Abstract
Enquanto a regulação da transcrição de genes codificadores de proteínas foi extensivamente estudado, pouco se sabe sobre a forma como factores de transcrição envolvidos na transcrição de ARN não-codificantes, especificamente de microARNs. Aqui, propomos uma estratégia para estudar o papel potencial do fator de transcrição na regulação da transcrição de microRNAs usando dados publicamente disponíveis, recursos computacionais e dados de alto rendimento. Nós usamos a assinatura epigenética H3K4me3 para identificar promotores de microRNA e cromatina imunoprecipitação (CHIP) dados -sequencing do projeto ENCODE para identificar promotores de microRNA que são enriquecidos com sítios de ligação de factor de transcrição. Por células de interesse com shRNA alvo um factor de transcrição de interesse e submetendo as células a matriz microRNA transfecção, estudamos o efeito deste factor de transcrição sobre o transcriptoma microRNA. Como exemplo ilustrativo usamos nosso estudo sobre o efeito da STAT3 no transcriptoma microRNA de ly crônicaleucemia mphocytic (CLL) células.
Introduction
MicroRNAs são endógenos RNAs reguladores não codificação pequenas que normalmente funcionam como reguladores negativos de expressão do mRNA ao nível pós-transcricional. Aproximadamente 1000 não codificadora de 20 a 25 nucleótidos de comprimento microARNs são encontrados no genoma humano 1,2. MicroRNAs regular a expressão do gene através de emparelhamento de bases entre a sequência canónica de sementes do microARN e a sua sequência complementar jogo semente, que é normalmente localizado na região 3 'não traduzida (UTR) dos mRNAs alvo. Colectivamente, microARNs regular mais de 30% dos genes codificadores de proteínas 3, mas apenas pouco se sabe sobre a transcrição a partir de ADN de microARNs. Tem sido sugerido que a regulação da transcrição microARN é semelhante à do ARNm de 4,5. Em particular, semelhante à sua actividade na promoção da transcrição de genes codificadores de proteínas, factores de transcrição são pensados para activar a transcrição de microARNs 6. Factor de transcrição-microRNA interação tem sido relatada como um fator modulador da expressão do gene 7, e podem também formar feed-back e loops de feed-forward. Por exemplo, Yamakuchi et ai. Relataram um circuito de retroalimentação em que p53 induz a expressão de microRNA34a, que por sua vez inibe a tradução do SIRT p53 repressor e aumentando desse modo a actividade de p53 8.
Considerando que exemplos específicos de expressão dependente de factor de transcrição de microARNs têm sido relatados, um método aceite, o qual fornece informações sobre a forma como um factor de transcrição de interesse regula a expressão do microRNA-transcriptoma é inexistente. O objectivo do protocolo aqui sugerida é a de fornecer uma descrição detalhada da transcrição dependente de factor de regulação do microARN-transcriptoma. Ao combinar os dados publicamente disponíveis, ferramentas de bioinformática e utilizando tecnologia de microarray, os pesquisadores que seguem este algoritmo seria capaz de capturar em uma escala genômica como qualquerfactor de transcrição de qualquer tipo de células de interesse regula a expressão do microRNA-transcriptoma e para explorar uma contribuição putativo do factor de transcrição-regulação da expressão de ARNm em microARN.
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Protocol
1. Identificar fator de transcrição Sites obrigatório em promotora dos genes microRNA utilizando a abordagem de Mineração de Dados
- Use o navegador do genoma da Universidade da Califórnia em Santa Cruz (UCSC) para extrair dados de imunoprecipitação (CHIP) sequenciação de cromatina gerados como parte da Enciclopédia de projeto elemento de DNA (ENCODE).
- Abra o navegador da tabela no navegador genoma UCSC.
- Use as seguintes especificações para extrair a tabela: Clade: (mamíferos), genoma: (Humana), Assembly: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), o grupo: (regulamento), da faixa (TxnFactorChIP), tabela: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), região : (Genoma), formato de saída (todos os genes da tabela selecionada).
- Salvar a saída do 1.1.2 como um arquivo .txt e em uma planilha.
- Classificar e filtrar para o factor de transcrição de interesse (por exemplo, STAT2).
- Use a lista de promotores de microRNA com base em H3K4me3 epigenética assinatura disponível em Baeer et al. 9
- Para corresponder de acordo com as coordenadas sobre o genoma humano, mapear os dados de 1.1 e 1.2 (por exemplo, STAT3 vinculativa para os promotores de microRNA putativos) e determinar a afinidade de ligação mediana usando o código escrito em C sharp, conforme descrito no suplemento de codificação de arquivos 1.
2. Utilização de shRNA para sub-regular a expressão de um factor de transcrição de interesse
- Placa de 1,5 x 10 6 células de linha celular 293 de rim embrionário humano em placas de 10 cm a cerca de 50% de confluência (DMEM com FBS a 10%).
- transfectar células de linha 293 de rim embrionário humano de células com 5 ug de proteína de fluorescência verde lentivírus (GFP) contendo shRNA dirigido para o factor de transcrição de interesse e com 5 ug de vectores de embalagem usando o reagente de transfecção para células aderentes de acordo com o protocolo do fabricante.
- Como um controlo, transfectar as células de linha 293 de rim embrionário humano com célulasshRNA mexidos e os vectores de embalagem de acordo com o protocolo do fabricante.
- Mantenha a mistura de transfecção em células durante 16 h (a 37 ° C, incubador de CO2), em seguida mudar para meios frescos 10 ml de 10% de meio DMEM com FBS a 10%.
- Esperar 48 horas pós transfecção, centrifugar a cultura de células (300 x g, 5 min) e recolher o sobrenadante infecciosa. Filtra-se o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,45 mm (25 mm de agente tensioactivo livre de celulose membrana de etilo) para remover quaisquer células flutuantes.
- Concentra-se o sobrenadante e recolher o lentivírus utilizando um dispositivo de filtro de ultra-centrifuga�o com limite de 100 kDa. Centrifugação a 950 xg durante 30 - 60 min, até que o volume foi concentrado para menos de 250 ul. Armazenar o vírus concentrada a -80 ° C.
- Transfectar as células com o lentivírus. Remover lentivírus congelado de -80 ° C congelador e descongelar até à temperatura ambiente. Transferir 100 ul de sobrenadante virai para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml fresco.
- Bring-se o volume dentro do tubo para 1 ml com meio de soro reduzido. Adiciona-se brometo de hexadimetrina a 1 ml de suspensão de vírus para concentração final de 10 ng / mL, misturar suavemente e deixe a mistura repousar durante 5 min.
- Centrifugar 5 x 10 6 células para cada transdução suavemente e ressuspender o sedimento de células em 0,5 ml de meios contendo vírus. Deixe que as células permanecem na incubadora durante 4-24 h, depois adicionar 0,5 ml de meio com FBS a 20% a uma concentração final de 10% de FBS.
- Esperar 48 a 72 h e corar as células com iodeto de propídio (PI) e proteína fluorescente verde (GFP) de acordo com as instruções do fabricante. Proteger as células da luz e usar um classificador FACS para medir as taxas de GFP + / PI - células. Desde manchas PI única célula morta, esta taxa é uma estimativa da eficiência de transfecção em células vivas.
- Classificar a população de células positiva para a expressão GFP (GFP +) por FACS classificador como descrito anteriormente 10.
- Use Westeblotting imunológico RN como anteriormente descrito 10 para determinar os níveis de um factor de transcrição de interesse antes e depois de infectar as células de interesse (por exemplo, células CLL) com shRNA designado.
3. Determinar o nível de expressão de MicroRNA transcriptoma em células transfectadas com Fator de Transcrição-shRNA
- Isolar ARN utilizando um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
- Rotular o ARN e que hibridizam para microARN microarray 11.
- Determine o microRNA diferencialmente expressos em células transfectadas com transcrição fator-shRNA ou com controle de vetores vazios 5.
- Validar os resultados de microarranjos para os microRNAs mais diferencialmente expressos usando PCR em tempo real 5.
4. Determinar a sobreposição entre a Bioinformática ea Abordagem shRNA Ao descrever o transcriptoma Dependente Fator de Transcrição
- para detArminho as proporções esperadas e observadas de genes microRNA que abrigam fator de transcrição sites em seus promotores vinculativo e foram reprimidos na transcrição fator-shRNA células transfectadas, faça o seguinte:
- Obter a razão de genes que abrigam o factor de transcrição de interesse no seu promotor microARN / total a partir do lista gerada no ponto 1.3. Esta lista é a proporção esperada (por exemplo, genes microRNA com sítios de ligação de STAT3 genes microRNA / total testado = 0,25).
- Determinar o número de genes que foram regulados negativamente em células transfectadas factor de transcrição-shRNA da lista gerada em 3.3 e tem factor de transcrição de locais de ligação de interesse a partir da lista gerada no ponto 1.3. Este número / número total de genes regulados negativamente é a proporção observada (por exemplo, os genes microRNA STAT3 com sítios de ligação / número total de microARNs downregulated = 0,6).
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Representative Results
STAT3 é um factor de transcrição que normalmente induz a transcrição de genes que têm efeitos anti proliferativos 12 e apoptótica. Se STAT3 também afetam o transcriptoma RNA não-codificante é actualmente desconhecida. Em todas as células CLL STAT3 é constitutivamente fosforilada na serina 707 resíduos 10,13. Fosfosserina STAT3 serviços de transporte para o núcleo, se liga ao DNA e activa genes conhecidos por ser activada por tirosina pSTAT3 em outros tipos de células 10. Porque CLL é caracterizada pela desregulação global da rede microARN 14, a hipótese de que a presença de serina pSTAT3 afecta a expressão de microRNAs em células CLL.
Para testar esta hipótese promotores de microRNAs que abrigam sítios de ligação STAT3 tinham de ser identificados. Ao cruzar os dados gerados por Baer et al. 9 de regiões com a histona modifi H2K4me3cação que caracterizam locais promotoras, com locais identificados pelos experimento ChIP-seq 15 vinculativo STAT3, foram identificados sítios de ligação putativos STAT3. Utilizando esta abordagem 160 promotores putativos foram detectados em cerca de 25% dos genes microRNA examinados (N = 200) com as contagens de ligação que vão de 100 (o menor pontuação) para 1000 (a mais alta pontuação) (Tabela 1).
Subsequentemente as células foram transfectadas com CLL STAT3-shRNA ou com um vector vazio e usando matriz e microARN identificados 63 microARNs que foram reguladas para baixo após a transfecção (Figura 1), sugerindo que a STAT3 promove a transcrição destes microARNs. Para 60% dos 63 genes regulados negativamente microRNA (n = 38) os dados de chip SEQ confirmados STAT3 obrigatório em um promotor putativa a montante do local do gene, significativamente mais do que o esperado por acaso (p <0,0001). Nove microARNs que foram regulados negativamente após a transfecção,sugerindo que a STAT3 regular negativamente os seus níveis de transcrição.
Figura 1. A transfecção de células CLL com STAT3-shRNA reduz os níveis de proteína STAT3 e STAT3 ARNm de expressão. A:. Após transfecção de células CLL com níveis de STAT3-shRNA de ARNm STAT3 (painel esquerdo, detectado por RT-PCR quantitativa) e os níveis da proteína STAT3 (painel da direita, detectadas por Western immunoblotting) diminuiu significativamente B: matriz microARN de CLL células representado 23 microARNs cuja expressão diferiu significativamente entre as células transfectadas com CLL STAT3-shRNA e células CLL transfectadas com um vector vazio. Valor de P inferior a 0,01 foi considerado estatisticamente significativo C:. A expressão significativo quantificados por RT-PCR de 7 microARNs que apresentam expressão diferencial após o tratamento STAT3-shRNA usando omatriz de microRNA. As barras representam o erro padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Codificação de arquivo 1. Por favor, clique aqui para fazer o download deste arquivo.
| Gene de ARN Micro | Cromossoma | Coordenadas promotor de início | Coordenadas finais promotor | Mediana (intervalo) pontuação de ligação STAT3 * |
| miR-1205, miR-1206, miR-1207 | 8 q24.21 | 128961454 | 128962791 | 1000 (1000-1000) | 1 q42.3 | 236045425 | 236047415 | 1000 (1000-1000) |
| miR-21 | 17 q23.1 | 57901872 | 57921277 | 1000 (112-1000) |
| miR-3124 | 1 Q44 | 249115404 | 249123965 | 1000 (1000-1000) |
| miR-451 | 17q11.2 | 27222251 | 27224114 | 1000 (1000-1000) |
| miR-92b | 1 q22 | 155162340 | 155168439 | 1000 (1000-1000) |
| miR-3197 | 21 q22.2 | 42537544 | 42543023 | 943 (943-943) |
| miR-646 | 20 q13.33 | 58712550 | 58715320 | 789 (789-789) |
| miR-629 | 15 q23 | 70383751 | 70394586 | 773 (661-885) |
| miR-30e, o miR-30c-1 | 1 p34.2 | 41173077 | 41177703 | 759 (759-759) |
| miR-3125 | 2 p24.3 | 12855381 | 12862915 | 756 (756-756) |
| miR-3145 | 6 q23.3 | 138776942 | 138779365 | 743 (487-1000) |
| miR-645 | 20 q13.13 | 49199911 | 49201187 | 743 (743-743) |
| miR-1256 | 1 p36.12 | 21346830 | 21350211 | 725 (725-725) |
| miR-619 | 12 q24.11 | 109248263 | 109253306 | 719 (719-719) |
| miR-181.º-2, miR-181b-2 | 9 q33.3 | 127418928 | 127426139 | 710 (710-710) |
| miR-29a, miR-29b-1 | 7 q32.3 | 130583383 | 130597803 697 (482-1000) | |
| miR-202 | 10 q26.3 | 135069499 | 135077337 | 696 (393-1000) |
| miR-3142, miR-146a | 5 q34 | 159890882 | 159899475 | 671 (671-671) |
| miR-548c | 12 Q14.2 | 65000968 | 65011503 | 660 (660-660) |
| miR-630 | 15 q24.1 | 72764289 | 72769197 | 627 (255-1000) |
| miR-135b | 1 q32.1 | 205416952 | 205452990 | 622 (245-1000) |
| miR-29c, miR-29b-2 | 1 q32.2 | 207991044 | 208002382 | 608 (608-608) |
| miR-1825 | 20 q11.21 | 30791020 | 30798310 | 604 (209-1000) |
| miR-548h-1 | 14 q23.2 | 64578834 | 64581657 | 587 (174-1000) |
| miR-612 | 11 q13.1 | 65183633 | 65198528 | 581 (157-1000) |
| miR-148b | 12 q13.13 | 54717640 | 54721204 | 578 (578-578) |
| miR-3174 | 15 q26.1 | 90543381 | 90549092 | 576 (152-1000) |
| let7a-3, let7b | 22 | 46480680 | 46481826 | 573 (146-1000) |
| miR-1255a | 4 q24 | 102263848 | 102272541 | 557 (557-557) |
Tabela 1. promotores do putativo microRNA com sítios de ligação STAT3. O protocolo fornece um método para identificar fator de transcrição vinculativa para promotores putativos de microRNAs usando mineração de dados dos dados publicados. Como exemplo, apresentamos aqui uma tabela que descreve a ligação de STAT3 aos promotores de microRNA putativos. A pontuação de ligação é dada em um 0 a 1.000 escala a partir de dados seq genoma ChIP inteiros publicados como parte do projeto ENCODE 15. Os promotores são identificados pela presença da assinatura H3K4me3 9 epigenética.
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Discussion
O mecanismo subjacente a ARN polimerase II dependente de transcrição de genes codificadores de proteínas tem sido extensivamente estudada. Embora estes elementos constituem apenas 1% - 2% do genoma humano, a evidência do projecto CODIFICAR sugerem que mais de 80% do genoma humano podem ser submetidos a transcrição 17 e que regula a transcrição dos elementos de ADN não codificantes permanece largamente desconhecido 6 .
Vários estudos, o que indicava que Pol II é também responsável pela transcrição de alguns genes não codificante-proteína incluindo microARNs 6, levou-nos a desenvolver uma estratégia que combinar os dados dos recursos disponíveis publicamente, algoritmos computacionais e em estudos in vitro para decifrar o potencial função de um factor de transcrição de interesse na regulação da transcrição de microARNs. A estratégia aqui sugeridos inclui 2 passos críticos. Primeiro usamos os dados publicamente disponíveis para identificar fator de transcrição binding em promotores de microRNA. Para o efeito são utilizados os dados Chip-seq publicados pelo consórcio ENCODE para identificar fator de transcrição de ligação e assinatura epigenética que tipifica promotor como marcador indireto de microRNA-promotores. Cruzando as coordenadas genéticos a partir destes conjuntos de dados fornece uma estimativa grosseira de como freqüentes um factor de transcrição de interesse se liga ao microRNA-promotor. Em segundo lugar através da utilização de tecnologia de shRNA para silenciar a expressão de um factor de transcrição e sujeitando as células a microARN-matriz, é possível explorar o significado funcional de um factor de transcrição sobre o microARN-transcriptoma.
A variabilidade na expressão microRNA é apenas parcialmente explicada pela regulação dependente fator de transcrição. variabilidade estequiométrica e de outros factores celulares ou extracelulares desempenham um papel importante e não são simuladas no algoritmo proposto. Outras limitações incluem o seguinte: A análise de promotor baseado na H3K4me3assinatura foi feita em 939 microRNAs anotados. Desde então, foram identificados os locais genómicas de muitos mais microRNAs. No entanto, para o melhor do nosso conhecimento uma lista mais abrangente, que é baseado em um banco de dados atualizado ainda não foi publicado. Dos genes microRNA 939, o que tipifica H3K4me3 região promotora foi identificada em 781 genes microRNA (83%). Assim, enquanto esta análise é claramente baseada em um conjunto de dados incompletos ele captura uma fração significativa do microRNA-transcriptoma.
Além disso, a epigenética assinatura é em parte impressa e na célula específica parte. Portanto, o generabilidade de promotores putativos que foram definidos pela epigenética marcadores podem ser questionada. Porque H3K4me3 persiste independente de transcrição 18 é geralmente considerado um marcador de promotores impressos. O algoritmo de análise propomos aqui descritos pode, portanto, perder microRNA promotores específicos de células, se estes promotores foram identificadas numa cell- diferentedigitar. Finalmente, qualquer conclusão deve ser testado e confirmado empiricamente. Mais notavelmente, a associação entre a regulação para baixo de um factor de transcrição (usando abordagem shRNA) e expressão microRNA (identificado pela matriz microRNA) só pode sugerir um papel da transcrição direta que deve ser confirmado por ensaios aceitáveis, tais como imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ou mobilidade eletroforética ensaio shift (EMSA). As modificações do método aqui sugeridos incluem diferentes formas de identificar promotor microARN e diferentes maneiras de derrubar a expressão de um factor de transcrição, por exemplo, pequenos ARN interferentes, em vez de shRNA. A regulação da transcrição de microRNAs podem ser substancialmente diferentes para microRNAs que residem dentro genes codificadores de proteínas (microRNAs intragênicos) e aqueles que não o fazem (microRNAs intergênicas). Porque microRNAs intragênicos são comumente transcritos em conjunto com os seus genes do hospedeiro 19 o promotor é normalmente encontrado imediatamente upstream, o local de início da transcrição. No entanto, para muitos microRNAs intergênicas o local de início da transcrição é mal anotadas, e instrumentos de previsão que são comumente usados para genes que codificam proteínas executar mal 20.
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Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Fundação CLL Global Research. A Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center é apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde através de um Centro de Suporte Grant Câncer (P30CA16672).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0.45 µm syringe filter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100 kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol reagent | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Cell line human | Sigma-Aldrich | 85120602 |
References
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