En hjernesvulst / organotypiske Slice Co-kultur System for Studerer svulstens mikromiljø og målrettet Drug terapier

Introduction

Nyere forskning har kreft gjort betydelige fremskritt i å identifisere genetiske mutasjoner, molekylære endringer og mulige behandlinger for en rekke av hjernesvulster. Til tross for denne utviklingen, hjernesvulster er fortsatt en av de beste årsakene til kreft relatert dødelighet for voksne og barn. Begrensende faktorer i hjernesvulst forskning omfatter begrenset tilgjengelighet av primære pasientprøver og cellelinjer og vanskeligheter med å replikere den unike og heterogene hjernen mikromiljøet i tilgjengelige eksperimentelle systemer. For mange hjernesvulster de vilkår som kreves for å opprettholde tumorceller over tid er ennå ikke kjent. Selv for hjernesvulster som kan dyrkes i cellesuspensjonen som neurosfærer, kan dyrkningsbetingelsene påvirke tumorcellene ^1,2. Faktisk, for tilsetning av basisk fibroblast vekstfaktor eller epidermal vekstfaktor stimulere proliferasjon og differensiering hemme kan endre genekspresjon ^1. Andre fremgangsmåter for tumorcellevekst sliktsom tumorutbredelse i mus via ortotopisk eller subkutan xenotransplantat av tumorceller er verdifulle analyser, men er begrenset av faktorer slik som tidspunktet for tumorutvikling (spesielt ved lave grad av tumorer), kostnad, og antallet tumorceller som kan injiseres og studert . Dermed dagens metoder for dyrking av menneskelige hjerne tumorceller er utilstrekkelig for å opprettholde visse krefttyper, og gir ofte kunstige miljøer som ikke tett etterligne in vivo tumor miljøer.

Forskjellige typer pediatriske hjernesvulster vokser i høyt spesialiserte steder i hjernen ^{[3, 4] og} dette gjenspeiler sannsynligvis distinkte microenvironmental krav til tumorvekst ^[5]. Denne protokollen beskriver et nytt system hvor cellene som er vanskelige å forplante seg i normale dyrkingsbetingelser kan dyrkes i et organotypiske hjerne mikromiljøet som etterligner in vivo-tumorvekstbetingelser. I denne kvantitative analysen, fluoresceinmerkethjernetumorceller blir platet ut på unge mus hjerne organotypiske skiver og overvåkes over tid. Denne analysen kan brukes til å undersøke effekten av mikromiljøet på tumorvekst, og for å teste nye medisinsk behandling i en klinisk relevant hjerne mikromiljøet.

Protocol

Etikk Uttalelse: Følgende prosedyre som involverer dyr fag ble gjort i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer og ble godkjent av Dana-Farber Cancer Institutional Animal Care og bruk komité. Alle mennesker arbeidet ble gjennomgått av Institutional Review Board komiteer Brigham and Women Hospital og Dana-Farber Cancer Institute, og ved Stanford University for riktig bruk, som informerte samtykke er innhentet fra alle fag når det er nødvendig, og passende frafallelse av krav om samtykke ble oppnådd for minimal risiko studier.

Tidslinje av Slice Kultur Protokoll:

Figur 1. Tidslinje av hjernesvulst / organotypiske Slice Co-kulturen protokollen. Dette tallet viser tidslinjen av prosedyren skive kultur som omfatter alle åtte dager of eksperimentet og viktige trinn i fremgangsmåten. Tidslinjen er i forhold til dag 0 når cellene er belagt på skive for å markere betydningen av å starte prosedyren dager før plating celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1. Dissection Buffer

1. Forbered 15 mM HEPES (1 M), 6.5mg / ml glukose, 1,3 mM MgSO4 (1 M), 20 mM KCl (2 M) og 1% penicillin / streptomycin i 1 x HBSS.
2. Juster pH til 7,4 med NaOH.
3. Filter og oppbevares ved -20 ° C.

2. Slice Culture Media

1. Forbered 2% B-27, 1% N2 supplement, 1% penicillin / streptomycin, 1% Glutamax, og 1,5 mg / ml glukose i Neurobasal-A medium minus fenolrødt.
2. Filter og oppbevares ved -20 ° C. Tine etter behov, og kast etter en uke ved 4 ° C.
   Merk: Følgende prosedyre kan gjøres opp til påe dagen før du starter disseksjon.
3. 3% lavt smeltepunkt agarose
   Merk: Følgende prosedyre kan gjøres opptil en dag før du starter disseksjon.
4. Bland 0,9 g agarose med lavt smeltepunkt til ~ 31 ml av disseksjon buffer, mikrobølgeovn i 25 sekunder med lokket løs. Mikrobølgeovn inntil smeltet og sørge for at blandingen ikke renne over.
5. Lagres ved 55-65 ° C inntil nødvendig.
   Merk: Følgende prosedyre kan gjøres opptil en dag før du starter disseksjon.

4. Smør Slice Kultur Setter med Laminin

Merk: Følgende prosedyre kan gjøres opptil en dag før du starter disseksjon.

1. I en vevskultur hette, ved hjelp av steril tang, legg en skive kultur innsats i hver brønn av en seks-brønns plate (matche antall skiver du har tenkt å få tak i, kan rundt 12 hentes fra en prosedyre. Fremgangsmåten er skrevet for seks stykker). Fyll en 15 ml konisk t ube med 1x PBS (800 mL / innsats) og legge laminin (10 mikrogram / ml).
2. Legg 800 ul av laminin blandingen til toppen av hver pakning skive kultur. Inkuber ved 37 ° C inntil behov.

5. Forberedelse Dissection

1. Fyll hver brønn av en 6-brønners plate med 1200 ul skive kulturmedier. Fylle eventuelle ubrukte brønner med 1200 mL PBS og fylle midten plass av platen med 5 ml 1 x PBS. Oppbevar denne platen ved 37 ° C.
2. Sterilisere disseksjon verktøy i 70% etanol. Tørk vibratome blad med aceton for å fjerne olje og sterilisere før bruk.
3. Plasser tre 35 mm ² retter og fem 10 cm ² vevskulturskåler i panseret. Fylle en 10 cm ² tallerken med disseksjon buffer og legg på is.
   Merk: Prosess pups en om gangen.

6. Dissection

Merk: Prosess pups en om gangen.

es / ftp_upload / 53304 / 53304fig2.jpg "/>

Figur 2. Disseksjonskurs kutt. Disse bildene viser de nødvendige disseksjon kutt for å fjerne skallen fra hjernen til en P6 mus. Kutt er vist som stiplede linjer. (A) Skjær en vises. Cuts 1 og 2 er laget av hjernestammen / posterior bilateralt koble til øyehulen på hver side .. (B) Kutter 3 og 4 er vist. Klipp 3 er laget av ett øyehulen til de andre tilkoblings Cuts 1 og 2. Klipp 4 begynner på midtlinjen av kuttet tre og fortsetter mot spissen av nesen dele skallen mellom olfactory pærer (Scale bar = 4,4 mm). Vennligst Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1. Anesthetize P6 musen med isofluran eksponering (100% isofluran). Etter ca 5 min når puste er bremset eller det er ingen tegn til respirasjon, raskt halshogge denmus med skarp saks. Spray hodet med 70% etanol og plasser i en vevskulturskål.
2. Bruke store sløv tang holde hodet stødig ved å gripe nesen. Ved hjelp av mellomstore disseksjon saks, fjerne overflødig hud for å avsløre skallen.
3. Gjøre kutt 1 og 2 ved å kutte skallen bilateralt, fra bakre skalle mot fronten på hver side, kobler kuttet til øyehulen. Hold tuppen av saksen så nær skallen som mulig for å unngå skade på vev.
4. For cut tre, bruke små våren saks til å koble kutt 1 og 2. Deretter bruker de små butte pinsett for å forsiktig skrelle av skallen.
5. Ved hjelp av de små fjær saks, forsiktig kuttet værende skallen langs midtlinjen på toppen, slik at den gjenstående skallen blir 2 halvdeler (figur 2, kutt # 4). Bruk pinsett skrelle av skallen for å avsløre de to olfactory pærer.
6. Sett inn en flat-faced spatel (fuktet med disseksjon buffer, slik at vevet vil ikke holde seg til det) i mellom bottom av hjernen og bunnen av skallen, forsiktig fjerne hjernen og legg i formen inneholder disseksjon buffer på is.
7. Gjenta trinn 6 for å oppnå en andre hjerne for kutting

7. Inkludering Hjerner i Agarose

1. Plasser to av de 35 mm ² retter åpne på isen og tørk ned et par store sløv tang med 70% etanol.
2. Hell 3% lavt smeltepunkt agarose (utarbeidet i trinn 3) inn i de to retter til en kuppel skjemaer på toppen. Satt timer for 3 min. På 3 minutter (test ved å berøre kanten av agarose fylte kuppel, hvis polymerisasjon av agarose kan observeres, er den klar) plukke opp en hjerne med butt pinsett og sted inn i siden av en agarose-fylt 35 mm fatet, deretter flytte den til midten av fatet (dette fjerner overflødig disseksjon buffer rundt hjernen så det mounts bedre).
3. Gjenta for ^2. hjernen. Starter en tidtaker for 10 min.
4. Etter 10 min, setter en flat spatel inn i mellomrommet mellomagarose og rett til å sprette ut polymeriserte agarose inneholder P6 hjerner.
5. Bruk en flat barberblad for å trimme agarose inn i en kube rundt hjernen, og pass på at kantene er så rett som mulig.
6. Plasser superlim på vibratome plate i to strimler. Deretter plukke opp agarosen montert hjernen og forsiktig slippe den ned over limet, posisjonert for sagittal skiver. Gjør det samme for den andre hjernen. Kontroller at begge hjerner er stilt opp med hverandre.
7. La limet tørke ved romtemperatur i 5-8 min. I løpet av denne tiden, fyller is holderen området av vibratome med knust is og vann.

8. Slicing med Vibratome

1. Plasser skjære reservoaret inn i isen holder området, flytte fanen til høyre for å låse den på plass.
2. Bruk av sirkulær skrujern, plukke opp den sirkulære vibratome plate med hjernen limt på den, og sett den inn i reservoaret. Fjern skrutrekkeren, og å feste platen på plass med the sekskantede skrujern. Forsikre deg om at platen og skjære reservoaret er godt på plass.
3. Bruk pinsett, pickup vibratome blad, passer den inn i skjærehodet, lås på plass med sekskantet skrutrekker. Deretter fester skjærehodet med den vedlagte kniven på vibratome bruker runde skruen.
4. Ta opp plasseringen av høvelen så nær agarose-embedded hjerner som mulig, samtidig som at høvelen er på samme høyde (eller like over) hjernen. Fylle kammeret med tilstrekkelig kald dissekere buffer for å dekke bladet.
5. Trykk ↕ knappen en gang (du bør se det blinke, denne knappen definerer grensene når bladet vil gå frem og tilbake), og trykk og hold "Forward" manuelt klippe den innebygde hjernen, utgivelse til høvelen klarner agarose blokken. Trykk umiddelbart ↕ knappen igjen, dette vil definere enden av området for automatisk skjæring.
6. Trykk på "SINGLE / CONT" knappen én gang og light av CONT bør gå videre. Still skjæretykkelsen til 400-450 um, vibrasjonsfrekvensen til 5,5 til 6, og hastigheten til 4. Dette vil være trimming innstillingen.
7. Trykk på "Start / stopp" -knappen en gang, og automatisk kutte skulle begynne. Trykk "pause" for å samle vev ved hjelp av skjeen med hull, etter behov. Det tar ca 5-10 min, for å nå nærmere midtlinjen. På dette punktet, trykk på "pause" og endre hastigheten til 3 og endre tykkelsen til 200 mikrometer. Ikke samle den første skive produsert etter at denne endringen.
8. De ønskede stykker av 200 mikrometer tykkelse vil ha luktelappen gjennom cerebellum pent definert. Overfør hver ønsket stykke etter hvert som de blir kuttet i seks-brønns plater fylt med disseksjon buffer på is. Gjør dette ved å flytte buffer i slicing kammeret rundt vev til å flyte stykket, berøre det så lite som mulig, løft den ut av bufferen når det er holdent over hullsleiv. Vanligvis rundt en2 stykker med de ønskede strukturer kan samles. Skivene kan stå i dissekere buffer på is i opp til 20 min.
9. Mens skivene er på is, tar ut 6-brønns plate med innsatser er belagt med laminin fra 37 ° C inkubator. I disseksjon panseret forkaste laminin ta vare for ikke å skade inserts. Legg 3,5 ml skive kultur media til toppen av hver innsats. Toppen av media vil danne en kuppel-form uten å søle ut i brønnene.

9. plating den Slices på innleggene

1. Bruke hullsleiv verktøyet, plasserer en hjerne skive i media på innsatsen, forsiktig skyve skive å være fullt nedsenket. Gjenta for alle skiver.
2. Bruk en P1000 for å trekke ut 1 ml kulturmedium stykke fra toppen av innsatsen og dispensere den inn i bunnen av brønnen. Fjern og kast overflødig media inntil kantene av agarose rundt hjernen slicebecome synlig. Gjør dette for de resterende skiver.
3. Plukk opp tHan setter av felgen med pinsett, tilt og fjerne overflødig medier. Deretter raskt overføre innsatsen til 35 mm ² fatet inneholder 1 ml skive kultur media. Bruk 2 par skarpe tang for å fjerne agarose rundt vev, tar seg ikke å strekke / skade skive eller dytte et hull i membranen (enkleste hvis du gjør en tåre i ytterkanten av agarose, deretter trekke fra hverandre agarosen fra begge sider). Deretter flytter innsatsen tilbake til 6-brønns plate og gjenta for de resterende skiver.
4. I en vev kultur hette med viften av (for å hindre skiver fra uttørking) fjerne agaroseplater fragmenter fra hver membran.
5. Overfør skivene til 6-brønns plate fremstilt i trinn 5.1 og lagre platen ved 37 ° C. Inkuber skiver i 24-48 timer.

10. Endre Slice Culture Media

1. Gjenta trinn 5.1 med en frisk 6-brønns plate.
2. I en vev kultur hette med viften av, overføre innleggene til nye seks-brønns plater continnelukker fersk skive media.

11. plating tumorceller på Slice

1. Sonikere Cm-Dil fargestoff og spinn på middels hastighet i 2 min.
2. Spin ned tumorceller som brukes for overlegget ved 201 xg i 5 minutter. Deretter resuspender i 2 ml skive kulturmedier.
3. Legg 7 mL av Cm-Dil inn i 2 ml celler og medier, og inkuber ved 37 ° C i 20 min.
4. Spinn ned cellene ved 201 xg i 5 min og resuspender i 200 ul slicing media. Triturate forsiktig å distansere cellene (10-20 ganger eller til pellets er borte) og deretter legge til 800 mL slicing media for å gjøre 1000 fil totalvolum.
5. Count levedyktige kreftceller benytter Trypan blå. Tilsett grønne fluorescerende mikrosfærer til tumorceller, i samme konsentrasjon som celler. Disse inerte mikrokuler vil tjene som en kontroll. Spinne ned celle / mikrosfære-blandingen ved 201 xg i 5 minutter og resuspendert i ønsket mengde skive kulturmedier. Plate-celler ved en tetthet på 6000 celler / slis i 65 mL volum. Antall celler per belagt skive kan økes, avhengig av preferanse og tilgjengelighet.
6. I vevskultur hetten dispense-celler i 65 mL av mediet / skive på midten av skiven.

12. Imaging og festing

Merk: en Nikon Eclipse Ni C2si oppreist konfokal ble brukt til å ta et stort bilde skanning av hele sagittal skive på 4X med røde og grønne fluorescerende kanaler. Hvis skanning funksjonen ikke er tilgjengelig, ta flere bilder etter hverandre på tvers av stykket, og senere sy bildene sammen i Photoshop (med plasseringen av mikrosfærer og kanten av stykket å navigere).

1. Den neste dag (dag 1 avbildning), overføre skivene i seks 35 mm ² retter med en skive ml kulturmedium. Bilde hver skive en om gangen på den fluorescerende mikroskop oppreist. Ta et stort bilde skanning av hele sagittal skive på 4X med røde og grønne fluorescerende kanaler. Hold laserog gevinst innstillinger den samme for hver skive. Ved slutten av imaging, overføre alle skivene tilbake til en 6-brønns plate som inneholder frisk skive media.
2. Dersom tilsetting av EDU, annet spredning markør eller stoff tilstanden er ønskelig opprette et lager av skive media med stoffet som skal brukes for medie endringer daglig for behandling tilstand. Behandlingen tilstand bør innføres på trinn 12.1 (direkte etter dag 1 bildebehandling). Enhver EDU eller spredning markør bør legges til media også begynnelsen på 12,1 og oppdateres daglig (bruk EDU ved 10 mm).
3. Bildet igjen på dag 7 med de samme innstillingene som den Day 1 bilder.
4. Etter Dag 7 bildebehandling er fullført, flytte hver skive i en seks-brønns plate med hver brønn som inneholder 1,2 ml av 4% Paraformaldehyde (PFA). Forsiktig og langsomt slippe ytterligere 1 ml av PFA på toppen av hver skive. La ved RT i 1 time.
5. Fjern PFA fra hver brønn, og fra toppen av hver skive. Vask hver brønn 3x med PBS. Oppbevar skiver i PBS ved4 ° C for flekker eller montering på lysbilder.
   Merk: ImageJ innstillinger kan være nødvendig å justere og optimalisert for å redegjøre for bilde og mikroskop kvalitet samt tumor cellestørrelse.

13. Kvantifisering av bilder (Bruke ImageJ)

Merk: ImageJ innstillinger kan være nødvendig å justere og optimalisert for å redegjøre for bilde og mikroskop kvalitet samt tumor cellestørrelse.

1. I ImageJ, bruker polygonverktøyet til å skissere hele sektoren eller den regionen du ønsker å kvantifisere. Legg dette valget til ROI lederen hvor du kan endre navn på det og lagre det.
2. Høyreklikk på det valgte området og velge duplisere. Navn denne kopi med region, slice, dag. Trykk Ctrl + Shift + E for å vise omrisset, velg deretter Process - subtrahere bakgrunn - Rullende ball Radius = 4.
3. Etter bakgrunn subtraksjon, velger du "justere terskelen" i "Image" rullegardinmenyen. Sjekk mørk bakgrunn -; se på bilde zoomet inn og sette terskelen. Som du setter terskelen ved å flytte terskelen bar, sikre at alle cellene er inkludert / uthevet men ekstremt små prikker som er rusk (eller mindre enn en celle) er ikke inkludert. Bruk samme terskel for alle bildene. Flytt terskelen vinduet til side.
4. Velg "Process" - "Finn Maxima" og sette støy toleranse mellom 5 og 10 og kontroller følgende: Forhåndsvisning punktvalg, utgang type som segmentert partikler, utelukker kanten maxima, fremfor lavere terskel. Deretter reselect regionen av interesse ved å trykke Ctrl + Shift + E.
5. Velg "Analyser Partikler" fra Analyze nedtrekksmenyen. Sett pikselstørrelse til 4-40 og sirkulariteten til 0,00 til 1,00. Klikk også "Vis overlapping skisserer" "vise resultater" og "oppsummere", og trykk deretter på OK.
6. Registrere alle rådata og sammendraget i et Microsoft Office-dokument. «Greven» for hver region is for å beregne ganger endring i løpet av uken i kultur.
7. Gjenta denne prosessen for alle bildene og interesseområder, og pass på at terskelen og andre innstillinger være konsekvent.
8. Beregn ganger endring i celleantall på skiven i løpet av uken i kultur ved å dividere antall av tumorceller på den skive på dag 7 med antall celler på skive på dag 1. På lignende måte, brett forandring i celleantall innenfor hver region beregnes ved å dele antall celler i den regionen på dag 7 med antall celler i den regionen på dag en.
9. Utfør trinn 13.8 til mikrosfærer i tillegg. Mikrosfære nummeret på skive bør være den samme på dag 7 som på dag 1 (endring = 1). Likeledes bør microsphere nummer innenfor hver region være det samme på dag 7 som på dag 1 (endring = 1). Hvis Fold endring avviker fra 1, indikerer dette endringer i stykket topografi over tid.

14. Farging

1. Tape et stykke Parafilm på the laboratoriebenken og trekke seks sirkler med en væske blokker pap penn (en for hver skive, akkurat større enn størrelsen på en skive). Plasser ca 400 mL PBS i en prikk i midten av hver sirkel. Nummer eller merke sirklene for å identifisere hver skive.
2. I 1 ml PBS, bruke et barberblad for å kutte en firkant rundt skive, forlate noen plass av membran rundt stykket. Ved hjelp av pinsett bevege skåret ut skive i den første sirkelen, og forsiktig la den skive på toppen av boble av PBS. Det er viktig å sørge for at stykket ikke kaste over på seg selv eller bli snudd opp ned i løpet av denne prosessen. Deretter fjerner PBS fra undersiden av skive og sette den på toppen av stykket, og legge mer PBS hvis det er nødvendig for å sikre at det forblir under vann. Gjenta dette trinnet for hver skive.
3. Gjør 10 ml av 3% BSA i PBS. Ta ut 2 ml, og tilsett 100 mL av digitonin til det. Bland og legge til skiver å blokkere og permeabilize, 30 min ved RT.
   Merk: Bruk av andre permeabilization agenter som Triton X-100 vil resultere i tap av CM-Dil merking.
4. Fjern permeabilization / blokkeringsløsning og skylles 3 ganger med PBS i 10 min.
5. Hvis flekker for EDU, følg instruksjonene gitt av kit for å montere blandingen. Anvende blandingen i 45 min. Hvis farging med andre antistoffer, må protokollen være optimalisert for konsentrasjonen av primære og sekundære antistoffer (~ 1 time RT for primær og sekundær). Vask 3 ganger med PBS i 10 min.
6. Flekken med DAPI 1: 1000 i PBS i 5 min RT. Vask 2 ganger med PBS.

15. Montering av Slices

1. Overfør stykket til et objektglass. Sørge for at den side av membranen med den skive forblir vendt opp, og ikke kaste over på seg selv. Tegn en ramme rundt stykket med en flytende blocker pap penn.
2. Plasser en liten glass dekkglass (5 mm) på hver side av skiven (for å holde skiven fra å bli skadet). Slippe to eller tre dråper Fluoromount-G (for immunfluorescens) på toppen avskive til bare knapt dekke det. Deretter dekker skive lang dekkglass (24 x 50 mm).
3. Gjenta for hver skive. Forsegle kantene av lysbilder med neglelakk og oppbevares ved 4 ° C. Gjør confocal avbildning av farging.

Representative Results

Denne delen eksemplifiserer den type resultater som kan forventes fra å utnytte hjernesvulst / organotypiske skive co-kultur for å undersøke regionale mikro preferanse samt å teste nye behandlingsformer. Vi viser at analysen er utformet for å gjenskape den mikromiljøet for hjernesvulster, som vevet organisering og proliferativ tilstand av skiven er opprettholdt (figur 3). Vi viser også at en økning i antall av tumorceller på skive over tid, kan delvis være forårsaket av migreringen av celler på hjerne mikromiljøet skive (figur 4). Vi har også vist at dette ko-kulturen kan brukes som en kvantitativ analyse ved å beregne den synlige forandring i celletallet i løpet av uken i kultur i spesifikke områder av skiven, eller for hele hjernen skive (figur 6) Foreløpige resultater fra multiple tumorcelletyper har vist at antallet tumorceller kan kvantifiseres ved konfokal avbildning av200 um tykk skive på grunn av det faktum at cellene bare migrere til en dybde på 20 til 50 mikrometer i stykket.

Vi har funnet at grønne fluorescerende mikrosfærer er en effektiv kontroll for endringer i skive topografi, fordi de viser ingen bevegelse eller endring i antall hele tiden i kultur (figur 5). Etter fiksering av ko-kultur, kan farging gjøres for å undersøke tumorceller i et hjerne mikromiljøet og effekten av medikamenter på tumor celleproliferasjon, celledød, eller forandringer i protein ekspresjon (figur 7). Vi har vist at denne analysen kan brukes til å teste medikamentterapier gjennom en sammenligning av mus medulloblastom celler behandlet med en Smo (glattet) antagonist LDE225 (Sonidegib) eller med en bærerkontroll. Fold økning i celleantall på skive over en uke i kultur ble kvantifisert og representert grafisk (celleantall på Dag 7 / celle nummer på dag 1) Disse data indikerer at de i stor grad LDE225bretter tumorcelleantall i forhold til kontroll ^6. Denne effekten kan også bli sett i de representative bilder inkludert (figur 8). Vi viser også bilder av humane medulloblastom celler dyrket i kultur slice assay (figur 9).

Figur 3. hjernesvulst / organotypiske Slice Co-kultur Assay Design. (A) organotypiske sagittale hjerne skive fra en P6 mus blir plassert direkte på et semi-porøs membran og medium ble tilsatt til bunnen av kulturskålen. Kulturen er nedsenket i mediet på en side og er tilgjengelig for oksygen fra den andre siden. Merkede tumorceller er kledde på skive og celle nummer kan følges over tid. (B) i kultur, stykket opprettholder en vev organisasjon som ligner den som ble observert in vivo. Preservation av hjernen mikromiljøet demonstreres ved edu merking av proliferative granule neuron forløpere i det ytre granulatsjiktet (EGL) av lillehjernen i skive kultur. I skive kultur, disse forløpercellene innlemme tymidinanalog Edu, som ville bli observert in vivo på dette utviklingsstadiet (P6) (hvit pil indikerer EGL). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Menneskelig astrocytom Celler i hjernesvulst / organotypiske Slice Co-kultur analysen. En økning i menneskelige hjerne tumorceller på skive kan gjenspeile relocalization av kreftceller fra membranen til skive kultur. (A) Et område i utkanten av et stykke på dag 1 (øverst) og Dag 7 (nederst) der cellene kan m igrate fra membranen på hjernen skive. (B) Et annet eksempel på en mulig cellemigrering inn i hjernen ved kanten av skiven. Dag 1 (øverst) og Dag 7 (nederst). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Mikrokontrollperler. Day 1 (rød) og Dag 7 (grønn) kontrollbilder av fluorescerende sfærer er kledde (gul) for å avsløre ingen bevegelse av mikrokulene over en uke i kultur. Dag 1 og Dag 7 bilder ble tatt på samme posisjon innenfor skive (Scale bar = 45 nm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

lways ">
Figur 6. Kvantifisering i ImageJ. (A) Bildet av en skive åpnes i ImageJ og hele sektoren og / eller regioner er skissert for kvantifisering. (B) Regionen av interesse er valgt, og en kopi er gjort. (C ) Den bakgrunnsfluorescens trekkes ut av bildet. (D) Terskelen er innstilt for cellestørrelse og form, å bestemme hva som skal telles. (E) Analyser partikler for å telle celletallet innenfor regionen av interesse. Ganger endring i celle nummer kan da beregnes ved å dele antall celler på dag 7 med antall celler på dag 1 for hver region av interesse eller hele området av stykket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .

Figur 7. Farging for spredning. Bilde eksemplifiserer hvordan farging (etter å fikse stykket i PFA) kan med hell gjøres på skive etter en uke i kultur. Bildet viser DAPInuclear farging (blå), røde fluorescerende merkede mus medulloblastom celler, og grønne merking for innlemmelse av thymidin i DNA analog som en markør for proliferasjon. EDU ble inkludert i skive kultur media (10 mm) for en uke (hvite piler indikerer celler positive for EDU og gule piler indikerer celler negative for EDU) (Scale bar = 50 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av denne figur.

Figur 8. Muse Medulloblas Toma celler behandlet med LDE225. Denne figuren viser behandling av tumorceller i stykkeoverlagsanalysen system. (A) grafisk fremstilling av data samlet inn fra en mus medulloblastom eksperiment. DMSO ble kontrolltilstand (CTL) og LDE225 (Sonidegib) (1 uM) (LDE) var behandling tilstand. Fold økning i celletallet på skive over en uke i kulturen ble kvantifisert (celle nummer på Dag 7 / celle nummer på dag 1), (n = 12 CTL, n = 13 LDE, Feilfelt = SEM). (B) Representant bilder av kjøretøy kontroll behandlet skiver på dag 1 (øverst) og Dag 7 (nederst). (C) Representative bilder av LDE behandlet skiver på dag 1 (øverst) og Dag 7 (nederst). Bilder ble tatt på 4X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

9 "src =" / filer / ftp_upload / 53304 / 53304fig9.jpg "/>
Figur 9. Menneskelig medulloblastoma Celler i hjernesvulst / organotypiske Slice Co-kultur. Medulloblastom humane celler ble oppnådd fra James M. Olson ved University of Washington, og ble dyrket i en uke i kultur skive analysen. (A) Dag 1 bilde av menneskelige medulloblastoma celler dyrket på mus hjernen skive. (B) et bilde av den samme mus hjernen skive med menneske medulloblastoma celler etter en uke i kultur (Dag 7). Bilder ble tatt på 4X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne protokollen beskriver hvordan hjernetumorceller kan fluorescensmerkede og sådd ut på en sagittal hjernesnitt av en P6 mus og deretter overvåket i en uke i kultur. Dette hjernesvulst / organotypiske skive samkultur analysen kan anvendes for å bestemme effekten av regionale mikromiljøet på tumorcellenummer, og kan også brukes som et system for å måle effekten av nye medikamentbehandlinger på humane tumorvekst. Tidligere studier har brukt en lignende strategi for å vurdere rollen som hjernen mikro-miljø på nevrale forløper spredning ^7,8.

Denne analyse hvor hjernesvulstceller sås i en organotypiske skive kultur ⁹ tilveiebringer et system for dyrking av humane hjernetumorceller som er vanskelige å forplante seg i normal cellekulturbetingelser. En kritisk del av denne prosedyren er viktigheten av å opprettholde helsen til stykket, og kreftceller. Lengden av tid at skivene sitter i buffer i løpet av dissection og ved RT under bildebehandling bør begrenses, for å sikre at skivene og celler forblir så sunt som mulig. Hvis primære humane hjernetumorceller blir brukt i denne analyse, bør cellene sådd ut på skivene så snart som mulig etter biopsi. Derfor skivene bør være forberedt før operasjonen. For å forhindre forskjells effekten av bildebehandling tid blant skiver, hvor mye tid brukt ut av inkubatoren skal være kort og konsekvent for alle skive kulturer i et eksperiment. De mikrokontroller er viktige fordi de gir romlig konsistent tegn over tid. I tillegg skjevheter i skive kultur på grunn av svinn, rive, eller folding er lett synlig med CCD de mikroperler.

En av begrensningene i denne protokollen er at cellene bare kan formeres i denne skive kultur systemet i ca en uke. Likevel, for enkelte typer av hjernesvulster dette er en betydelig forbedring i forhold til den nåværende tilstand of anliggender. En annen begrensning er at blod-hjerne-barrieren er eliminert, noe som er en viktig faktor i å evaluere medikamenter som kan anvendes for behandling av hjernesvulster. En tredje faktor er at dette er en lav gjennomstrømning analyse som ikke kan brukes for å teste et bibliotek av forbindelser.

Denne analysen er allsidig og kan enkelt modifiseres til å studere forskjellige typer av tumorceller og en rekke av undersøkende spørsmål. Denne protokollen kan brukes som en kvantitativ analyse for å undersøke effekten av nye behandlingsformer på tumorcellevekst og overlevelse (Sun et al., Personlig kommunikasjon). En sammenligning av den synlige forandring i tumorcelleantall i forskjellige regioner av hjernen tilveiebringer en fremgangsmåte for å tyde effekten av mikro på tumorvekst.

Dette hjernesvulst / organotypiske skive ko-kultursystem gir også muligheten for å undersøke forholdet mellom hjernetumorceller og spesifikke hjerne microenvironments. MaNY typer hjernesvulster viser et tydelig mønster av utvikling i bestemte områder av hjernen og microenvironments ^3,4. Ved å dyrke merkede humane tumorceller på en sagittal musehjerne skive, kan cellene bli overvåket for regionale preferanser som kan være i overensstemmelse med in vivo-regionen i vekst. Ytterligere undersøkelse av mikromiljøet som tumorcellene fore kan føre til identifikasjon av potensielle faktorer som understøtter tumorcellevekst. Denne analysen kan hjelpe til å forbedre in vitro cellekulturbetingelser, og kan også gi et system for å studere hvordan startfasen kan forebygges eller behandles mer effektivt.

Det er spesifikke typer av hjernesvulster som ikke kan føres videre i normal cellekulturbetingelser eller ved muse ortotopisk eller subkutane xenografter. For disse krefttypene er det vanskelig å teste nye medisinsk behandling på humane tumorceller. Denne protokollen viser at humane hjernetumorceller kan dyrkes i stykketkultur analysen og medikamentell behandling kan vurderes kvantitativt. Etter behandling, co-farging av kreftceller kan gi ytterligere evaluering av stoffets effekt på tumorcelleproliferasjon og sti hemming. Nyere studier har vist at det kan være en drastisk forskjell mellom en medikamenter virkning på kreftceller i et monolag normal cellekultur kontra en 3D heterogen cellekulturmiljøet ^10. Tilsvar voksen normale og tumor epitelceller, som har en kort levetid in vitro, har vist seg å omprogrammere betinget til en proliferativ tilstand når dyrket på fibroblast feeder-celler i kombinasjon med en Rho-kinaseinhibitor ^11. Disse studiene støtter videre viktigheten av å opprettholde tumorceller i en organotypiske, 3D, klinisk relevant mikromiljøet, og relevansen av denne cellekultur system til dagens kreftforskning. Derfor er dette et verdifullt assay for testing av medikamenter på humane tumorceller i en klinisk relevant måte.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Invitrogen	17504044
Glucose	Invitrogen	17502048
Pennicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
HBSS	Life Technologies	14185-052
B-27	Life Technologies	17504-044
N2	Life Technologies	17502-048
Glutamax	Life Technologies	35050061
Neurobasal-A- Medium minus phenol red	Invitrogen	12349015
Low Melting Point Agarose	Promega	V2111
Slice Culture Inserts	Milipore	PICM0RG50
laminin	Invitrogen	23017015
Cm-DiI	Invitrogen	V22888
EDU (Labeling and Detection)	Life Technologies	c10337
Microspheres	Life Technologies	F-21010
Vibratome	Leica
Confocal Microscope	Nikon Eclipse Ni C2si
ImageJ software
5 mm Cover Glasses	Fisher Scientific	64-0700 (CS-5R)