Abstract
단백질 코딩 유전자의 전사 조절이 광범위하게 연구 동안, 약간은 특히 마이크로 RNA 전사 인자가 비 코딩의 RNA 전사에 관여하는 방법에 공지되어있다. 여기서, 우리는 공개적으로 이용 가능한 데이터, 연산 리소스 및 높은 처리량 데이터를 이용하여 마이크로 RNA의 전사를 조절하는 전사 인자의 잠재적 인 역할을 연구하기위한 전략을 제안한다. 우리는 전사 인자 결합 부위에 충실 마이크로 RNA 프로모터를 식별 할 ENCODE 프로젝트에서 -sequencing 데이터를 마이크로 RNA 발기인 및 염색질 면역 침전 (칩)을 식별 할 H3K4me3 후생 유전 학적 서명을 사용합니다. shRNA를 관심 전사 인자 타겟팅 및 마이크로 RNA 배열 셀을 실시하여 원하는 세포를 형질 감염함으로써, 우리는 마이크로 RNA 전 사체에서이 전사 인자의 효과를 연구한다. 예시 예를 들어 우리는 만성 만민의 마이크로 RNA 전 사체에 STAT3의 효과에 대한 연구를 사용mphocytic 백혈병 (CLL) 세포.
Introduction
마이크로 RNA는 일반적으로 전사 후 수준에서 mRNA 발현의 부정적인 레귤레이터 기능 내생 작은 비 코딩 규제 RNA를합니다. 약 1,000 비 코딩 긴 마이크로 RNA가 인간 게놈 1,2에서 발견되는 20 뉴클레오티드 25. 마이크로 RNA는 통상 3 '비 번역 영역 대상의 mRNA (UTR)에있는 마이크로 RNA와 상보 시드 일치 서열의 시드 서열 간의 정규 염기쌍을 통해 유전자 발현을 조절한다. 종합적으로, 마이크로 RNA는 단백질 코딩 유전자 (3)의 30 % 이상을 조절하지만, 단지 작은 마이크로 RNA는 DNA로부터의 전사에 대해 공지되어있다. 이는 마이크로 RNA 전사의 조절이 mRNA의 4,5- 유사한 것으로 제안되었다. 특히, 단백질을 코딩하는 유전자의 전사를 촉진하는 활성과 유사하게, 전사 인자는 마이크로 RNA (6)의 전사를 활성화하는 것으로 생각된다. 전사 인자-microRNA의 작용 유전자 발현 (7)의 변조 요소로보고되었으며 수도 또한 피드백 및 피드 포워드 루프를 형성한다. 예를 들어, Yamakuchi 등 알.이 p53과 p53의 차례로 리프레 SIRT 환산하여 p53의 활성을 증가 8 억제 microRNA34a의 발현을 유도하는 피드백 루프를보고 하였다.
마이크로 RNA의 전사 인자 의존성 발현의 구체적인 예는보고 된 반면, 관심의 전사 인자는 마이크로 RNA-사체의 발현을 조절하는 방법에 관한 정보를 제공하는 방법으로 인정이 부족하다. 본 명세서에 제안 된 프로토콜의 목적은 마이크로 RNA-사체의 전사 인자 의존성 규제에 대해 자세히 설명한다. 공개적으로 이용 가능한 데이터, 생물 정보학 도구 결합 및 마이크로 어레이 기술을 사용하여이 알고리즘을 수행 연구자 게놈 규모에 캡처 할 수있는 얼마나관심 셀 타입의 전사 인자는 마이크로 RNA-사체의 발현을 조절하고 마이크로 RNA 발현을 조절하는 전사 인자의 mRNA의 기여도를 추정 탐색.
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Protocol
1. 데이터 마이닝 접근법을 사용하여 마이크로 RNA 유전자의 프로모터에서 전사 인자 바인딩 사이트를 확인
- DNA 요소 (ENCODE) 프로젝트의 백과 사전의 일부로서 생성 된 크로 마틴 면역 침강 (칩) 시퀀싱 데이터를 추출하기 위해 캘리포니아 대학 산타 크루즈 (UCSC) 게놈 브라우저를 사용합니다.
- UCSC 게놈 브라우저에서 테이블 브라우저를 엽니 다.
- 테이블을 추출하기 위해 다음과 같은 사양을 사용하여 계통 군 (포유류), 게놈 (인간), 조립 (Feb2009 (GRch37 / hg18)), 그룹 (규제), 트랙 (TxnFactorChIP을), 테이블 (weEncoderesTFbsCo7steredv3), 지역 (게놈), 출력 형식 (선택 테이블에서 모든 유전자).
- .txt 파일로 스프레드 시트에 1.1.2의 출력을 저장합니다.
- 관심있는 전사 인자 (예를 들어, STAT2)에 대한 정렬 및 필터.
- Baeer 등에서 사용할 수 H3K4me3의 후성 유전학 서명을 기반으로 마이크로 RNA 프로모터의 목록을 사용합니다. (9)
- 인간 게놈의 좌표에 따른 일치 (예를 들어, STAT3은 추정 마이크로 RNA 프로모터에 결합) 1.1 및 1.2에서 데이터를 매핑 파일 1 코딩 기업에서 설명한 바와 같이 날카로운 C에 기록 된 코드를 이용하여 평균 결합 친화도를 결정한다.
2. 사용의 shRNA 관심의 전사 인자의 발현을 다운 조절
- 플레이트에서 약 50 % 합류 (DMEM, 10 % FBS)와 10cm 플레이트에서 293 인간 배아 신장 세포주에서 1.5 × 106 세포.
- shRNA를 함유 녹색 형광 단백질 (GFP) 렌티 바이러스 5 μg의 293 인간 배아 신장 세포주에서 형질 세포는 관심의 전사 인자에 관한 포장 벡터 5㎍을가 제조사의 프로토콜에 따라 부착 된 세포 형질 감염 시약을 이용하여 함께.
- 대조군으로서, 293 인간 배아 신장 세포주에서 세포를 형질shRNA를 제조사의 프로토콜에 따라 패키징 벡터를 스크램블링.
- (37 ° C, CO 2 배양기에서) 16 시간 동안 세포에 형질 전환 믹스를 유지 한 후 10 % FBS와 신선한 10 % DMEM 미디어 10 ml의 미디어를 변경합니다.
- 48 시간 포스트 형질을 기다립니다 세포 배양 (300 XG, 5 분) 원심 분리 및 감염 상층 액을 수집합니다. 부동 세포를 제거하기 위해 0.45 μm의 주사기 필터 (25 mm 계면 활성제 무료 셀룰로오스 아세테이트 막)을 통해 뜨는을 필터링합니다.
- 상등액을 농축시키고 100 kDa의의 임계 값과 함께 ultracentrifugal 필터 장치를 사용하는 렌티 바이러스를 수집한다. (30) 950 XG에 스핀 - 볼륨까지 60 분 미만 250 μL에 집중하고있다. -80 ° C에서 집중 바이러스를 저장합니다.
- 렌티 바이러스와 함께 세포를 형질 감염. -80 ° C의 냉동고에서 냉동 렌티 바이러스를 제거하고 실온에 해동. 새로운 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 바이러스 뜨는 100 μl를 전송합니다.
- 브린g까지 감소 된 혈청 배지 1 ㎖의에 튜브에 볼륨. 10 ng를 / ㎖의 최종 농도 1 ml의 바이러스 현탁액에 hexadimethrine 브로마이드를 추가 부드럽게 혼합하고, 혼합물을 5 분 동안 서 보자.
- 원심 5 × 106 세포에 대한 각각의 전달 부드럽게 바이러스를 함유 배지에 0.5 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. 다음, 10 % FBS의 최종 농도로 20 % FBS 배지로 0.5를 가하여 24 시간 - 셀 4 동안 인큐베이터에 머물게.
- 48 ~ 72 시간을 기다린 요오드화 프로피 듐 (PI) 및 제조업체의 지침에 따라 녹색 형광 단백질 (GFP)와 세포를 얼룩. 빛으로부터 세포를 보호하고 GFP + / PI의 속도 측정하기 위해 FACS 분류기를 사용 - 세포. PI 얼룩 만 사균 때문에,이 비율은 살아있는 세포에서 형질 감염 효율의 추정치이다.
- 이전 10 설명 된대로 FACS 분류기에 의한 GFP 발현 (GFP의 +)에 대한 긍정적 인 세포 인구를 정렬합니다.
- 사용 WesteRN 면역 블롯은 이미 전에 shRNA를 지정하여 (예를 들어, CLL 세포) 관심의 세포를 감염 후 관심있는 전사 인자의 수준을 결정하기 위해 열을 설명했다.
3. 전사 인자-shRNA를 형질 세포에서 마이크로 RNA 전 사체 (Transcriptome)의 발현 수준을 결정
- RNA는 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트를 사용하여 분리.
- RNA의 레이블 및 마이크로 RNA 마이크로 어레이 (11)에 혼성화.
- 전사 인자의 shRNA 또는 빈 벡터 제어 5 형질 감염된 세포에서 차별적으로 발현 마이크로 RNA를 결정합니다.
- PCR 5 실시간하여 가장 차별적으로 발현 마이크로 RNA에 대한 마이크로 어레이 결과를 검증.
4. 전사 인자 종속 사체 (Transcriptome)를 설명하기에 생물 정보학 및 shRNA를 접근 사이의 중복 결정
- DET하려면, 형질 전환 된 세포를 자신의 프로모터에 결합 부위 전사 인자 항구 및 전사 인자의 shRNA에서 하향 조절 된 마이크로 RNA 유전자의 예상 및 관찰 비율을 족제비 다음을 수행하십시오
- 1.3에서 생성 된 목록에서 자신의 프로모터 / 총 마이크로 RNA에 대한 관심의 전사 인자 항구 유전자의 비율을 얻습니다. 이 목록은 (예를 들어, STAT3 결합 부위 / 총 마이크로 RNA 유전자와 마이크로 RNA 유전자 = 0.25 시험) 예상 비율이다.
- 3.3 생성 목록에서 전사 인자 shRNA를 형질 감염된 세포에서 하향 조절 1.3 생성 목록에서 관심 결합 부위의 전사 인자를 가지고 있었다 유전자의 수를 결정한다. 하향 조절 유전자의이 수 / 총 수는 관찰 된 비율 (예를 들어, 하향 조절 마이크로 RNA의 STAT3 사이트를 결합 / 총 수 = 0.6과 마이크로 RNA 유전자).
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Representative Results
STAT3은 전형적 항 세포 사멸 및 증식 효과가 12 유전자의 전사를 유도하는 전사 인자이다. STAT3 여부는 비 코딩 된 RNA 전 사체는 현재 알려지지 않은 영향을 미친다. 모든 CLL 세포에서 STAT3는 세린 (707) 잔류 10,13에 구성 적 인산화이다. 핵에 포스 포세린 STAT3 셔틀은 DNA에 결합하고, 다른 세포 유형 10 티로신 pSTAT3 의해 활성화 될 것으로 알려진 유전자를 활성화합니다. CLL은 마이크로 RNA 네트워크 (14)의 전역 완화 특징으로하기 때문에, 우리는 세린 pSTAT3의 존재 CLL 세포에서 마이크로 RNA의 발현에 영향을 미치는 것으로 가정 하였다.
이 STAT3 바인딩 사이트를 식별 할 수 있었다 항구 마이크로 RNA의 프로모터를 가설을 말씀 테스트합니다. 하여 배어 등. (9) 영역의 H2K4me3 히스톤 후 변형에 의해 생성 된 데이터를 건너STAT3은 칩 서열 실험 15에 의해 식별 결합 부위와 프로모터 부위를 특징 양이온, 추정 STAT3 결합 부위가 확인되었다. 160 추정 발기인 100 (가장 낮은 점수)에서 1,000 (최고 점수) (표 1)에 이르기까지 결합 점수 (N = 200) 조사 마이크로 RNA 유전자의 약 25 %에서 발견 된이 방법을 사용.
그 후 CLL 세포는 STAT3-shRNA를하거나 빈 벡터 및 마이크로 RNA 배열을 이용하여 형질 아래로 형질 전환 (그림 1) STAT3이 마이크로 RNA의 전사를 촉진 것을 건의 다음과 같은 규정 된 63 마이크로 RNA를 발견했다. 63 마이크로 RNA 하향 조절 유전자의 60 % (N = 38) 확률 (p <0.0001)에 의해 기대되는 것보다 훨씬 더 많은 유전자의 상류에 위치 추정되는 프로모터에 결합 STAT3 확인 칩 서열 데이터. 형질 감염 후 하향 조정했다 나인 마이크로 RNA,STAT3에 부정적인 전사의 수준을 조절하는 것을 제안.
STAT3-shRNA를 가진 CLL 세포의 형질 감염도 1은 STAT3 단백질 및 STAT3 mRNA의 발현 수준을 감소시킨다. A :. (서양 면역 검출 오른쪽 패널)을 STAT3 단백질의 STAT3-의 shRNA (정량적 RT-PCR에 의해 검출 왼쪽 패널) STAT3의 mRNA의 수준과 수준 CLL 세포의 형질 전환 후 유의하게 감소 B : CLL의 마이크로 RNA 배열 세포는 발현 빈 벡터로 형질 STAT3-shRNA를 형질 CLL 세포와 CLL 세포 사이에 유의 한 차이 (23) 마이크로 RNA를 묘사했다. . 0.01 미만의 P 값이 통계적으로 유의 C 여겨졌다 다음을 사용하여 STAT3-shRNA를 처리 후 차동 표현했다 7 마이크로 RNA의에 의해 정량화 평균 발현 RT-PCR마이크로 RNA 배열입니다. 바는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
기업 코딩 파일 1 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 마이크로 RNA 유전자 | 염색체 | 발기인 시작 좌표 | 프로모터 최종 좌표 | 중앙값 (범위) STAT3 결합 점수 * |
| 은 miR-1205은 miR-1206은 miR-1207 | 8 q24.21 | 128961454 | 128962791 | 1000 (1,000에서 1,000 사이) | 1 q42.3 | 236045425 | 236047415 | 1000 (1,000에서 1,000 사이) |
| 은 miR-21 | 17 q23.1 | 57901872 | 57921277 | 1000 (112-1000) |
| 은 miR-3124 | 1 Q44 | 249115404 | 249123965 | 1000 (1,000에서 1,000 사이) |
| 은 miR-451 | 17q11.2 | 27222251 | 27224114 | 1000 (1,000에서 1,000 사이) |
| 은 miR-92B | 1 Q22 | 155162340 | 155168439 | 1000 (1,000에서 1,000 사이) |
| 은 miR-3197 | 21 q22.2 | 42537544 | 42543023 | 943 (943-943) |
| 은 miR-646 | 20 q13.33 | 58712550 | 58715320 | 789 (789-789) |
| 은 miR-629 | 15 Q23 | 70383751 | 70394586 | 773 (661-885) |
| 은 miR-30E 미르-30C-1 | 1 p34.2 | 41173077 | 41177703 | 759 (759-759) |
| 은 miR-3125 | 2 p24.3 | 12855381 | 12862915 | 756 (756-756) |
| 은 miR-3145 | 6 q23.3 | 138776942 | 138779365 | 743 (487-1000) |
| 은 miR-645 | 20 q13.13 | 49199911 | 49201187 | 743 (743-743) |
| 은 miR-1256 | 1 p36.12 | 21346830 | 21350211 | 725 (725-725) |
| 은 miR-619 | 12 q24.11 | 109248263 | 109253306 | 719 (719-719) |
| 은 miR-181a-2 미르-181b-2 | 9 q33.3 | 127418928 | 127426139 | 710 (710-710) |
| 은 miR-29A 미르-29B-1 | 7 q32.3 | 130583383 | 130597803 697 (482-1000) | |
| 은 miR-202 | 10 q26.3 | 135069499 | 135077337 | 696 (393-1000) |
| 은 miR-3142 미르-146A | 5 Q34 | 159890882 | 159899475 | 671 (671-671) |
| 은 miR-548C | 12 q14.2 | 65000968 | 65011503 | 660 (660-660) |
| 은 miR-630 | 15 q24.1 | 72764289 | 72769197 | 627 (255-1000) |
| 은 miR-135B | 1 q32.1 | 205416952 | 205452990 | 622 (245-1000) |
| 은 miR-29C 미르-29B-2 | 1 q32.2 | 207991044 | 208002382 | 608 (608-608) |
| 은 miR-1825 | 20 q11.21 | 30791020 | 30798310 | 604 (209-1000) |
| 은 miR-548h-1 | 14 q23.2 | (64)578834 | 64581657 | 587 (174-1000) |
| 은 miR-612 | 11 q13.1 | 65183633 | 65198528 | 581 (157-1000) |
| 은 miR-148B | 12 q13.13 | 54717640 | 54721204 | 578 (578-578) |
| 은 miR-3174 | 15 q26.1 | 90543381 | 90549092 | 576 (152-1000) |
| let7a-3, let7b | (22) | 46480680 | 46481826 | 573 (146-1000) |
| 은 miR-1255a | 4 Q24 | 102263848 | 102272541 | 557 (557-557) |
STAT3 결합 부위와 표 1. 추정 적 마이크로 RNA의 발기인.이 프로토콜은 게시 된 데이터의 데이터 마이닝을 이용하여 마이크로 RNA의 추정 프로모터에 결합 전사 인자를 식별하는 방법을 제공. 예로서, 여기 추정 마이크로 RNA 프로모터 STAT3의 결합을 도시하는 테이블을 제안한다. 바인딩 점수는 ENCODE 프로젝트 (15)의 일부로 게시 전체 게놈 칩의 서열 데이터로부터 0 1,000 규모로 제공됩니다. 발기인은 H3K4me3 후생 유전 학적 서명 (9)의 존재에 의해 식별됩니다.
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Discussion
단백질 코딩 유전자의 RNA 폴리머 라제 전사에 의존 II- 근본적인 메커니즘은 광범위하게 연구되어왔다. 이들 원소는 1 %를 구성하지만 - 인간 게놈의 2 %, 인 코드 프로젝트 증거가 인간 게놈의 80 % 이상이 전사 17 겪을 수 있고, 어떻게 비 - 코딩 DNA 요소의 전사를 조절하는 것을 제안은 거의 알려지지 않았다 6 .
폴 II는 또한 마이크로 RNA (6) 등 일부 비 단백질 코딩 유전자의 전사에 대한 책임이 있음을 나타내는 여러 연구는 잠재력을 해독하기 위해 공개적으로 이용 가능한 자원, 계산 알고리즘에서와 시험관 연구에서 데이터를 결합 전략을 개발하기 위해 우리를 안내 마이크로 RNA의 전사를 조절에 대한 관심이 전사 인자의 기능. 여기에서 제안 된 전략이 중요한 단계를 포함한다. 먼저 우리는 전사 인자 (B)을 식별하기 위해 공개적으로 이용 가능한 데이터를 사용하여마이크로 RNA 프로모터에 inding. 이를 위해 우리는 전사 결합 인자 및 마이크로 RNA-발기인의 간접적 인 지표로 발기인을 대표한다 후생 유전 학적 서명을 식별 할 ENCODE 컨소시엄에 의해 출판 칩 서열 데이터를 사용합니다. 이러한 데이터 세트에서 유전 적 좌표를 횡단하는 것은 관심의 전사 인자가 마이크로 RNA-프로모터에 결합하는 방법을 자주의 총 추정을 제공한다. 둘째 전사 인자의 발현을 침묵의 shRNA 기술을 사용하여 마이크로 RNA-배열 셀을 실시함으로써, 마이크로 RNA-사체에 전사 인자의 기능적 의미를 탐색 할 수있다.
마이크로 RNA 발현의 변화는 부분적으로 전사 인자에 따라 조절하여 설명한다. 화학 양 론적 변화와 다른 세포 또는 세포 외 요인이 중요한 역할을하고 제안 된 알고리즘의 시뮬레이션되지 않습니다. 다른 제한은 다음과 같다 : H3K4me3에 기초한 프로모터 분석서명은 939 주석 마이크로 RNA에 이루어졌다. 그 이후로 많은 마이크로 RNA의 게놈 위치가 확인되었다. 그러나 업데이트 된 데이터베이스를 기반으로 우리의 지식보다 포괄적 인리스트의 최선을 아직 게시되지 않았습니다. 939 마이크로 RNA 유전자의 프로모터 영역을 대표한다 H3K4me3은 781 마이크로 RNA 유전자 (83 %)로 확인되었다. 이 분석은 명확 불완전한 데이터 세트에 기초하면서 그러므로, 마이크로 RNA-사체의 상당 부분을 캡처한다.
또한, 후성 유전학의 서명이 부분에 각인 및 부품 세포 특이입니다. 따라서, 후성 유전학 마커에 의해 정의 된 추정 발기인의 generability는 의문을 제기 할 수있다. H3K4me3이 전사 18 독립적 지속 있기 때문에 일반적으로 각인 발기인의 마커로 간주됩니다. 이러한 프로모터가 다른 세포 -에서 확인 된 경우에 우리가 여기에 제시 분석 알고리즘은 따라서 세포 특이 마이크로 RNA 프로모터를 놓칠 수 있습니다유형. 마지막으로, 결론은 테스트해야하고 경험적으로 확인했다. 특히, 전사 인자의 다운 조절 간의 연결을하고 (마이크로 RNA 어레이에 의해 식별 된) 마이크로 RNA 발현 (shRNA를 접근법을 사용하여) 그러한 염색질 면역 (칩) 또는 전기 영동 이동성과 같은 허용되는 분석법에 의해 확인되어야 직접 전사 역할을 제안 할 변화 분석 (EMSA). 여기에 제안 된 방법에 대한 수정은 마이크로 RNA 프로모터를 식별하는 여러 가지 방법과 예를 들어 전사 인자의 발현을 쓰러 뜨린 다른 방법, 대신의 shRNA의 작은 간섭 RNA를 포함한다. 마이크로 RNA의 전사 조절 단백질 코딩 유전자 (유전자 내 마이크로 RNA) 및 (유전자 간 마이크로 RNA) 그렇지 않은 내에 상주 마이크로 RNA에 대한 실질적으로 다를 수 있습니다. 유전자 내 마이크로 RNA는 통상적으로 그들의 숙주 유전자 (19)와 함께 전사되기 때문에 프로모터는 일반적으로 즉시 발견 upstrea전사 시작 사이트를 해요. 그러나 일반적으로 단백질 코딩 유전자에 사용되는 많은 유전자 간 전사 개시 사이트가 제대로 주석이 마이크로 RNA 및 예측 툴 저조한 20 수행합니다.
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Acknowledgments
본 연구는 CLL 글로벌 연구 재단에서 기금에 의해 지원되었다. 텍사스 MD 앤더슨 암 센터의 대학은 암 센터 지원 그랜트 (P30CA16672)을 통해 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 부분적으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0.45 µm syringe filter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100 kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol reagent | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Cell line human | Sigma-Aldrich | 85120602 |
References
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