Abstract
而蛋白质编码基因的转录调控被广泛研究,知之甚少转录因子如何参与非编码RNA的转录,特别的微RNA。在这里,我们提出了一个战略,研究使用规范公开提供的数据,计算资源和高吞吐量数据的microRNA的转录转录因子的潜在作用。我们使用的H3K4me3的后生签名从ENCODE项目识别微RNA启动子和染色质免疫沉淀(ChIP)-sequencing数据,以确定被富含转录因子结合位点的微RNA启动子。通过转染与shRNA的靶向感兴趣的转录因子和使细胞微RNA阵列感兴趣的细胞中,我们研究这转录因子对微RNA转录的影响。作为一个说明性的例子,我们使用我们的研究STAT3的慢性Ly的微小RNA转录的影响mphocytic性白血病(CLL)细胞。
Introduction
微RNA是内生的小非编码调控RNA,通常在转录后水平起作用的mRNA表达的作为负调节。大约1000非编码20至25个核苷酸长的微小RNA在人类基因组中的1,2-找到。微RNA调节通过微RNA及其互补种子匹配序列,其通常位于3'非翻译区的靶mRNA的(UTR)的种子序列之间规范碱基配对的基因表达。总的来说,微RNA调控的蛋白质编码基因3超过30%,但仅知之甚少从微RNA的DNA的转录。它已被提出,微RNA转录的调节类似于表达4,5。特别是,类似于其在促进蛋白质编码基因的转录活性,转录因子被认为激活微RNA 6的转录。转录因子-MicroRNA相互作用已被报告为基因表达7的调制因子,并且还可以形成反馈和前馈回路。例如,Yamakuchi 等报道的反馈环路,其中的p53诱导microRNA34a,表达这反过来又抑制了p53的阻遏SIRT的翻译,并由此提高p53活性8。
而微RNA的转录因子依赖性表达的具体例子,已报道,缺乏其中提供了关于感兴趣的转录因子如何调节微小RNA-转录的表达信息的被接受的方法。本文所提出的协议的目的是提供微小RNA-转录的转录依赖性因子调控的进行了深入的说明。通过结合公开可用的数据,生物信息学工具,并使用微阵列技术,谁遵循这个算法的研究人员将能够捕获基因组规模如何的任何在任何感兴趣的细胞类型的转录因子调节微小RNA-转录的表达和在调节微RNA表达探索转录因子mRNA的推定贡献。
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Protocol
1.识别微小RNA基因的启动子转录因子结合位使用数据挖掘方法
- 使用美国加州大学圣克鲁兹分校(UCSC)基因组浏览器作为提取DNA元素(ENCODE)项目的百科全书的一部分生成染色质免疫沉淀(芯片)测序数据。
- 打开在UCSC基因组浏览器表浏览器。
- 使用以下规格提取表:类群:(哺乳动物),基因组(人),大会:(Feb2009(GRch37 / hg18)),组(监管),跟踪(TxnFactorChIP),表(weEncoderesTFbsCo7steredv3),区域(基因组),输出格式(从选定表中的所有基因)。
- 从保存1.1.2输出为.txt文件,并到电子表格中。
- 排序和过滤感兴趣的转录因子( 例如 ,STAT2)。
- 使用基于H3K4me3的表观遗传签名的microRNA发起人提供Baeer 等人名单。9
- 根据人类基因组坐标相匹配时,数据从1.1和1.2( 例如 ,STAT3上推定的微小RNA的启动子结合)映射,并使用C语言编写的尖锐的代码确定为在补充所述编码文件1中位结合亲和力。
2.使用的shRNA下调利率的转录因子的表达
- 板从于10cm板293人胚肾细胞系在约50%汇合(含10%FBS)的1.5×10 6个细胞。
- 从用含有shRNA的绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒的5微克293人胚肾细胞系转染细胞定向到感兴趣的转录因子,并与使用转染试剂,根据制造商的协议的贴壁细胞的包装载体的5微克。
- 作为对照,转染从293人胚肾细胞系的细胞加扰的shRNA和根据制造商的协议的包装载体。
- 保持对细胞转染混合物16小时(在37℃,CO 2培养箱),然后改变媒体至10ml新鲜的10%DMEM培养基含10%FBS。
- 等待48小时转染后,离心细胞培养物(300 XG,5分钟),并收集感染上清。通过0.45μm注射器式滤器(25毫米无表面活性剂的醋酸纤维素膜)过滤上清液以除去任何漂浮的细胞。
- 浓缩上清液,用超离心过滤装置与100 kDa的门槛收集慢病毒。旋转950 XG 30 - 60分钟,直到量一直精矿小于250微升。在-80℃保存浓缩病毒。
- 转染用慢病毒的细胞。从-80℃冷冻机中取出冷冻的慢病毒和解冻至室温。转移100μl病毒上清到一个新的1.5 ml离心管。
- 布林克音量在管到1ml具有降低的血清培养基。聚凝胺添加到1ml病毒悬浮液为10ng / ml的终浓度,轻轻混合并让该混合物静置5分钟。
- 离心机5×10 6个细胞的每个转导并轻轻重悬细胞沉淀在0.5ml的含有病毒的介质。让细胞留在培养箱中4 - 24小时,然后加入0.5毫升20%FBS的培养基中,以10%的FBS的最终浓度。
- 等待48至72小时,并弄脏用碘化丙锭(PI),并根据制造商的说明绿色荧光蛋白(GFP)的细胞。避光细胞,并用流式细胞分选仪来测量GFP + / PI的价格-细胞。由于PI污渍只有死细胞,这一比率在活细胞的转染效率的估计。
- 如前面所述10排序的阳性细胞数来GFP表达(GFP +)通过FACS分拣机。
- 利用Weste氡免疫印迹如前所述10之前,并与指定的shRNA感染感兴趣的细胞(例如,白血病细胞)后,以确定所关注的转录因子的水平。
3.确定微RNA转录的表达水平与转录因子的shRNA转染细胞
- 使用商业试剂盒根据制造商的协议的RNA分离。
- 标记的RNA和其杂交到微RNA微阵列11。
- 确定与转录因子的shRNA或空载体对照5转染的细胞中差异表达的microRNA。
- 验证用于使用实时PCR 5的最差异表达的微小RNA的微阵列结果。
4.确定生物信息学和shRNA的途径之间的重叠在描述转录因子相关转录
- 要DET貂窝藏转录因子结合在其发起人地点和转录因子的shRNA表达下调转染细胞的microRNA基因的预期和观察到的比例,做到以下几点:
- 获得窝藏感兴趣的转录因子在从1.3生成的列表中的启动子/总微小RNA基因的比率。这个名单是预期的比率( 例如 ,微小RNA基因用STAT3结合位点/总微小RNA基因测试= 0.25)。
- 确定在转录因子的shRNA转染的细胞下调从3.3生成的列表并且具有从1.3生成的列表兴趣结合位点的转录因子的基因的数目。下调的基因的这个数/总数是所观察到的比例( 例如 ,微小RNA基因用STAT3结合位点/总数下调微小RNA = 0.6)。
使用χ2统计比较上述生成的观察值与预期的比率,并确定是否在转录因子的shRNA转染的细胞下调的基因的列表与在其启动子的转录因子结合位点富集。
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Representative Results
STAT3是其通常导致具有抗凋亡和增殖作用12个基因的转录的转录因子。无论是STAT3也影响了非编码RNA的转录,目前尚不得而知。在所有CLL细胞STAT3是丝氨酸残基707组成10,13磷酸化。磷酸STAT3梭到细胞核,与DNA结合,并激活已知由酪氨酸pSTAT3的在其他细胞类型10激活的基因。因为CLL特征是微小RNA网络14的全球解除管制,我们推测,丝氨酸pSTAT3的的存在影响微RNA在CLL细胞中的表达。
为了检验这一假设窝藏STAT3结合位点必须被识别的微小RNA的启动子。通过横渡由贝尔等人与H2K4me3组蛋白modifi地区的9所产生的数据阳离子表征子网站,与STAT3结合由芯片起实验发现了15个站点,假定STAT3结合位点进行鉴定。使用这种方法在近25%具有结合分数范围从100(得分最低)到1000(最高分)( 表1)研究(N = 200)的微小RNA基因的检测到160推定的启动子。
接着CLL细胞用STAT3-shRNA的或用空载体和使用微小RNA阵列转染并鉴定63微RNA是被下调的转染( 图1)表明STAT3促进这些微小RNA的转录以下。为63下调微小RNA基因的60%(38例)证实STAT3在推定启动子的基因位置的上游结合芯片起数据,显著超过偶然(P <0.0001)的预期。九微小RNA转染后表达下调,这表明STAT3负调控其转录水平。
图1. 用STAT3-shRNA转CLL细胞的减少STAT3蛋白和STAT3 mRNA的表达水平。答 :CLL细胞STAT3基因(左图,通过定量RT-PCR检测)的STAT3-shRNA的水平和STAT3蛋白水平(右图,由西方免疫印迹检测)转染后显著下跌乙 :CLL的微小RNA阵列细胞所描绘的microRNA 23,其表达与STAT3-shRNA的转CLL细胞和CLL细胞与空载体转染的显著差异。小于0.01的P值被 认为是统计学显著C:7微RNA使用谁了STAT3-shRNA的处理后的差异表达的平均表达通过定量RT-PCR法microRNA的数组。短线代表平均值的标准差。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充编码文件1. 请点击这里下载此文件。
微RNA基因 | 染色体 | 启动开始坐标 | 子终点坐标 | 中位数(范围)STAT3结合得分* |
的miR-1205中,miR-1206中,miR-1207 | 8 q24.21 | 128961454 | 128962791 | 1000(1000至00年) |
1 q42.3 | 236045425 | 236047415 | 1000(1000至00年) | |
miR-21的 | 17 q23.1 | 57901872 | 57921277 | 1000(112-1000) |
的miR-3124 | 1 Q44 | 249115404 | 249123965 | 1000(1000至00年) |
的miR-451 | 17q11.2 | 27222251 | 27224114 | 1000(1000至00年) |
的miR-92B | 1 Q22 | 155162340 | 155168439 | 1000(1000至00年) |
的miR-3197 | 21 q22.2 | 42537544 | 42543023 | 943(943-943) |
的miR-646 | 20 q13.33 | 58712550 | 58715320 | 789(789-789) |
的miR-629 | 15 Q23 | 70383751 | 70394586 | 773(661-885) |
的miR-30E中,miR-30c中-1- | 1 p34.2 | 41173077 | 41177703 | 759(759-759) |
的miR-3125 | 2 p24.3 | 12855381 | 12862915 | 756(756-756) |
的miR-3145 | 6 q23.3 | 138776942 | 138779365 | 743(487-1000) |
的miR-645 | 20 q13.13 | 49199911 | 49201187 | 743(743-743) |
的miR-1256 | 1 p36.12 | 21346830 | 21350211 | 725(725-725) |
的miR-619 | 12 q24.11 | 109248263 | 109253306 | 719(719-719) |
的miR-181A-2中,miR-181b的-2- | 9 q33.3 | 127418928 | 127426139 | 710(710-710) |
的miR-29A中,miR-29b的-1 | 7 q32.3 | 130583383 | 130597803 | 697(482-1000)|
的miR-202 | 10 q26.3 | 135069499 | 135077337 | 696(393-1000) |
的miR-3142中,miR-146a的 | 5 Q34 | 159890882 | 159899475 | 671(671-671) |
的miR-548C | 12 q14.2 | 65000968 | 65011503 | 660(660-660) |
的miR-630 | 15 q24.1 | 72764289 | 72769197 | 627(255-1000) |
的miR-135B | 1 q32.1 | 205416952 | 205452990 | 622(245-1000) |
的miR-29C中,miR-29b的-2- | 1 q32.2 | 207991044 | 208002382 | 608(608-608) |
的miR-1825 | 20 q11.21 | 30791020 | 30798310 | 604(209-1000) |
的miR-548H-1 | 14 q23.2 | 64578834 | 64581657 | 587(174-1000) |
的miR-612 | 11 q13.1 | 65183633 | 65198528 | 581(157-1000) |
的miR-148B | 12 q13.13 | 54717640 | 54721204 | 578(578-578) |
的miR-3174 | 15 q26.1 | 90543381 | 90549092 | 576(152-1000) |
let7a-3,let7b | 22 | 46480680 | 46481826 | 573(146-1000) |
的miR-1255a | 4 Q24 | 102263848 | 102272541 | 557(557-557) |
表1.推定的microRNA与STAT3结合位点推动者。该协议提供了一个方法来确定转录因子使用公布的数据的数据挖掘的microRNA假定推动者结合。作为一个例子,我们在这里提出一个表,描绘STAT3的结合假定的microRNA推动者。结合比分从公布的ENCODE项目15的一部分,全基因组序列的ChIP数据的0到1,000规模给出。启动子是由H3K4me3的后生签名9的存在下确定。
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Discussion
蛋白质编码基因的RNA聚合酶II-依赖性转录背后的机制已被广泛研究。而这些元素组成只有1% -人类基因组的2%,从ENCODE项目证据表明,人类基因组的80%以上的可经历转录17和什么调节非编码DNA元件的转录在很大程度上仍然未知6 。
几项研究,表明聚合酶II也负责的一些非编码蛋 白的基因,包括微RNA 6的转录,导致我们开发出从公共可用的资源,计算算法和体外研究结合数据破译的可能性的策略在调节微RNA的转录感兴趣的转录因子的功能。在此提出的战略包括2个关键步骤。首先,我们使用公开可用的数据来确定转录因子Binding微RNA推动者。为此,我们使用由ENCODE联盟出版,以确定转录因子结合和:代表启动子的microRNA启动子的一个间接指标后生签名芯片序列数据。从这些数据集穿越遗传坐标提供了如何频繁感兴趣的转录因子结合的microRNA启动子的总估计。第二,通过使用shRNA的技术沉默的转录因子的表达和使细胞微RNA阵列,能够探索对微小RNA-转录的转录因子的功能意义。
在微RNA表达的变化仅部分由转录因子依赖性调节进行说明。化学计量变性和其他细胞或细胞外因素发挥重要作用,并在该算法并不模拟。其它限制包括以下内容:基于所述H3K4me3的启动子的分析签名于939注解的microRNA完成。自那时以来,有更多的微RNA的基因组的位置被确定。然而,我们所知的更全面的列表的是基于数据库更新资料尚未公布。 939微小RNA的基因,其代表子区域的H3K4me3的在781微RNA基因(83%)被确定。因此,当该分析清楚地基于不完整的数据集它捕获微小RNA-转录的显著部分。
此外,表观遗传学签名部分地压印和部分细胞特异性。因此,通过表观遗传学标记中定义的假定发起人的generability可能会受到质疑。因为H3K4me3的持续独立转录18的人们普遍认为印迹的启动子的标记。因此,分析算法,我们在此建议可能会错过细胞特异性启动子的microRNA,如果这些启动子分别在不同的小区标识类型。最后,任何结论应该进行测试和经验的证实。最值得注意的是,转录因子的下调之间的关联(使用shRNA的方法)和微RNA表达(通过微RNA阵列标识)只能建议应当通过上可接受的试验,例如染色质免疫沉淀或电泳迁移率来确认一个直接转录的作用变动分析(EMSA)。修改本文所提出的方法包括:识别微小RNA的启动子的不同的方式和不同的方式撞倒的转录因子的表达,例如,小干扰RNA代替的shRNA。微RNA的转录调控可用于驻留于蛋白质编码基因(基因内微RNA)和那些不(基因间微RNA),该微RNA基本上不同。由于基因内微RNA结合转录通常与宿主基因19启动子通常会立即发现upstream为转录起始位点。然而,对于许多基因间的微小RNA的转录起始位点被注解不佳,和预测工具,通常用于蛋白质编码基因表现不佳20。
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Acknowledgments
这项研究是由来自全球CLL研究基金会的资助。得克萨斯大学MD安德森癌症中心的大学是由美国国立卫生研究院的部分通过一个癌症中心支援津贴(P30CA16672)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
0.45 µm syringe filter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100 kDa | Merck Millipore | ||
Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
TRIzol reagent | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
293 Cell line human | Sigma-Aldrich | 85120602 |
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