Abstract
Alors que la régulation de la transcription des gènes codant des protéines a été largement étudié, on sait peu sur la façon dont les facteurs de transcription sont impliqués dans la transcription des ARN non-codant, en particulier des microARN. Ici, nous proposons une stratégie pour étudier le rôle potentiel du facteur de transcription dans la régulation de la transcription des microARN en utilisant des données publiquement disponibles, les ressources de calcul et de données à haut débit. Nous utilisons la signature épigénétique H3K4me3 pour identifier les promoteurs de microARN et immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) données -sequencing du projet ENCODE pour identifier les promoteurs de microARN qui sont enrichis avec des sites de liaison du facteur de transcription. Par transfection de cellules d'intérêt avec shRNA ciblant un facteur de transcription d'intérêt et à soumettre les cellules à matrice microRNA, nous étudions l'effet de ce facteur de transcription sur le transcriptome microARN. A titre d'exemple illustratif, nous utilisons notre étude sur l'effet de STAT3 sur le transcriptome microRNA de ly chroniqueleucémie mphocytic (CLL) cellules.
Introduction
Les microARN sont de petits ARN régulateurs non codantes endogènes qui fonctionnent généralement comme des régulateurs négatifs de l'expression de l'ARNm au niveau post-transcriptionnel. Environ 1000 non codante entre 20 et 25 nucléotides de long microARN sont présents dans le génome humain 1,2. Les microARN régulent l'expression des gènes par appariement de bases canonique entre la séquence de semence de la microARN et sa séquence de match de semences complémentaire, qui est généralement situé à la région 3 'non traduite (UTR) des ARNm cibles. Collectivement, les microARN réglementent plus de 30% des gènes codant des protéines 3, mais seulement on connaît peu la transcription de l' ADN de microARN. Il a été suggéré que la régulation de la transcription microARN est similaire à celle de l' ARNm de 4,5. En particulier, celle de son activité dans la promotion de la transcription des gènes codant pour des protéines, des facteurs de transcription sont censés activer la transcription de microARN 6. Facteur de transcription microRNA jeu a été rapporté comme un facteur de modulation de l' expression génique 7, et peut également former un feed-back et des boucles feed-forward. Par exemple, Yamakuchi et al. A rapporté une boucle de rétroaction dans laquelle p53 induit l'expression de microRNA34a, qui à son tour inhibe la traduction de la p53 SIRT répresseur et d' accroître ainsi l' activité de p53 8.
Alors que des exemples spécifiques de facteur de transcription expression dépendante de microARN ont été signalés, une méthode acceptée qui fournit des informations sur la façon dont un facteur de transcription d'intérêt régule l'expression du microARN-transcriptome fait défaut. Le but du protocole proposé ici est de fournir une description détaillée de la réglementation des facteurs dépendant de la transcription du microARN-transcriptome. En combinant les données publiquement disponibles, les outils bioinformatiques et en utilisant la technologie des puces à ADN, les chercheurs qui suivent cet algorithme seraient en mesure de capturer sur une échelle génomique comment unfacteur de transcription dans tout type cellulaire d'intérêt régule l'expression du microARN-transcriptome et d'explorer une contribution putatif du facteur de transcription de l'ARNm dans la régulation de l'expression de microARN.
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Protocol
1. Identifier Facteur de transcription sites de liaison dans le promoteur des gènes microARN en utilisant l'approche d'exploration de données
- Utilisez l'Université de Californie à Santa Cruz (UCSC) navigateur génome pour extraire des données immunoprécipitation (ChIP) de séquençage de chromatine générés dans le cadre de l'Encyclopédie de l'élément d'ADN projet (ENCODE).
- Ouvrez le navigateur de table dans le navigateur de génome UCSC.
- Utilisez les spécifications suivantes pour extraire la table: Clade: (Mammifères), génome: (Human), Assemblée: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), le groupe: (règlement), piste (TxnFactorChIP), table: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), région : (Genome), le format de sortie (tous les gènes de la table sélectionnée).
- Enregistrer la sortie de 1.1.2 en tant que fichier .txt et dans une feuille de calcul.
- Tri et filtre pour le facteur de transcription d'intérêt (par exemple, STAT2).
- Utilisez la liste des promoteurs microRNA basé sur H3K4me3 épigénétique signature disponible au Baeer et al. 9
- Pour correspondre selon les coordonnées sur le génome humain, cartographier les données à partir de 1.1 et 1.2 (par exemple, la liaison STAT3 sur les promoteurs de microARN putatifs) et de déterminer l'affinité de liaison médiane en utilisant le code écrit en C sharp comme indiqué dans supplémentaire fichier 1 codage.
2. Utilisez shRNA Down réguler l'expression d'un facteur de transcription d'intérêt
- Plaque de 1,5 x 10 6 cellules provenant d' embryons humains 293 lignée de cellules de rein de 10 cm de la plaque à environ 50% de confluence (DMEM avec 10% de FBS).
- les cellules transfecter de 293 lignée de cellules de rein embryonnaire humain avec 5 ug de protéine de fluorescence verte (GFP), des lentivirus contenant des shRNA dirigés vers le facteur de transcription d'intérêt et avec 5 pg de vecteurs d'emballage en utilisant le réactif de transfection pour les cellules adhérentes selon le protocole du fabricant.
- En tant que témoin, transfecter les cellules de la lignée cellulaire 293 de rein embryonnaire humain avecbrouillés shRNA et les vecteurs d'emballage selon le protocole du fabricant.
- Gardez mélange de transfection sur des cellules pendant 16 heures (à 37 ° C, CO 2 incubateur), puis changer de support à 10 ml frais de 10% du milieu DMEM avec 10% de FBS.
- Attendre 48 heures après transfection, centrifuger la culture cellulaire (300 xg, 5 min) et recueillir le surnageant infectieux. Filtrer le surnageant à travers un filtre à seringue de 0,45 pm (membrane d'acétate de cellulose dépourvue d'agent tensioactif de 25 mm) pour éliminer toutes les cellules flottantes.
- On concentre le surnageant et recueillir le lentivirus au moyen d'un dispositif de filtrage ultracentrifugation avec un seuil de 100 kDa. Centrifuger à 950 g pendant 30-60 min jusqu'à ce que le volume a été concentré à moins de 250 pi. Stocker le virus concentré à -80 ° C.
- Transfecter les cellules avec le lentivirus. Retirer lentivirus congelés de -80 ° C congélateur et décongeler à la température ambiante. Transfert 100 ul de surnageant viral à un 1,5 ml nouveau tube de microcentrifugation.
- Bring le volume dans le tube à 1 ml avec du milieu de sérum réduit. Ajouter le bromure de hexadimethrine à 1 ml virus suspension pour une concentration finale de 10 ng / ml, mélanger délicatement et laisser reposer le mélange pendant 5 min.
- Centrifuger 5 x 10 6 cellules pour chaque transduction et doucement remise en suspension du culot cellulaire dans 0,5 ml de milieu contenant le virus. Que les cellules restent dans l'incubateur pendant 4-24 heures, puis ajouter 0,5 ml de milieu avec 20% de FBS à une concentration finale de 10% de FBS.
- Attendre 48 à 72 heures et colorer les cellules avec de l'iodure de propidium (PI) et la protéine fluorescente verte (GFP) selon les instructions du fabricant. Protéger les cellules de la lumière et utiliser un trieur FACS pour mesurer les taux de GFP + / PI - cellules. Comme les taches de PI seulement cellules mortes, ce taux est une estimation de l'efficacité de transfection dans les cellules vivantes.
- Trier la population de cellules positives à l' expression de la GFP (GFP +) par FACS trieuse comme décrit précédemment 10.
- Utilisez Western blot immunitaire comme décrit précédemment 10 pour déterminer les niveaux d'un facteur de transcription d'intérêt avant et après l' infection des cellules d'intérêt (par exemple, les cellules CLL) avec shRNA désigné.
3. Déterminer le niveau d'expression de microARN transcriptome dans les cellules transfectées avec Transcription Factor-shRNA
- Isoler l'ARN à l'aide d'un kit commercial en suivant le protocole du fabricant.
- Etiqueter l'ARN et hybrider à microRNA microarray 11.
- Déterminer le microARN exprimé de manière différentielle dans les cellules transfectées avec facteur de transcription shRNA ou vecteur vide contrôles 5.
- Valider les résultats de puces à ADN pour les microARN les plus exprimés de manière différentielle à l' aide de PCR en temps réel 5.
4. Déterminer le chevauchement entre les bio-informatique et de l'approche shRNA en décrivant le transcriptome dépendante du facteur de transcription
- Pour detErmine les ratios attendus et observés de gènes microRNA qui abritent les sites de leurs promoteurs de liaison du facteur de transcription et ont été downregulated en facteur de transcription shRNA cellules transfectées, procédez comme suit:
- Obtenir le rapport de gènes qui abritent le facteur de transcription d'intérêt dans leur promoteur / microRNA totale de la liste générée en 1.3. Cette liste est le rapport attendu (par exemple, les gènes microARN avec des sites de liaison STAT3 / total des gènes de microARN testés = 0,25).
- Déterminer le nombre de gènes qui ont été réprimés dans les cellules transfectées facteur de transcription shRNA de la liste générée en 3.3 et a facteur de transcription des sites de liaison d'intérêt de la liste générée en 1.3. Ce nombre / nombre total de gènes régulés à la baisse est le rapport observé (par exemple, les gènes microARN avec STAT3 sites de liaison / nombre total de microARN downregulated = 0,6).
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Representative Results
STAT3 est un facteur de transcription qui induit généralement la transcription des gènes qui ont une activité anti apoptotique et des effets prolifératifs 12. Que STAT3 affectent également l'ARN transcriptome non codant est actuellement inconnue. Dans toutes les cellules CLL STAT3 est constitutivement phosphorylée sur des résidus sérine 707 10,13. Navettes phosphosérine STAT3 vers le noyau, se lie à l' ADN et activent des gènes connus pour être activés par la tyrosine pSTAT3 dans d' autres types de cellules 10. Étant donné que CLL est caractérisée par une dérégulation globale du réseau microRNA 14, nous émettons l' hypothèse que la présence de la serine pSTAT3 affecte l'expression de micro - ARN dans les cellules CLL.
Pour tester cette hypothèse promoteurs de microARN qui abritent des sites de liaison STAT3 devaient être identifiés. En croisant les données générées par Baer et al 9. Des régions avec l'histone modifi H2K4me3cation qui caractérisent les sites promoteurs, avec STAT3 sites identifiés par l' expérience de ChIP-seq 15 de liaison, les sites de liaison putatifs STAT3 ont été identifiés. En utilisant cette approche 160 promoteurs putatifs ont été détectés dans près de 25% des gènes de microARN examinés (N = 200) avec des scores de liaison allant de 100 (le score le plus bas) à 1000 (le score le plus élevé) (tableau 1).
Par la suite les cellules CLL ont été transfectées avec STAT3-shRNA ou avec un vecteur vide et en utilisant tableau microRNA et identifié 63 microARN qui ont été réglementés vers le bas après la transfection (Figure 1) , suggérant que STAT3 favorise la transcription de ces microARN. Pour 60% des 63 gènes de microARN downregulated (n = 38) des données de ChIP-seq confirmées de liaison dans un promoteur putative en amont de l'emplacement du gène STAT3, nettement plus que prévu par hasard (p <0,0001). Neuf microARN qui ont été régulés à la baisse après la transfection,ce qui suggère que STAT3 réguler négativement ses niveaux de transcription.
Figure 1. Transfection des cellules CLL avec STAT3-shRNA réduit les taux de protéine STAT3 et STAT3 expression de l' ARNm. A:. Après transfection de cellules CLL avec des niveaux STAT3-shRNA de STAT3 ARNm (panneau de gauche, détectée par RT-PCR quantitative) et les niveaux de la protéine STAT3 (panneau de droite, détectées par Western blot) diminué de façon significative B: microRNA gamme de CLL cellules représentées 23 microARN dont l'expression diffère de façon significative entre les cellules CLL transfectées avec STAT3-shRNA et les cellules CLL transfectées avec un vecteur vide. La valeur P inférieure à 0,01 a été considérée comme statistiquement significative . C: L'expression moyenne quantifiée par RT-PCR de 7 microARN qui avaient une expression différentielle après traitement STAT3-shRNA en utilisant latableau microARN. Les barres représentent l'erreur standard de la moyenne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Supplemental Fichier Codage 1. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
| Gène de l' ARN des micro | Chromosome | Les coordonnées de début Promoter | Les coordonnées d'extrémité Promoter | Médiane (plage) score de fixation STAT3 * |
| miR-1205, miR-1206, miR-1207 | 8 q24.21 | 128961454 | 128962791 | 1000 (1000-1000) | 1 q42.3 | 236045425 | 236047415 | 1000 (1000-1000) |
| miR-21 | 17 Q23.1 | 57901872 | 57921277 | 1000 (112-1000) |
| miR-3124 | 1 Q44 | 249115404 | 249123965 | 1000 (1000-1000) |
| miR-451 | 17q11.2 | 27222251 | 27224114 | 1000 (1000-1000) |
| miR-92b | 1 q22 | 155162340 | 155168439 | 1000 (1000-1000) |
| miR-3197 | 21 q22.2 | 42537544 | 42543023 | 943 (943-943) |
| miR-646 | 20 q13.33 | 58712550 | 58715320 | 789 (789-789) |
| miR-629 | 15 q23 | 70383751 | 70394586 | 773 (661-885) |
| miR-30E, miR-30c-1 | 1 p34.2 | 41173077 | 41177703 | 759 (759-759) |
| miR-3125 | 2 p24.3 | 12855381 | 12862915 | 756 (756-756) |
| miR-3145 | 6 Q23.3 | 138776942 | 138779365 | 743 (487-1000) |
| miR-645 | 20 q13.13 | 49199911 | 49201187 | 743 (743-743) |
| miR-1256 | 1 p36.12 | 21346830 | 21350211 | 725 (725-725) |
| miR-619 | 12 q24.11 | 109248263 | 109253306 | 719 (719-719) |
| miR-181a-2, miR-181b-2 | 9 q33.3 | 127418928 | 127426139 | 710 (710-710) |
| miR-29a, miR-29b-1 | 7 q32.3 | 130583383 | 130597803 697 (482-1000) | |
| miR-202 | 10 q26.3 | 135069499 | 135077337 | 696 (393-1000) |
| miR-3142, miR-146a | 5 q34 | 159890882 | 159899475 | 671 (671-671) |
| miR-548c | 12 q14.2 | 65000968 | 65011503 | 660 (660-660) |
| miR-630 | 15 q24.1 | 72764289 | 72769197 | 627 (255-1000) |
| miR-135b | 1 q32.1 | 205416952 | 205452990 | 622 (245-1000) |
| miR-29c, miR-29b-2 | 1 q32.2 | 207991044 | 208002382 | 608 (608-608) |
| miR-1825 | 20 q11.21 | 30791020 | 30798310 | 604 (209-1000) |
| miR-548h-1 | 14 Q23.2 | 64578834 | 64581657 | 587 (174-1000) |
| miR-612 | 11 Q13.1 | 65183633 | 65198528 | 581 (157-1000) |
| miR-148b | 12 q13.13 | 54717640 | 54721204 | 578 (578-578) |
| miR-3174 | 15 q26.1 | 90543381 | 90549092 | 576 (152-1000) |
| let7a-3, let7b | 22 | 46480680 | 46481826 | 573 (146-1000) |
| miR-1255a | 4 q24 | 102263848 | 102272541 | 557 (557-557) |
Tableau 1. promoteurs de putatif microARN avec des sites de liaison STAT3. Le protocole fournit une méthode pour identifier la liaison sur les promoteurs putatifs de microARN en utilisant l' extraction de données des données publiées facteur de transcription. A titre d'exemple, nous présentons ici un tableau illustrant la liaison de STAT3 aux promoteurs de microARN putatifs. Le score de liaison est donnée à 0 à 1000 échelle à partir des données seq génome ChIP entiers publiés dans le cadre du projet ENCODE 15. Les promoteurs sont identifiés par la présence de la signature épigénétique H3K4me3 9.
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Discussion
Le mécanisme sous-jacent l'ARN polymérase dépendante II- transcription des gènes codant des protéines a été largement étudiée. Bien que ces éléments ne représentent que 1% - 2% du génome humain, la preuve du projet ENCODE suggèrent que plus de 80% du génome humain peut subir la transcription 17 et ce qui régule la transcription des éléments d'ADN non codantes reste largement inconnue 6 .
Plusieurs études, qui indiquaient que Pol II est également responsable de la transcription de certains gènes non-codant pour une protéine dont microARN 6, nous a conduit à développer une stratégie qui combine des données à partir des ressources disponibles publiquement, des algorithmes de calcul et des études in vitro de déchiffrer le potentiel fonction d'un facteur de transcription d'intérêt pour la régulation de la transcription de microARN. La stratégie proposée ici comprend 2 étapes critiques. D'abord, nous utilisons les données publiquement disponibles pour identifier le facteur de transcription brouver dans les promoteurs microARN. À cette fin, nous utilisons les données Chip-Seq publiés par le consortium ENCODE pour identifier la liaison du facteur de transcription et la signature épigénétique qui caractérise le promoteur comme un marqueur indirect de microARN-promoteurs. Traversant les coordonnées génétiques de ces ensembles de données fournit une estimation brute de quelle fréquence un facteur de transcription d'intérêt se lie à microRNA-promoteur. En second lieu en utilisant la technologie shRNA pour réduire au silence l'expression d'un facteur de transcription et en soumettant les cellules à micro-ARN-matrice, il est possible d'étudier l'importance fonctionnelle d'un facteur de transcription sur le microARN transcriptome.
La variabilité de l'expression de microARN est que partiellement expliqué par règlement du facteur de transcription dépendant. variabilité stoechiométriques ainsi que d'autres facteurs cellulaires ou extracellulaires jouent un rôle important et ne sont pas simulés dans l'algorithme proposé. D'autres limitations sont notamment les suivantes: l'analyse du promoteur sur la base du H3K4me3signature a été effectuée sur 939 microARN annotés. Depuis lors, les emplacements génomiques de beaucoup plus de microARN ont été identifiés. Cependant, pour le meilleur de notre connaissance d'une liste plus complète qui repose sur une base de données mise à jour n'a pas encore été publiée. Des gènes de micro-ARN 939, le H3K4me3 qui caractérise la région de promoteur a été identifiée dans les gènes de microARN 781 (83%). Ainsi, alors que cette analyse est clairement basée sur un ensemble de données incomplète, elle capture une fraction importante de la microRNA-transcriptome.
En outre, l'épigénétique signature est en partie imprimé et en partie spécifique des cellules. Par conséquent, le generability des promoteurs putatifs qui ont été définis par épigénétique marqueurs peut être remise en question. Parce que H3K4me3 persiste indépendamment de la transcription 18 , il est généralement considéré comme un marqueur de promoteurs imprimés. L'algorithme d'analyse que nous proposons ici peut donc manquer les promoteurs de microARN spécifiques de cellules si ces promoteurs ont été identifiés à un autre Cell-type. Enfin, une conclusion doit être testée et confirmée empiriquement. Plus particulièrement, l'association entre la régulation négative d'un facteur de transcription (en utilisant l'approche shRNA) et l'expression de microARN (identifié par tableau microRNA) ne peut suggérer un rôle de transcription directe qui doit être confirmé par des tests acceptables tels que la chromatine immunoprécipitation (ChIP) ou de mobilité électrophorétique essai de déplacement (EMSA). Les modifications apportées à la méthode proposée ici comprennent différentes façons d'identifier le promoteur microARN et les différentes façons de faire tomber l'expression d'un facteur de transcription, par exemple, des petits ARN interférents au lieu de shRNA. La régulation de la transcription des microARN peut être sensiblement différente pour microARN qui résident dans les gènes codant des protéines (microARN intragéniques) et ceux qui ne le font pas (microARN intergéniques). Parce que les microARN intragéniques sont généralement transcrites en conjonction avec leurs gènes hôtes 19 le promoteur se trouve généralement immédiatement upstream le site d'initiation de la transcription. Cependant , pour de nombreux microARN intergéniques le site de début de transcription est mal annotée et des outils de prédiction qui sont couramment utilisés pour les gènes codant des protéines de mauvais résultats 20.
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Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par une subvention de la Fondation mondiale de recherche CLL. L'Université du Texas MD Anderson Cancer Center est soutenu en partie par les Instituts nationaux de la santé par le biais d'un centre d'assistance Grant Cancer (P30CA16672).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0.45 µm syringe filter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100 kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol reagent | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Cell line human | Sigma-Aldrich | 85120602 |
References
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