Introduction
جعلت أبحاث السرطان مؤخرا التطورات الهامة في تحديد الطفرات الجينية، والتغيرات الجزيئية والعلاجات الممكنة لمجموعة متنوعة من أورام المخ. وعلى الرغم من هذا التقدم، لا تزال أورام المخ واحدة من الأسباب الرئيسية للوفيات المرتبطة بالسرطان للبالغين والأطفال. وتشمل العوامل التي تحد في مجال البحوث ورم في المخ القيود المفروضة على توفر عينات المريض الابتدائية وخطوط الخلايا وصعوبة في تكرار المكروية الدماغ فريدة من نوعها وغير المتجانسة في النظم التجريبية يمكن الوصول إليها. بالنسبة لكثير من أورام الدماغ الشروط المطلوبة للحفاظ على الخلايا السرطانية مع مرور الوقت ليست معروفة بعد. حتى لعلاج أورام المخ التي يمكن زراعتها في تعليق خلية كما neurospheres، وظروف ثقافة قد تؤثر على الخلايا السرطانية 1،2. في الواقع، فإن إضافة عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية أو عامل نمو البشرة لتشجيع انتشار وتمنع التمييز قد يغير التعبير الجيني 1. طرق أخرى لنمو الخلايا السرطانية من هذا القبيلكما نشر الورم في الفئران عن طريق طعم أجنبي مثلي أو تحت الجلد من الخلايا السرطانية هي فحوصات قيمة، ولكنها محدودة بسبب عوامل مثل الوقت من تطوير ورم (وخاصة بالنسبة للأورام درجة منخفضة)، والتكلفة، وعدد الخلايا السرطانية التي يمكن حقنها ودرس . الأساليب الحالية وبالتالي لخلايا ورم في الدماغ البشرية المتنامية غير كافية للحفاظ على أنواع الأورام معينة، وغالبا ما توفر بيئات اصطناعية التي لا تحاكي بشكل وثيق في الجسم الحي بيئات الورم.
أنواع متميزة من أورام الدماغ عند الأطفال تنمو في مواقع متخصصة للغاية داخل المخ [3، 4] وهذا من المرجح أن تعكس متطلبات microenvironmental متميزة لنمو الورم [5]. يصف هذا البروتوكول بوضع نظام جديد حيث الخلايا التي يصعب نشر في ظروف التربية العادية يمكن زراعتها في المكروية الدماغ عضوي النمط الذي يحاكي في ظروف نمو الورم الجسم الحي. في هذا الاختبار الكمي، fluorescently المسمىومطلي الخلايا السرطانية في الدماغ في الأحداث شرائح عضوي النمط مخ الفأر ومراقبتها مع مرور الوقت. هذا الاختبار يمكن أن تستخدم لدراسة تأثير المكروية على نمو الورم، واختبار علاجات دوائية جديدة في المكروية الدماغ ذات الصلة سريريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت الإجراء التالي التي تجرى على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان السرطان المؤسسي دانا فاربر: بيان الأخلاق. وجرى استعراض جميع المواد الإنسان العمل الذي يقوم به المجلس لجان المراجعة المؤسسية للبريغهام ومستشفى النساء ودانا فاربر للسرطان معهد وجامعة ستانفورد للاستخدام المناسب، أن المستنيرة تم الحصول عليها من جميع المواد عند الحاجة، والتنازل المناسب لمتطلبات الموافقة تم الحصول على دراسات المخاطر ضئيلة.
الجدول الزمني للبروتوكول الثقافة شريحة:
الشكل 1. الجدول الزمني للبروتوكول استئصال ورم من الدماغ / شريحة عضوي النمط المشارك الثقافة. هذا الرقم يصور الجدول الزمني لإجراء ثقافة شريحة يشمل جميع الأيام الثمانية سو التجربة والخطوات الرئيسية لهذا الإجراء. الجدول الزمني نسبة إلى يوم 0 عندما ومطلي الخلايا على شريحة من أجل تسليط الضوء على أهمية البدء في أيام الإجراء قبل خلايا الطلاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. تشريح العازلة
- إعداد 15 ملي HEPES (1 M)، 6.5mg / الجلوكوز مل، 1.3 ملي MgSO4 (1 M)، و 20 ملي بوكل (2 M)، و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين في 1X HBSS.
- ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم.
- تصفية وتخزينها في -20 ° C.
2. شريحة الثقافة وسائل الإعلام
- إعداد 2٪ B-27، 1٪ ملحق N2، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، 1٪ Glutamax، و 1.5 ملغ / مل الجلوكوز في Neurobasal-A ناقص الفينول متوسطة الأحمر.
- تصفية وتخزينها في -20 ° C. ذوبان الجليد عند الحاجة، وتجاهل بعد 1 أسبوع في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يمكن أن يتم الإجراء التالي حتى علىقبل البدء في تشريح يوم ه. - 3٪ انخفاض نقطة انصهاره الاغاروز
ملاحظة: يمكن أن يتم إجراء متابعة ليوم واحد قبل البدء في تشريح. - مزيج 0.9 ز نقطة انصهار منخفضة الاغاروز إلى ~ 31 مل من العازلة التشريح، والميكروويف لمدة 25 ثانية مع غطاء فضفاض. الميكروويف حتى يذوب والتأكد من خليط لا تجاوز.
- الحفاظ على 55-65 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
ملاحظة: يمكن أن يتم إجراء متابعة ليوم واحد قبل البدء في تشريح.
4. معطف ثقافة إدراجات شريحة مع Laminin
ملاحظة: يمكن أن يتم إجراء متابعة ليوم واحد قبل البدء في تشريح.
- في نسيج الثقافة هود، وذلك باستخدام ملقط معقم، ضع شريحة واحدة ثقافة إدراج في كل بئر من لوحة 6 جيدا (مطابقة عدد من شرائح كنت تنوي الحصول على حوالي 12 يمكن جمعها من إجراء واحد. هو مكتوب الإجراء التالي ل ست شرائح). ملء 15 مل المخروطية ر أوبي مع برنامج تلفزيوني 1X (800 ميكرولتر / إدراج) وإضافة laminin (10 ميكروغرام / مل).
- إضافة 800 ميكرولتر من الخليط laminin إلى أعلى كل إدراج ثقافة شريحة. احتضان عند 37 ° C لحين الحاجة إليها.
5. التحضير للتشريح
- ملء كل بئر من لوحة 6 جيدا مع 1200 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة شريحة. ملء أي الآبار غير المستخدمة مع 1200 ميكرولتر PBS وملء الفراغ وسط لوحة مع 5 مل 1X PBS. تخزين هذا الطبق عند 37 درجة مئوية.
- تعقيم أدوات تشريح في الايثانول 70٪. مسح vibratome شفرة مع الأسيتون لإزالة النفط وتعقيم قبل الاستخدام.
- وضع ثلاثة 35 مم 2 الأطباق وخمسة 10 سم 2 أطباق زراعة الأنسجة في غطاء محرك السيارة. ملء واحدة 10 سم 2 طبق مع العازلة تشريح ومكان على الجليد.
ملاحظة: عملية ولادتها في وقت واحد.
6. تشريح
ملاحظة: عملية ولادتها في وقت واحد.
وفاق / ftp_upload / 53304 / 53304fig2.jpg "/>
الشكل 2. التخفيضات تشريح. هذه الصور تظهر تخفيضات تشريح اللازمة لإزالة الجمجمة من دماغ الفأر P6. وترد التخفيضات خطوط منقط. (A) قطع يظهر 1. يتم إجراء تخفيضات 1 و 2 من جذع الدماغ / الخلفي ثنائيا الاتصال محجر العين على كل جانب .. (B) يخفض يتم عرض 3 و 4. قطع 3 مصنوع من محجر العين واحدة إلى التخفيضات التي تربط أخرى 1 و 2. قص 4 يبدأ في خط الوسط لقطع 3 ويستمر نحو طرف الأنف تقسيم الجمجمة بين بصيلات الشم (مقياس بار = 4.4 ملم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
- تخدير الماوس P6 باستخدام التعرض الأيزوفلورين (100٪ الأيزوفلورين). بعد حوالي 5 دقائق تباطأ عند التنفس أو أن هناك أي علامة على التنفس، وسرعان ما قطع رأسالفأر مع مقص حاد. رذاذ الرأس مع 70٪ من الإيثانول ومكان في صحن زراعة الأنسجة.
- باستخدام الملقط حادة كبيرة عقد رئيس ثابت عن طريق الاستيلاء على الأنف. باستخدام مقص تشريح المتوسطة الحجم، وإزالة الجلد الزائد للكشف عن الجمجمة.
- إجراء تخفيضات 1 و 2 عن طريق قطع الجمجمة بشكل ثنائي، من الخلفي من الجمجمة نحو الأمام على كل جانب، وربط قطع لتجويف العين. الحفاظ على غيض من مقص أقرب إلى الجمجمة ممكن لتجنب تلف الأنسجة.
- لقطع 3، واستخدام مقص الربيع الصغيرة للاتصال تخفيضات 1 و 2. ثم استخدام الملقط حادة صغيرة لتقشر بلطف الجمجمة.
- باستخدام مقص الربيع الصغيرة، وقطع بلطف الجمجمة المتبقية على طول خط الوسط على القمة، بحيث الجمجمة المتبقية تصبح 2 نصفين (الشكل 2، وقطع # 4). باستخدام ملقط تقشر الجمجمة للكشف عن اثنين من بصيلات الشم.
- إدراج ملعقة مسطحة الوجه (مبلل مع العازلة تشريح، وبالتالي فإن الأنسجة لا التشبث به) بين بottom من الدماغ وقاعدة الجمجمة، وإزالة بلطف الدماغ ووضع في صحن يحتوي عازلة تشريح على الجليد.
- كرر الخطوة 6 للحصول على الدماغ الثاني تشريح ل
7. تضمين العقول في الاغاروز
- وضع اثنين من 35 ملم 2 أطباق مفتوحة على الجليد ومسح أسفل زوج من الملقط حادة كبيرة مع 70٪ من الإيثانول.
- صب 3٪ منخفضة ذوبان نقطة الاغاروز (المعد في الخطوة 3) في أطباق اثنين حتى أشكال قبة على القمة. تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 3 دقائق. في 3 دقائق (اختبار عن طريق لمس حافة مليئة الاغاروز القبة، إذا بلمرة الاغاروز يمكن ملاحظة، انها جاهزة) التقاط الدماغ واحد مع ملقط حادة والمكان إلى جانب وجود 35 مم طبق مملوء الاغاروز، ثم التحرك إلى وسط الطبق (هذا يزيل عازلة تشريح الزائدة حول الدماغ لذلك يتصاعد أفضل).
- أكرر للدماغ 2 الثانية. بدء الموقت لمدة 10 دقيقة.
- بعد 10 دقيقة، تضاف ملعقة مسطحة في الفضاء بينالاغاروز وطبق لموسيقى البوب خارج الاغاروز بلمرة تحتوي على العقول P6.
- استخدام شفرة حلاقة شقة لتقليم الاغاروز إلى المكعب حول الدماغ، والتأكد من أن حواف هي كما مستقيم ممكن.
- وضع superglue على لوحة vibratome في شريطين. ثم، والتقاط الاغاروز شنت الدماغ وبلطف إسقاطه إلى أسفل على الغراء، ووضع لشرائح السهمي. تفعل الشيء نفسه للدماغ الآخرين. تأكد تصطف على حد سواء العقول مع بعضها البعض.
- السماح للالغراء الجاف في RT لمدة 5-8 دقيقة. خلال هذا الوقت، وملء منطقة حامل الجليد من vibratome مع الثلج المجروش والماء.
8. التقطيع مع Vibratome
- وضع خزان القطع في منطقة حامل الجليد، تحريك علامة التبويب إلى اليمين لتثبيته في مكانه.
- باستخدام برنامج تشغيل رأس المسمار دائري، والتقاط لوحة vibratome دائرية مع العقول لصقها على ذلك، وأنها تناسب في الخزان. إزالة سائق المسمار وتأمين لوحة في مكان مع الالبريد سداسية الرأس المسمار سائق. تأكد من أن لوحة وخزان قطع راسخة في مكانها.
- باستخدام ملقط، وبيك اب شفرة vibratome، يصلح لها في قطع الرأس، وقفل في مكان مع سائق المسمار سداسية. ثم، وتأمين قطع الرأس مع شفرة تعلق على vibratome باستخدام المسمار الجولة.
- طرح موقف حلاقة لأقرب إلى العقول agarose جزءا لا يتجزأ وقت ممكن، في حين التأكد من الحلاقة هي على نفس الارتفاع (أو فوق) العقول. ملء الغرفة مع المخزن ما يكفي تشريح الباردة لتغطية شفرة.
- الصحافة ↕ الزر مرة واحدة (يجب أن نرى ذلك وميض، ويعرف هذا الزر حدود عندما نصل سوف يذهب ذهابا وإيابا)، ثم اضغط "إلى الأمام" لخفض الدماغ جزءا لا يتجزأ، وإطلاق سراح يدويا حتى مسح الحلاقة كتلة agarose. اضغط على الفور ↕ الزر مرة أخرى، وهذا سوف تحدد نهاية النطاق لقطع التلقائي.
- اضغط على زر "واحد / CONT" مرة واحدة ولآيت التي كتبها CONT يجب أن تستمر. تعيين سماكة القطع إلى 400-450 ميكرون، وتهتز تردد ل5،5-6، وسرعة إلى 4. وسيكون هذا الإعداد التشذيب.
- اضغط على زر "بدء / إيقاف" مرة واحدة، ويجب أن يبدأ القطع التلقائي. اضغط على "وقفة" لجمع الأنسجة باستخدام ملعقة ذات ثقوب، حسب الحاجة. ينبغي أن يستغرق حوالي 5-10 دقيقة، للوصول إلى أقرب إلى خط الوسط. عند هذه النقطة، اضغط على "وقفة" وتغيير السرعة إلى 3 وتغيير سماكة 200 ميكرون. لا نجمع شريحة الأولى المنتجة بعد إجراء هذا التغيير.
- سوف شرائح المرجوة من 200 ميكرون سمك يكون في البصلة الشمية من خلال المخيخ تعريف جيد. نقل كل شريحة على النحو المرغوب فيه يتم قطع الى 6 لوحات جيدا مليئة عازلة تشريح على الجليد. القيام بذلك عن طريق تحريك عازلة في غرفة التشريح في جميع أنحاء الأنسجة لتعويم شريحة، لمسها أقل قدر ممكن، رفعه من المخزن المؤقت عندما يكون مباشرة على ملعقة فترة زمنية محددة. عادة حوالي 12 شرائح مع الهياكل المطلوبة يمكن جمعها. شرائح يمكن أن تترك في تشريح عازلة على الجليد لمدة تصل إلى 20 دقيقة.
- بينما شرائح هي على الجليد، واخراج لوحة 6 جيدا مع تدرج يجري المغلفة مع laminin من 37 درجة مئوية الحاضنة. في غطاء محرك السيارة تشريح تجاهل laminin مع الحرص على عدم الإضرار تدرج. إضافة 3.5 مل من شريحة سائل الإعلام والثقافة إلى أعلى كل إدراج. والجزء العلوي من وسائل الإعلام تشكل على شكل قبة من دون إراقة للخروج الى الآبار.
9. طلاء للشرائح على إدراجات
- باستخدام أداة ملعقة فترة زمنية محددة، ضع شريحة الدماغ في وسائل الإعلام على إدراج، دفع بلطف شريحة لتكون مغمورة تماما. أكرر لجميع شرائح.
- استخدام P1000 لاستخلاص 1 مل من شريحة سائل الإعلام والثقافة من أعلى إدراج والاستغناء عليه في قاع البئر. إزالة والتخلص من الزائد وسائل الإعلام حتى حواف الاغاروز حول الدماغ slicebecome مرئية. هل هذا للشرائح المتبقية.
- التقاط رانه إدراج بواسطة حافة بالملقط، والميل وإزالة وسائل الاعلام الزائدة. ثم، ونقل بسرعة إدراج في 35 ملم 2 طبق تحتوي على 1 مل من وسائل الإعلام ثقافة شريحة. استخدام 2 أزواج من الملقط حادة لإزالة الاغاروز في جميع أنحاء الأنسجة، مع الحرص على عدم تمتد / شريحة الضرر أو كزة ثقب في غشاء (أسهل إذا قمت بإجراء المسيل للدموع على حافة جدا من الاغاروز، ثم مزق الاغاروز من كلا الجانبين). ثم نقل إدراج العودة إلى لوحة 6 جيدا وتكرار للشرائح المتبقية.
- في نسيج الثقافة هود مع منفاخ قبالة (لمنع شرائح من الجفاف) إزالة شظايا الاغاروز من كل الغشاء.
- نقل شرائح لوحة 6 جيدا أعدت في الخطوة 5.1 و تخزين لوحة عند 37 ° C. احتضان شرائح لمدة 24-48 ساعة.
10. تغيير الثقافة وسائل الإعلام شريحة
- كرر الخطوة 5.1 مع لوحة 6 جيدا جديدة.
- في نسيج الثقافة هود مع منفاخ قبالة، ونقل إدراج لوحات جديدة 6-جيدا تابعaining سائل الإعلام شريحة جديدة.
11. طلاء الخلايا السرطانية على شريحة
- يصوتن الصبغة سم الجاذبة وتدور على سرعة متوسطة لمدة 2 دقيقة.
- تدور باستمرار الخلايا السرطانية تستخدم لتراكب في 201 x ج لمدة 5 دقائق. resuspend ثم في 2 مل من وسائل الإعلام ثقافة شريحة.
- إضافة 7 ميكرولتر من سم-الجاذبة في مل 2 من الخلايا وسائل الإعلام واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- تدور باستمرار الخلايا في 201 x ج لمدة 5min و resuspend في 200 ميكرولتر من وسائل الاعلام تشريح. يسحن بلطف لفصل الخلايا (10-20 مرات أو حتى يزول بيليه) ثم قم بإضافة 800 ميكرولتر تشريح وسائل الإعلام لجعل 1000 ميكرولتر اجمالى حجم.
- عد الخلايا السرطانية قابلة للحياة باستخدام التريبان الأزرق. إضافة المجهرية الفلورية الخضراء إلى الخلايا السرطانية، في نفس التركيز كما الخلايا. وهذه المجهرية الخاملة بمثابة السيطرة. تدور باستمرار الخليط خلية / microsphere في 201 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend في المبلغ المطلوب من وسائل الإعلام ثقافة شريحة. لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة من 6000 خلية / SLالثلج في 65 حجم ميكرولتر. ويمكن زيادة عدد الخلايا مطلي لكل شريحة اعتمادا على تفضيل ومدى توافرها.
- في الثقافة غطاء محرك السيارة الأنسجة الاستغناء الخلايا في 65 ميكرولتر من وسائل الإعلام / شريحة على مركز للشريحة.
12. التصوير وإصلاح
ملاحظة: نيكون الكسوف ني C2si تستقيم تم استخدام متحد البؤر لاتخاذ مسح صورة كبيرة لشريحة السهمي كلها في 4X مع قنوات الفلورسنت الحمراء والخضراء. إذا ميزة المسح غير متوفرة، التقاط صور متعددة بالتسلسل عبر شريحة وفيما بعد غرزة الصور معا في فوتوشوب (باستخدام موقع المجهرية وحافة شريحة للتنقل).
- في اليوم التالي (يوم 1 التصوير)، ونقل إلى ست شرائح 35 مم 2 الأطباق مع 1 مل شريحة سائل الإعلام والثقافة. صورة كل شريحة واحدة في وقت واحد على المجهر تستقيم الفلورسنت. خذ مسح صورة كبيرة لشريحة السهمي كلها في 4X مع قنوات الفلورسنت الحمراء والخضراء. الحفاظ الليزروربح نفس إعدادات لكل شريحة. في نهاية التصوير، نقل جميع شرائح العودة إلى لوحة 6 جيدا تحتوي على وسائل الاعلام شريحة جديدة.
- إذا كان المطلوب إضافة EDU، وغيرها من علامة انتشار المخدرات أو شرط، وخلق مخزون من وسائل الاعلام شريحة مع المخدرات التي سيتم استخدامها للتغييرات وسائل الإعلام يوميا لشرط المعاملة. وينبغي الأخذ في حالة العلاج في خطوة 12.1 (مباشرة بعد يوم 1 التصوير). يجب إضافة أي EDU أو انتشار علامة على وسائل الإعلام بدأت أيضا في 12.1 وتحديثها يوميا (استخدام EDU في 10 ميكرومتر).
- الصورة مرة أخرى في يوم 7 باستخدام نفس الإعدادات كما في يوم 1 الصور.
- بعد يوم واحد 7 التصوير اكتمال نقل كل شريحة في لوحة 6 جيدا مع بعضها يحتوي كذلك 1.2 مل من 4٪ لامتصاص العرق (PFA). بعناية وببطء إسقاط 1 مل إضافية من PFA على رأس كل شريحة. ترك في RT لمدة 1 ساعة.
- إزالة PFA من كل بئر ومن أعلى كل شريحة. يغسل كل 3X بشكل جيد مع برنامج تلفزيوني. تخزين الشرائح في برنامج تلفزيوني في4 ° C لتلطيخ أو تصاعد على الشرائح.
قد تحتاج إلى ضبط يماغيج إلى تعديل والأمثل لتفسير الصورة وجودة المجهر فضلا عن حجم الخلية السرطانية: مذكرة.
13. الكمي للصور (عن طريق يماغيج)
قد تحتاج إلى ضبط يماغيج إلى تعديل والأمثل لتفسير الصورة وجودة المجهر فضلا عن حجم الخلية السرطانية: مذكرة.
- في يماغيج، استخدم أداة المضلع على الخطوط العريضة لشريحة بأكملها أو المنطقة التي تريد قياسها كميا. إضافة هذا التحديد إلى مدير ROI حيث يمكنك تسميته وحفظه.
- انقر بزر الماوس الأيمن على المنطقة المحددة واختيار مكررة. اسم هذه الصورة المكررة مع المنطقة، شريحة، اليوم. اضغط CTL + التحول + E لعرض المخطط التفصيلي، ثم حدد معالجة - طرح الخلفية - المتداول الكرة الشعاع = 4.
- بعد الطرح الخلفية، حدد "ضبط عتبة" في "صورة" القائمة المنسدلة. تحقق خلفية داكنة -؛ ننظر إلى الصورة بالتكبير وتعيين العتبة. كما يمكنك تحديد عتبة عن طريق تحريك شريط العتبة، التأكد من تضمين كل خلية / أبرز لكنها لم تدرج النقاط الصغيرة للغاية التي الحطام (أو أصغر من خلية). استخدام نفس العتبة لجميع الصور. نقل الإطار عتبة إلى الجانب.
- حدد "عملية" - "البحث ماكسيما" وتعيين التسامح الضوضاء بين 5 و 10 وتحقق ما يلي: اختيار نقطة المعاينة، نوع الانتاج كما جسيمات مجزأة، واستبعاد حافة ماكسيما، فوق عتبة أدنى. ثم إعادة تحديد المنطقة ذات الاهتمام بالضغط على CTL + التحول + E.
- حدد "تحليل الجزيئات" من القائمة المنسدلة تحليل. تعيين حجم البيكسل إلى 4-40 ودائرية ل0،00-1،00. أيضا النقر فوق "عرض الخطوط العريضة تراكب" "عرض النتائج" و "تلخيص"، ثم اضغط OK.
- تسجيل جميع البيانات الخام وملخص في وثيقة مايكروسوفت أوفيس. و"الكونت" لكل منطقة طق اللازمة لحساب التغير أضعاف على مدى أسبوع في الثقافة.
- كرر هذه العملية لجميع الصور ومجالات الاهتمام، والتأكد من أن عتبة والإعدادات الأخرى تبقى ثابتة.
- حساب التغير أضعاف في عدد الخلايا على شريحة خلال الأسبوع في الثقافة عن طريق قسمة عدد من الخلايا السرطانية على شريحة في يوم 7 من قبل عدد من الخلايا على شريحة يوم 1. وبالمثل، أضعاف تغيير في عدد الخلايا داخل كل منطقة ويحسب بقسمة عدد الخلايا في تلك المنطقة في يوم 7 من عدد الخلايا في تلك المنطقة في يوم 1.
- تنفيذ الخطوة 13.8 لالمجهرية كذلك. يجب أن يكون عدد microsphere على شريحة واحدة في يوم 7 كما في يوم 1 (طويت التغيير = 1). وبالمثل، يجب أن يكون عدد microsphere داخل كل منطقة في نفس يوم 7 كما في يوم 1 (طويت التغيير = 1). إذا يختلف التغيير طية من 1، وهذا يشير إلى تغييرات في شريحة التضاريس مع مرور الوقت.
14. تلطيخ
- الشريط قطعة من parafilm على الالبريد مختبر مقاعد البدلاء ورسم ستة دوائر مع السائل قلم مانع حلمة الثدي (واحد لكل شريحة، فقط أكبر من حجم شريحة). وضع حوالي 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في نقطة في منتصف كل دائرة. رقم أو تسمية الدوائر لتحديد كل شريحة.
- في 1 مل من برنامج تلفزيوني، واستخدام شفرة حلاقة لقطع مربع حول شريحة، وترك بعض المساحة من الغشاء حول شريحة. باستخدام ملقط تحرك قطع شريحة في الدائرة الأولى وبعناية تكمن شريحة على رأس فقاعة من برنامج تلفزيوني. ومن الضروري التأكد من أن شريحة لا أضعاف أكثر على نفسها أو الحصول على انقلبت رأسا على عقب خلال هذه العملية. ثم، وإزالة PBS من تحت شريحة ووضعها على رأس شريحة وإضافة المزيد من PBS إذا لزم الأمر للتأكد من أنها لا تزال مغمورة. كرر هذه الخطوة لكل شريحة.
- جعل 10 مل من 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني. خذ 2 مل، وإضافة 100 ميكرولتر من ديجيتونين إليها. خلط وإضافة إلى شرائح لمنع وpermeabilize، 30 دقيقة في RT.
ملاحظة: استخدام وكلاء permeabilization الأخرى مثل ثلاثيوطن X-100 يؤدي إلى فقدان العلامات CM-الجاذبة. - إزالة permeabilization / حل الحجب وشطف 3X مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
- إذا تلطيخ لEDU، اتبع الإرشادات التي قدمتها عدة لتجميع الخليط. ضعي الخليط لمدة 45 دقيقة. إذا تلطيخ مع الأجسام المضادة أخرى، يجب أن يكون الأمثل بروتوكول للتركيز الأجسام المضادة الأولية والثانوية (~ RT 1 ساعة للالابتدائي والثانوي). شطف 3X مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
- وصمة عار مع دابي 1: 1000 في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق RT. شطف 2X مع برنامج تلفزيوني.
15. تركيب شرائح
- نقل شريحة إلى شريحة المجهر. تأكد من أن الجانب الغشاء مع شريحة يبقى مواجهة، ولا أضعاف أكثر على نفسها. رسم الحدود حول شريحة مع السائل مانع حلمة الثدي من ركلة جزاء.
- وضع ساترة زجاجية صغيرة (5 ملم) على كل جانب من شريحة (للحفاظ على شريحة من التلف). إسقاط اثنين أو ثلاث قطرات من Fluoromount-G (لالمناعي) على رأسشريحة لبالكاد تغطية ذلك. ثم تغطية ساترة طويلة شريحة (24 × 50 ملم).
- كرر لكل شريحة. ختم حواف الشرائح مع طلاء الأظافر وتخزينها في 4 درجات مئوية. هل التصوير متحد البؤر من تلطيخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يجسد هذا القسم نوع النتائج التي يمكن توقعها من الاستفادة من ورم في المخ / عضوي النمط شريحة ثقافة مشتركة للتحقيق في تفضيل المكروية الإقليمي وكذلك لاختبار علاجات جديدة. وتبين لنا أن الفحص يهدف إلى تكرار المكروية لعلاج أورام المخ، باعتبارها المنظمة الأنسجة ويتم الحفاظ على الدولة التكاثري للشريحة (الشكل 3). علينا أن نبرهن أيضا أن الزيادة في عدد الخلايا السرطانية على شريحة مع مرور الوقت قد يرجع جزئيا إلى الهجرة من الخلايا على المكروية شريحة الدماغ (الشكل 4). لقد أظهرت أيضا أن هذه الثقافة المشتركة يمكن أن تستخدم لفحص الكمي عن طريق حساب التغيير أضعاف في عدد الخلايا خلال الاسبوع في الثقافة لمناطق معينة من شريحة، أو لشريحة الدماغ بأكمله (الشكل 6) النتائج الأولية متعددة وقد أظهرت أنواع الخلايا السرطانية إلى أن عدد الخلايا السرطانية يمكن كميا بواسطة التصوير متحد البؤر منشريحة سميكة 200 ميكرون يرجع ذلك إلى حقيقة أن الخلايا تهاجر فقط على عمق 20-50 ميكرومتر في شريحة.
لقد وجدنا أن المجهرية الفلورية الخضراء هي رقابة فعالة لإجراء تغييرات في شريحة تضاريس لأنها لا تظهر أي حركة أو تغيير في عدد طوال الوقت في الثقافة (الشكل 5). بعد إصلاح الثقافة المشتركة، ويمكن أن يتم تلطيخ لدراسة الخلايا السرطانية في الدماغ المكروية وآثار المخدرات على انتشار الخلايا السرطانية، موت الخلايا، أو التغييرات في تعبير البروتين (الشكل 7). لقد أثبتنا أن هذا الاختبار يمكن استخدامها لاختبار علاجات العقاقير من خلال المقارنة بين خلايا نخاعي الماوس تعامل مع SMO (مملس) خصم LDE225 (Sonidegib) أو مع السيطرة على السيارة. أضعاف الزيادة في عدد الخلايا على شريحة أكثر من أسبوع واحد في الثقافة كان كميا وتمثيلها بيانيا (عدد الخلايا في يوم عدد 7 / خلية في يوم 1) تشير هذه البيانات إلى أن LDE225 كثيرا ديالطويات عدد الخلايا السرطانية بالمقارنة مع مراقبة 6. ويمكن أيضا أن ينظر إلى هذا المعنى في صور تمثيلية شملت (الشكل 8). وتبين لنا أيضا صور لخلايا نخاعي الإنسان نمت في مقايسة ثقافة شريحة (الشكل 9).
الشكل 3. استئصال ورم من الدماغ / شريحة عضوي النمط المشارك الثقافة الفحص التصميم. (A) عضوي شريحة الدماغ السهمي من ماوس P6 يوضع مباشرة على غشاء شبه مسامي ويضاف المتوسطة إلى أسفل الطبق الثقافة. ومغمورة الثقافة في المتوسط على جانب واحد، ويمكن الوصول إلى الأكسجين من الجانب الآخر. ومضافين الخلايا السرطانية المسمى على شريحة وزنزانة رقم يمكن اتباعها مع مرور الوقت. (B) في الثقافة، ويحافظ على شريحة منظمة الأنسجة التي تشبه تلك التي لوحظت في الجسم الحي. Preservatioويتجلى ن من المكروية الدماغ عن طريق وضع العلامات ايدو من التكاثري السلائف الحبيبية الخلايا العصبية في طبقة الحبيبية الخارجية (EGL) من المخيخ في ثقافة شريحة. في ثقافة شريحة، وهذه الخلايا السلائف تتضمن التناظرية ثيميدين ايدو، كما هو الملاحظ في الجسم الحي في هذه المرحلة التنموية (P6) (السهم الأبيض يشير EGL). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. خلايا ورم الخلايا النجمية الإنسان في استئصال ورم من الدماغ / شريحة عضوي النمط المشارك الثقافة الفحص. زيادة في خلايا ورم في المخ الإنسان على شريحة قد تعكس إعادة المركزية الخلايا السرطانية من الغشاء إلى ثقافة شريحة. (A) وهي منطقة على حافة شريحة في يوم 1 (أعلى) ويوم 7 (القاع) حيث يجوز خلايا م igrate من الغشاء على شريحة الدماغ. (B) والمثال الثاني للهجرة الخلايا المحتملة على الدماغ على حافة الشريحة. يوم 1 (أعلى) ويوم 7 (القاع). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ومضافين الشكل 5. Microsphere تحكم الخرز. يوم 1 (الحمراء)، ويوم 7 صور (الأخضر) السيطرة على المجهرية الفلورسنت (الصفراء) لكشف أي حركة المجهرية أكثر من أسبوع في الثقافة. اتخذت يوم 1 ويوم 7 صور في نفس الموقف داخل شريحة (مقياس بار = 45 ميكرون). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يتم فتح الرقم 6. الكمي في يماغيج. (A) صورة شريحة في يماغيج وشريحة كاملة و / أو ترد المناطق لتقدير. (B) يتم تحديد المنطقة ذات الاهتمام ويتم إجراء صورة مكررة. (C ) يتم طرح مضان الخلفية من الصورة. (D) يتم تعيين الحد الأدنى لحجم الخلية والشكل، وتحديد ما سيتم فرزها. (E) تحليل الجزيئات لحساب عدد الخلايا داخل المنطقة من الفائدة. ويمكن بعد ذلك يتم احتساب تغيير أضعاف في عدد الخلايا بقسمة عدد الخلايا في يوم 7 من عدد الخلايا في يوم 1 لكل منطقة من الفائدة أو المنطقة بأكملها من شريحة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم .
ogether.within صفحة = "دائما"> 
الرقم 7. تلطيخ للانتشار. تجسد صورة كيف يمكن أن يتم ذلك بنجاح تلطيخ (بعد تحديد شريحة في PFA) على شريحة بعد أسبوع واحد في الثقافة. صورة تظهر DAPInuclear تلطيخ (الأزرق)، وخلايا فأر نخاعي الحمراء fluorescently المسمى، ووضع العلامات الأخضر لإدماج التيميدين التماثلية في الحمض النووي كعلامة للانتشار. أدرج EDU في وسائل الإعلام ثقافة شريحة (10 ميكرومتر) لمدة أسبوع واحد (السهام البيضاء تدل خلايا إيجابية لEDU والأسهم الصفراء تشير الخلايا السلبية لEDU) (مقياس بار = 50 ميكرون). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الرقم 8. ماوس Medulloblas خلايا توما تعامل مع LDE225. يوضح هذا الرقم العلاج من تعاطي المخدرات من الخلايا السرطانية في نظام شريحة تراكب الفحص. (A) التمثيل البياني للبيانات التي تم جمعها من تجربة الماوس نخاعي. كان DMSO شرط التحكم (CTL) وLDE225 (Sonidegib) (1 ميكرومتر) (LDE) كان حالة العلاج. أضعاف الزيادة في عدد الخلايا على شريحة أكثر من أسبوع واحد في الثقافة كان كميا (عدد الخلايا في يوم 7 عدد / خلية في يوم 1)، (ن = 12 CTL، ن = 13 LDE، أشرطة الخطأ = SEM). (ب) الممثل صور من السيطرة على السيارة شرائح المعالجة في يوم 1 (أعلى) ويوم 7 (القاع). (C) صور الممثل LDE تعامل شرائح في يوم 1 (أعلى) ويوم 7 (القاع). وقد أخذت صور في 4X التكبير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
9 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 53304 / 53304fig9.jpg "/>
الرقم 9. خلايا نخاعي الإنسان في استئصال ورم من الدماغ / شريحة عضوي النمط المشارك الثقافة. وقد تم الحصول على خلايا نخاعي الإنسان من جيمس أولسون في جامعة واشنطن، وكانت تزرع لمدة أسبوع واحد في مقايسة ثقافة شريحة. (A) يوم 1 صورة الخلايا البشرية نخاعي نمت على شريحة مخ الفأر. (B) صورة من نفس شريحة مخ الفأر مع خلايا نخاعي الإنسان بعد أسبوع واحد في الثقافة (يوم 7). وقد أخذت صور في 4X التكبير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول كيف خلايا ورم في المخ يمكن fluorescently المسمى ومطلي على جزء الدماغ سهمي على فأرة الحاسوب P6 ثم مراقبة لمدة أسبوع واحد في الثقافة. ويمكن استخدام هذا ورم في المخ / عضوي النمط شريحة شارك في الثقافة الاختبار لتحديد تأثير المكروية الإقليمية على عدد الخلايا السرطانية، ويمكن أيضا أن تستخدم كنظام لقياس فعالية من العلاج بالعقاقير الجديدة على نمو الورم البشري. وقد استخدمت دراسات سابقة استراتيجية مماثلة لتقييم دور الدماغ الصغير للبيئة على العصبية 7،8 انتشار السلائف.
هذا الاختبار الذي يتم المصنفة خلايا ورم في المخ في ثقافة شريحة عضوي النمط 9 يوفر نظام لخلايا ورم في المخ الإنسان التي يصعب نشر في ظروف ثقافة الخلية الطبيعية المتزايدة. واحد جانبا مهما من هذا الإجراء هو أهمية الحفاظ على صحة شريحة والخلايا السرطانية. طول الفترة الزمنية التي شرائح الجلوس في المخزن خلال دissection وعلى RT أثناء التصوير ينبغي أن يقتصر، للتأكد من أن شرائح والخلايا لا تزال سليمة قدر الإمكان. إذا كان يتم استخدام خلايا ورم في المخ الإنسان الأساسية في هذا الاختبار، ينبغي مطلي الخلايا على شرائح في أقرب وقت ممكن بعد الخزعة. ولذلك ينبغي أن تكون مستعدة للشرائح قبل الجراحة. لمنع أي تأثير فارق الوقت بين شرائح التصوير، ومقدار الوقت الذي يقضيه خارج الحاضنة يجب أن تكون قصيرة ومتسقة لجميع الثقافات شريحة في تجربة. الضوابط microsphere مهمة لأنها توفر علامات متسقة مكانيا مع مرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك، تشوهات في ثقافة شريحة بسبب الانكماش، تمزق، أو قابلة للطي واضحة للعيان من خلال التصوير الخرز microsphere.
واحدة من القيود من هذا البروتوكول هو أن الخلايا لا يمكن إلا أن نشر هذا النظام في ثقافة شريحة لمدة أسبوع تقريبا. ومع ذلك، بالنسبة لبعض أنواع أورام المخ وهذا هو تحسن كبير على مدى س الدولة الحاليالشؤون F. والقيد الثاني هو أن الدماغ-حاجز الدم هو القضاء، وهو اعتبار مهم في تقييم الأدوية التي يمكن استخدامها لعلاج أورام المخ. والاعتبار الثالث هو أن هذا هو مقايسة الإنتاجية المنخفضة التي لا يمكن استخدامها لاختبار مكتبة من المركبات.
هذا الاختبار هو تنوعا وتعديلها بسهولة لدراسة أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية، ومجموعة متنوعة من الأسئلة التحقيق. هذا البروتوكول يمكن استخدام مقايسة الكمي لدراسة آثار العلاجات الجديدة على بقاء الخلايا السرطانية ونمو (صن وآخرون، اتصال شخصي). مقارنة بين التغيير أضعاف في عدد الخلايا السرطانية في مناطق مختلفة من الدماغ توفر وسيلة لفك رموز آثار المكروية على نمو الورم.
يوفر هذا / شريحة عضوي النمط النظام شارك في ثقافة ورم في المخ أيضا إمكانية للتحقيق في العلاقة بين خلايا ورم في المخ وmicroenvironments محددة في الدماغ. أماهنيويورك أنواع أورام المخ تظهر نمطا واضحا من تطوير في مناطق محددة في الدماغ وmicroenvironments 3،4. من خلال زراعة الخلايا السرطانية البشرية المسمى على شريحة مخ الفأر السهمي، يمكن رصد الخلايا لتفضيل الإقليمية التي يمكن أن تكون متسقة مع المنطقة في الجسم الحي للنمو. مزيد من الدراسة من المكروية أن الخلايا السرطانية تفضل يمكن أن تؤدي إلى تحديد العوامل المحتملة التي تدعم نمو الخلايا السرطانية. هذا الاختبار قد تساعد في تحسين ظروف المختبر في زراعة الخلايا ويمكن أيضا توفير نظام لدراسة كيفية بدء الورم يمكن الوقاية منها أو علاجها على نحو أكثر فعالية.
هناك أنواع معينة من أورام المخ التي لا يمكن نشرها في ظروف زراعة الخلايا العادية أو عن طريق الماوس مثلي أو xenografts تحت الجلد. لأنواع ورم هذه من الصعب لاختبار علاجات العقاقير الجديدة على الخلايا السرطانية البشرية. يوضح هذا البروتوكول أن الخلايا السرطانية في الدماغ البشري يمكن زراعتها في شريحةفحص الثقافة والعلاج بالعقاقير يمكن تقييمها كميا. وبعد العلاج من تعاطي المخدرات، شارك تلطيخ الخلايا السرطانية يمكن أن توفر المزيد من التقييم لتأثير الدواء على انتشار الخلايا السرطانية ومسار إعاقة. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن قد يكون هناك اختلاف جذري بين تأثير المخدرات على الخلايا السرطانية في ثقافة الخلية أحادي الطبقة العادية مقابل ل3D الخلية غير متجانسة ثقافة البيئة 10. الخلايا الظهارية العادية والأورام الكبار وبالمثل، التي لها عمر قصير في المختبر، وقد ثبت أن إعادة برمجة مشروط لدولة التكاثري عندما نمت على الخلايا الليفية التغذية في توليفة مع كيناز رو مثبط 11. هذه الدراسات مزيد من الدعم على أهمية الحفاظ على الخلايا السرطانية في عضوي النمط، 3D، المكروية ذات الصلة سريريا، وأهمية هذا النظام زراعة الخلايا لأبحاث السرطان الحالي. لذلك، هذا هو فحص قيمة لاختبار الأدوية على الخلايا السرطانية البشرية في relevan سريريار الطريقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Invitrogen | 17504044 | |
| Glucose | Invitrogen | 17502048 | |
| Pennicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Neurobasal-A- Medium minus phenol red | Invitrogen | 12349015 | |
| Low Melting Point Agarose | Promega | V2111 | |
| Slice Culture Inserts | Milipore | PICM0RG50 | |
| laminin | Invitrogen | 23017015 | |
| Cm-DiI | Invitrogen | V22888 | |
| EDU (Labeling and Detection) | Life Technologies | c10337 | |
| Microspheres | Life Technologies | F-21010 | |
| Vibratome | Leica | ||
| Confocal Microscope | Nikon Eclipse Ni C2si | ||
| ImageJ software | |||
| 5 mm Cover Glasses | Fisher Scientific | 64-0700 (CS-5R) |
References
- Heddleston, J. M., et al. Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment. Curr Pharm Des. 17 (23), 2386-2401 (2013).
- Sasai, K. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66 (8), 4215-4222 (2006).
- Louis, D. N., et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol. 114 (2), 97-109 (2007).
- Duffau, H., Capelle, L.
- Chourmouzi, D., et al. Manifestations of pilocytic astrocytoma: a pictorial review. Insights Imaging. 5 (3), 387-402 (2014).
- Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci Transl Med. 2 (51), 51ra70 (2010).
- Choi, Y., Borghesani, P. R., Chan, J. A., Segal, R. A. Migration from a mitogenic niche promotes cell-cycle exit. J Neurosci. 25 (45), 10437-10445 (2005).
- Chan, J. A., et al. Proteoglycan interactions with Sonic Hedgehog specify mitogenic responses. Nat Neurosci. 12 (4), 409-417 (2009).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three- dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nat Commun. 6, 6220 (2015).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
