Abstract
Terwijl de transcriptieregulatie van eiwitcoderende genen uitgebreid bestudeerd weinig bekend over hoe transcriptiefactoren betrokken zijn bij transcriptie van niet-coderende RNA's specifiek van miRNA. Hier stellen we een strategie om de mogelijke rol van transcriptiefactor studeren in het reguleren van transcriptie van microRNA's met behulp van publiekelijk beschikbare gegevens, computational resources en high throughput data. We gebruiken de H3K4me3 epigenetische handtekening aan microRNA promotors en chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -sequencing data identificeren van de ENCODE project om microRNA promotors die zijn verrijkt met transcriptiefactor bindingsplaatsen te identificeren. Door het transfecteren van cellen plaats met shRNA gericht op een transcriptiefactor van interesse en het onderwerpen van de cellen aan microRNA array, onderzoeken we het effect van deze transcriptiefactor op de microRNA transcriptoom. Als illustratief voorbeeld gebruiken we ons onderzoek naar het effect van STAT3 op microRNA transcriptoom van chronische lymphocytic leukemie (CLL) cellen.
Introduction
MicroRNAs zijn endogene kleine niet coderende RNA's regelgeving die typisch functioneren als negatieve regulatoren van mRNA expressie in het post-transcriptionele niveau. Ongeveer 1000 niet coderende 20-25 nucleotiden lang microRNA worden in het menselijk genoom 1,2. MicroRNAs genexpressie tot canonieke basenparing tussen het zaad sequentie van microRNA en zijn complementaire sequentie seed match, die gewoonlijk is gelegen aan het 3 'onvertaalde gebied (UTR) van het doelwit mRNA. Gezamenlijk microRNAs reguleren van meer dan 30% van de proteïne-coderende genen 3, maar is slechts weinig bekend over de transcriptie van DNA van microRNAs. Er is gesuggereerd dat de regulering van microRNA transcriptie vergelijkbaar met die van mRNA 4,5. Vooral vergelijkbaar met de activiteit bevorderen transcriptie van eiwitcoderende genen, transcriptie factoren zijn die de transcriptie van miRNA 6 activeert. Transcriptiefactor-microRNA samenspel is gemeld als een modulator factor van genexpressie 7, en kunnen vormen ook feed-back en feed-forward loops. Bijvoorbeeld Yamakuchi et al. Rapporteerde een terugkoppellus waarin p53 induceert de expressie van microRNA34a, waardoor remt translatie van het p53 repressor SIRT en daardoor p53 activiteit 8 toe.
Dat specifieke voorbeelden van transcriptie factor afhankelijke expressie van miRNA gemeld wordt geaccepteerd als die informatie geeft over hoe een transcriptiefactor van interesse reguleert de expressie van microRNA-transcriptoom ontbreekt. Het doel van het protocol hierin voorgesteld is om een diepgaande beschrijving van transcriptiefactor-afhankelijke regulatie van het microRNA-transcriptoom bieden. Door het combineren van publiekelijk beschikbare gegevens, bio-informatica hulpmiddelen en het gebruik van microarray technologie, zou onderzoekers die dit algoritme volgen in staat om op een genomische schaal om vast te leggen hoe eentranscriptiefactor in elk celtype van belang reguleert de expressie van microRNA-transcriptoom en een vermeende bijdrage van de transcriptiefactor mRNA verkennen in microRNA expressie reguleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Identificeer transcriptiefactorbindingsplaatsen in de promotor van MicroRNA genen Met behulp van Data Mining Approach
- Gebruik de Universiteit van Californië in Santa Cruz (UCSC) genoom browser naar chromatine immunoprecipitatie (ChIP) sequencing gegevens die in het kader van de Encyclopedia of DNA-element (ENCODE) project te halen.
- Open de tabel browser in de UCSC genoom browser.
- Gebruik de volgende specificaties om de tafel te pakken: Clade: (Zoogdieren), genoom: (Human), Montage: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), de groep: (verordening), track (TxnFactorChIP), tabel: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), regio : (Genome), output formaat (alle genen van geselecteerde tabel).
- Sla de output van 1.1.2 als een txt-bestand en in een spreadsheet.
- Sorteren en filteren voor de transcriptiefactor van belang (bijvoorbeeld, STAT2).
- Gebruik de lijst van microRNA promotors gebaseerd op H3K4me3 epigenetica handtekening verkrijgbaar bij Baeer et al. 9
- Aan de hand van coördinaten op het menselijk genoom overeenkomen, breng de gegevens van 1.1 en 1.2 (bv STAT3 bindend vermeende microRNA promotors) en het bepalen van de mediane affiniteit met behulp van de code geschreven in C scherp als omschreven in aanvullende codering bestand 1.
2. Gebruik shRNA naar Down-reguleren van de expressie van een transcriptiefactor of Interest
- Plaat 1,5 x 10 6 cellen van 293 humane embryonale niercellijn in 10 cm plaat bij ongeveer 50% confluentie (DMEM met 10% FBS).
- Transfecteren van cellen 293 humane embryonale niercellijn met 5 ug groene fluorescentie eiwit (GFP) lentivirus die shRNA gericht naar de transcriptiefactor van interesse en met 5 ug verpakkingsvectoren middels transfectie reagens voor hechtende cellen volgens het protocol van de fabrikant.
- Als controle transfecteren van de cellen van 293 humane embryonale niercellijn metscrambled shRNA en de verpakking vectoren volgens het protocol van de fabrikant.
- Blijf transfectiemengsel op cellen gedurende 16 uur (bij 37 ° C, CO2 incubator) en media veranderen in 10 ml vers 10% DMEM medium met 10% FBS.
- Wacht 48 uur na transfectie, centrifuge de celkweek (300 x g, 5 min) en het verzamelen van besmettelijke supernatant. Filtreer de bovenstaande vloeistof door een 0,45 pm spuitfilter (25-mm oppervlakteactieve gratis celluloseacetaatmembraan) tot een drijvend cellen te verwijderen.
- Concentreer de supernatant en het verzamelen van de lentivirus met behulp van een ultracentrifugale filter apparaat met een drempel van 100 kDa. Spin bij 950 g gedurende 30 - 60 min, totdat het volume concentraat geweest tot minder dan 250 pl. Bewaar de geconcentreerde virus bij -80 ° C.
- Transfecteren de cellen met de lentivirus. Verwijderen lentivirus bevroren van -80 ° C vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur. Transfer 100 ul virale supernatant naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Bring het volume in de buis 1 ml met verminderde serum medium. Voeg hexadimethrinebromide aan 1 ml virussuspensie voor eindconcentratie van 10 ng / ml, meng voorzichtig en laat het mengsel staan gedurende 5 min.
- Centrifugeer 5 x 10 6 cellen per transductie en voorzichtig resuspendeer de celpellet in 0,5 ml medium bevattende virus. Laat de cellen blijven in de incubator voor 4-24 uur, voeg 0,5 ml medium met 20% FBS tot een uiteindelijke concentratie van 10% FBS.
- Wacht 48 tot 72 uur en vlekken op de cellen met propidiumjodide (PI) en groene fluorescerende eiwit (GFP) volgens de instructies van de fabrikant. Bescherm de cellen tegen licht en gebruik een FACS sorter om de tarieven van GFP + / PI te meten - cellen. Aangezien PI vlekken alleen dode cel, dit percentage is een schatting van transfectie-efficiëntie in levende cellen.
- Sorteren positieve celpopulatie GFP expressie (GFP +) van FACS sorter zoals eerder beschreven 10.
- gebruik Western immunologische blotting zoals eerder beschreven 10 om de niveaus van een transcriptiefactor van interesse te bepalen voor en na het infecteren van de cellen van belang (bijvoorbeeld CLL cellen) met aangewezen shRNA.
3. Bepaal de expressie van MicroRNA Transcriptome in cellen die met Transcription Factor-shRNA
- Isoleer RNA met een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant.
- Label de RNA en hybridiseren aan microRNA microarray 11.
- Bepaal de verschillend tot expressie microRNA in cellen die met transcriptiefactor-shRNA of met lege vector controls 5.
- Valideren van de microarray resultaten voor het grootste differentieel tot expressie microRNA's met behulp van real-time PCR 5.
4. Bepaal de overlap tussen de Bio-informatica en de shRNA aanpak bij het beschrijven van de transcriptiefactor Dependent Transcriptome
- detHermelijn het verwachte en waargenomen verhoudingen van microRNA genen die transcriptiefactor bindingsplaatsen in hun promoters haven en werden neerwaarts gereguleerd in transcriptiefactor-shRNA getransfecteerde cellen, het volgende doen:
- Het verkrijgen van de verhouding van genen die de transcriptiefactor van belang de haven in hun promotor / totaal microRNA in de lijst gegenereerd in 1.3. Deze lijst is de verwachte verhouding (bijv microRNA genen met STAT3 binding sites / totaal microRNA genen getest = 0,25).
- Bepaal het aantal genen die in transcriptiefactor-shRNA getransfecteerde cellen werden neerwaarts gereguleerd in de lijst gegenereerd in 3.3 en heeft transcriptiefactor van belang bindende plaatsen in de lijst gegenereerd in 1.3. Dit nummer / Totaal aantal genen neerwaarts gereguleerd is de waargenomen ratio (bijv microRNA genen met STAT3 binding sites / totaal aantal neerwaarts gereguleerd microRNAs = 0,6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
STAT3 is een transcriptiefactor die gewoonlijk induceert de transcriptie van genen die anti- apoptotische en proliferatieve effecten 12 hebben. Of STAT3 beïnvloeden ook de niet-coderende RNA transcriptoom is momenteel niet bekend. In alle CLL cellen STAT3 constitutief gefosforyleerd op serine residuen 707 10,13. Fosfoserine STAT3 shuttles naar de kern, bindt aan DNA en activeert genen bekend zijn geactiveerd door tyrosine pSTAT3 in andere celtypen tot 10. Omdat CLL wordt gekenmerkt door globale deregulering van het microRNA netwerk 14 veronderstelden we dat de aanwezigheid van serine pSTAT3 de expressie van miRNA bij CLL cellen beïnvloedt.
Om te testen deze hypothese initiatiefnemers van microRNAs die haven STAT3 bindingsplaatsen moesten worden geïdentificeerd. Door het kruisen van de gegevens gegenereerd door Baer et al. 9 van regio's met de H2K4me3 histone wijzikation dat promotor plaatsen karakteriseren, met STAT3 bindingplaatsen geïdentificeerd door ChIP-seq experiment 15 werden vermeende STAT3 bindingplaatsen geïdentificeerd. Met behulp van deze benadering 160 vermeende promotors werden in bijna 25% van de microRNA genen onderzocht (N = 200) met bindende scores variërend van 100 (de laagste score) tot 1000 (de hoogste score) (tabel 1) gedetecteerd.
Vervolgens CLL cellen werden getransfecteerd met STAT3-shRNA of met een lege vector en gebruiken microRNA array en geïdentificeerd 63 microRNAs die omlaag gereguleerd na transfectie (Figuur 1) suggereert dat STAT3 bevordert de transcriptie van deze microRNA. Voor 60% van de 63 genen neerwaarts gereguleerd microRNA (n = 38) ChIP-seq bevestigden STAT3 binding in een vermeende promoter stroomopwaarts van het gen plaats, aanzienlijk meer dan verwacht toevallig (p <0,0001). Negen microRNAs die werden down-gereguleerd na de transfectie,suggereert dat STAT3 zijn niveaus van transcriptie negatief reguleren.
Figuur 1. Transfectie van CLL-cellen met STAT3-shRNA vermindert de expressieniveaus van STAT3 eiwit en STAT3 mRNA. A:. Na transfectie van CLL-cellen met STAT3-shRNA niveau van STAT3 mRNA (linker panel, gedetecteerd door kwantitatieve RT-PCR) en niveaus van de STAT3 eiwit (rechterpaneel, gedetecteerd door Western immunoblotting) significant verlaagd B: microRNA reeks CLL cellen afgebeeld 23 miRNA waarvan de expressie significant tussen CLL cellen die met STAT3-shRNA en CLL cellen getransfecteerd met een lege vector. P waarde van minder dan 0,01 werd als statistisch significant C. De gemiddelde expressie gekwantificeerd door RT-PCR van 7 microRNA's die differentiële expressie had na STAT3-shRNA behandeling met hetmicroRNA array. Balken geven de standaardafwijking van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende Coding File 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| Micro-RNA-gen | chromosome | Promotor start coördinaten | Promotor eindcoördinaten | Mediaan (bereik) STAT3 binding score * |
| miR-1205, miR-1206, miR-1207 | 8 q24.21 | 128961454 | 128962791 | 1000 (1000-1000) | 1 q42.3 | 236045425 | 236047415 | 1000 (1000-1000) |
| miR-21 | 17 q23.1 | 57901872 | 57921277 | 1000 (112-1000) |
| miR-3124 | 1 Q44 | 249115404 | 249123965 | 1000 (1000-1000) |
| miR-451 | 17q11.2 | 27222251 | 27224114 | 1000 (1000-1000) |
| miR-92b | 1 Q22 | 155162340 | 155168439 | 1000 (1000-1000) |
| miR-3197 | 21 q22.2 | 42537544 | 42543023 | 943 (943-943) |
| miR-646 | 20 q13.33 | 58712550 | 58715320 | 789 (789-789) |
| miR-629 | 15 Q23 | 70383751 | 70394586 | 773 (661-885) |
| miR-30E, miR-30c-1 | 1 p34.2 | 41173077 | 41177703 | 759 (759-759) |
| miR-3125 | 2 p24.3 | 12855381 | 12862915 | 756 (756-756) |
| miR-3145 | 6 q23.3 | 138776942 | 138779365 | 743 (487-1000) |
| miR-645 | 20 q13.13 | 49199911 | 49201187 | 743 (743-743) |
| miR-1256 | 1 p36.12 | 21346830 | 21350211 | 725 (725-725) |
| miR-619 | 12 q24.11 | 109248263 | 109253306 | 719 (719-719) |
| miR-181 A-2, miR-181b-2 | 9 q33.3 | 127418928 | 127426139 | 710 (710-710) |
| miR-29a, miR-29b-1 | 7 q32.3 | 130583383 | 130597803 697 (482-1000) | |
| miR-202 | 10 q26.3 | 135069499 | 135077337 | 696 (393-1000) |
| miR-3142, miR-146a | 5 Q34 | 159890882 | 159899475 | 671 (671-671) |
| miR-548c | 12 q14.2 | 65000968 | 65011503 | 660 (660-660) |
| miR-630 | 15 q24.1 | 72764289 | 72769197 | 627 (255-1000) |
| miR-135b | 1 q32.1 | 205416952 | 205452990 | 622 (245-1000) |
| miR-29c, miR-29b-2 | 1 q32.2 | 207991044 | 208002382 | 608 (608-608) |
| miR-1825 | 20 q11.21 | 30791020 | 30798310 | 604 (209-1000) |
| miR-548h-1 | 14 q23.2 | 64578.834 | 64581657 | 587 (174-1000) |
| miR-612 | 11 q13.1 | 65183633 | 65198528 | 581 (157-1000) |
| miR-148b | 12 q13.13 | 54717640 | 54721204 | 578 (578-578) |
| miR-3174 | 15 q26.1 | 90543381 | 90549092 | 576 (152-1000) |
| let7a-3, let7b | 22 | 46480680 | 46481826 | 573 (146-1000) |
| miR-1255a | 4 Q24 | 102263848 | 102272541 | 557 (557-557) |
Tabel 1. Vermeende microRNA's promotors met STAT3 binding sites. Het protocol voorziet in een methode om transcriptiefactor identificeren bindend vermeende promotoren van microRNA's met behulp van data mining van gepubliceerde gegevens. Als voorbeeld geven we hier een tabel is die de binding van STAT3 op vermeende microRNA promoters. De binding score wordt gegeven op een 0 tot 1.000 schaal van gehele genoom ChIP volgende gegevens gepubliceerd als onderdeel van de ENCODE project 15. De promotors worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van de H3K4me3 epigenetische katern 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het mechanisme dat het RNA polymerase II de transcriptie afhankelijke eiwit-coderende genen is uitgebreid bestudeerd. Hoewel deze elementen maken slechts 1% - 2% van het menselijk genoom, bewijsmateriaal van de ENCODE project suggereren dat meer dan 80% van het menselijk genoom transcriptie 17 kan ondergaan en wat reguleert de transcriptie van de niet-coderende DNA-elementen nog zwaar 6 .
Verschillende studies waaruit bleek dat Pol II is ook verantwoordelijk voor de transcriptie van een aantal niet-eiwit-coderende genen waaronder microRNA 6, leidde ons naar een strategie die gegevens uit publiekelijk beschikbare bronnen, algoritmes en in vitro studies de potentiële ontcijferen ontwikkeling functie van een transcriptiefactor van interesse in de transcriptie te reguleren van miRNA. De strategie hierin voorgesteld omvat 2 kritische stappen. Ten eerste maken we gebruik van publiekelijk beschikbare gegevens aan transcriptiefactor b identificereninding in microRNA promoters. Daarvoor maken we gebruik van Chip-seq data gepubliceerd door de ENCODE consortium transcriptiefactor binding en epigenetische handtekening die promotor typeert als een indirecte merker van microRNA-promoters te identificeren. Het oversteken van de genetische coördinaten van deze datasets levert een grove schatting van hoe vaak een transcriptiefactor van belang bindt aan microRNA-promotor. Tweede door shRNA technologie om de expressie van een transcriptiefactor te stoppen en het onderwerpen van de cellen aan microRNA-matrix, is het mogelijk om de functionele betekenis van een transcriptiefactor op de microRNA-transcriptoom verkennen.
De variabiliteit in microRNA expressie wordt slechts gedeeltelijk verklaard door transcriptiefactor afhankelijke regulatie. Stoichiometrische variabiliteit en andere cellulaire of extracellulaire factoren spelen een belangrijke rol en worden nagebootst in het voorgestelde algoritme. Andere beperkingen zijn: De promotor analyse op basis van de H3K4me3handtekening werd gedaan op 939 geannoteerde microRNAs. Sindsdien is de genomische locaties van veel meer microRNAs zijn geïdentificeerd. Maar om de beste weten een uitgebreidere lijst die is gebaseerd op een bijgewerkte database nog niet gepubliceerd. Van de 939 microRNA genen, de H3K4me3 die het promotorgebied kenmerkend geïdentificeerd in 781 microRNA genen (83%). Vandaar, terwijl deze analyse duidelijk op een onvolledige dataset vangt een aanzienlijk deel van de microRNA-transcriptoom.
Bovendien wordt epigenetica handtekening gedeeltelijk bedrukt en deels celspecifieke. Daarom kan de generability van vermeende promotors die werden bepaald door de epigenetica markers worden ondervraagd. Omdat H3K4me3 blijft onafhankelijk van de transcriptie 18 wordt over het algemeen beschouwd als een marker van bedrukt initiatiefnemers. De analytische algoritme we hierin voorstellen kunnen dus missen cel-specifieke microRNA promotors indien deze promotors werden geïdentificeerd op een andere cel-type. Tenslotte moet een conclusie worden getest en empirisch bevestigd. Het meest opvallend is de associatie tussen omlaag regulatie van een transcriptiefactor (met behulp van shRNA benadering) en microRNA expressie (geïdentificeerd door microRNA array) kan alleen maar wijzen op een directe transcriptie rol die moet worden bevestigd door aanvaardbaar testen zoals chromatine immunoprecipitatie (chip) of elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA). Modificaties van de hierin voorgestelde werkwijze omvatten verschillende manieren identificeren microRNA promoter en verschillende manieren van neerhalen de expressie van een transcriptiefactor, bijvoorbeeld kleine interfererende RNA in plaats van shRNA. De transcriptie regulatie van microRNAs kunnen aanzienlijk verschillen voor microRNAs die binnen eiwit-coderende genen (intragene microRNA's) en die dat niet doen (intergenisch microRNA's) wonen zijn. Omdat intragene microRNAs vaak worden getranscribeerd in combinatie met hun gastheer genen 19 de promoter wordt meestal direct gevonden upstream de transcriptie startplaats. Maar voor veel intergene microRNAs de transcriptie start site is slecht geannoteerd en voorspelling instrumenten die vaak worden gebruikt voor het eiwit coderende genen slecht presteren 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door een subsidie van de CLL Global Research Foundation. De Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center wordt gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health door middel van een Cancer Center Ondersteuning Grant (P30CA16672).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0.45 µm syringe filter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100 kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol reagent | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Cell line human | Sigma-Aldrich | 85120602 |
References
- Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
- Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences. Biol Direct. 6, 61 (2011).
- Rozovski, U., et al. Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells. Mol Cancer. 12, 50 (2013).
- Turner, M. J., Slack, F. J. Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding. RNA Biol. 6, 49-53 (2009).
- Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity. Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).
- Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop. Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).
- Baer, C., et al. Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).
- Hazan-Halevy, I., et al. STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells. Blood. 115, 2852-2863 (2010).
- Melo, S. A., et al. A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function. Nat Genet. 41, 365-370 (2009).
- Akira, S. Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice. Stem Cells. 17, 138-146 (1999).
- Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues. J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).
- Consortium, E. P. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS biology. 9, e1001046 (2011).
- Miranda, K. C., et al. A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes. Cell. 126, 1203-1217 (2006).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, 57-74 (2012).
- Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene. Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).
- Corcoran, D. L., et al. Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data. PLoS One. 4, e5279 (2009).
- Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection. Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).
