSA). Modifikationen der Verfahren vorgeschlagen hierin schließen verschiedene Möglichkeiten zur Identifizierung mikroRNA-Promotor und unterschiedliche Arten des Klopfens, die Expression eines Transkriptionsfaktors nach unten, beispielsweise kleine interferierende RNA anstelle von shRNA. Die Transkriptionsregulation von microRNAs kann für microRNAs wesentlich anders sein, die in Protein-kodierenden Gene befinden (intragenischen microRNAs) und diejenigen, die dies nicht tun (intergenic microRNAs). Da intragenischen microRNAs häufig in Verbindung mit ihren Wirtsgene transkribiert werden 19 der Promotor ist in der Regel sofort gefunden upstream die Transkriptionsstartstelle. Doch für viele intergenic microRNAs die Transkriptionsstartstelle schlecht bezeichnet ist, und die Vorhersage - Tools , die häufig für die Protein - kodierenden Gene sind schlecht durchführen 20.
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Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der CLL Global Research Foundation unterstützt. Die University of Texas MD Anderson Cancer Center wird zum Teil durch die National Institutes of Health durch ein Cancer Center Support-Grant (P30CA16672) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0.45 µm syringe filter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100 kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol reagent | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Cell line human | Sigma-Aldrich | 85120602 |
References
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