Introduction
Yeni kanser araştırma beyin tümörlerinin çeşitli genetik mutasyonlar, moleküler değişiklikler ve olası tedavileri belirlenmesinde önemli ilerlemeler kaydetmiştir. Bu gelişmelere rağmen, beyin tümörleri, yetişkinler ve çocuklar için kanserle ilgili mortalite üst nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir. Beyin tümörü araştırma üzerinde sınırlandırıcı etkenler primer hasta örnekleri ve hücre çizgileri kısıtlı kullanılabilirliği ve erişilebilir deneysel sistemlerde benzersiz ve heterojen beyin mikro-çoğaltma zorluk bulunmaktadır. Birçok beyin için zamanla henüz bilinmemektedir tümör hücrelerini korumak için gerekli koşulları tümörler. Hatta neurospheres hücre süspansiyon içinde yetiştirilebilir beyin tümörleri için, kültür koşulları tümör hücrelerini 1,2 etkileyebilir. Gerçekten de, bazik fibroblast büyüme faktörü veya epidermal büyüme faktörü eklenmesi çoğalmasını teşvik etmek ve gen ekspresyonunu 1 değiştirebilir farklılaşmasını inhibe etmek. Tümör hücresi büyümesi için diğer yöntemler gibiTümör hücrelerinin ortotopik ya da deri altı doku yaması yoluyla farelerde, tümör yayılımı gibi değerli tahliller vardır, ancak bu enjekte edilmiş ve incelenebilir tümör gelişimi (özellikle düşük dereceli tümörler için), maliyeti ve tümör hücrelerinin sayısında bir zamanı gibi faktörlere ile sınırlıdır . İnsan beyni tümör hücrelerinin büyümesi için Böylece güncel yöntemler bazı tümör türleri korumak için yetersiz ve çoğunlukla yakından taklit in vivo tümör ortamları yok yapay ortamlar sağlamaktadır.
Pediatrik beyin tümörlerinin Farklı türleri beynin içinde son derece uzmanlaşmış yerlerde yetişen [3, 4] ve bu tümör büyümesi için ayrı ayrı microenvironmental gereksinimlerini yansıtmak muhtemeldir [5]. Bu protokol, normal kültür koşullarında yaymak için zor olan hücreler Organotipik beyin mikro-yetiştirilebilir yeni bir sistemi tarif vivo tümör büyüme koşullarında taklit eden. Bu niceliksel deneyde, floresanla işaretlenmişbeyin tümörü hücreleri, bir jüvenil fare beyin Organotipik dilimleri üzerine kaplanmıştır ve zaman içinde kontrol edilir. Bu tahlil, tümör büyümesi üzerine mikroçevresinin etkisini araştırmak için, ve klinik olarak anlamlı beyin mikroçevresinin yeni ilaç tedavileri test etmek için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı: Hayvan denekleri aşağıdaki prosedür Sağlık kurallar National Institutes uygun olarak yapılır ve Dana-Farber Kanser Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Bütün insan denekler çalışma Kurumsal Değerlendirme Kurulu gerektiğinde Tüm olguların elde olan aydınlatılmış onam Brigham ve Kadın Hastanesi ve Dana-Farber Kanser Enstitüsü, ve uygun kullanımı için Stanford Üniversitesi tarafından Komiteler, ve rıza gereksinimleri uygun feragat tarafından gözden geçirilmiştir minimal risk çalışmaları için elde edilmiştir.
Dilim Kültür Protokolü Timeline:
Beyin Tümörü / Organotipik Dilim Co-kültür Protokol'ün 1. Timeline Şekil. Bu rakam, tüm sekiz gün o kapsayan dilim kültür prosedürü zaman çizelgesi gösteriyorDeney ve prosedürün önemli adımlar f. Hücreler kaplama önce prosedür gün başlayan önemini vurgulamak amacıyla bir dilimin üzerine kaplama zaman çizelgesi Gün 0 göredir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
1. Diseksiyon Tampon
- 15 mM HEPES (1 M), 6.5mg / ml glükoz, 1.3 mM MgSO4 (1 M), 20 mM KCI (2M) ve% 1 penisilin / streptomisin içinde 1 x HBSS hazırlayın.
- NaOH ile 7.4'e pH ayarlayın.
- -20 ° C'de filtre saklayın.
2. Dilim Kültür Medya
- Neurobasal-A Orta eksi fenol kırmızı B-27,% 1 N2 takviyesi,% 1 penisilin / streptomisin,% 1 Glutamax ve 1,5 mg / ml Glukoz,% 2 hazırlayın.
- -20 ° C'de filtre saklayın. Gerektiğinde çözülme ve 4 ° C'de 1 hafta sonra atılır.
Not: Aşağıdaki prosedür üzerinde kadar yapılabilirdiseksiyon başlamadan önce e bir gün. - % 3 düşük ergime noktalı agaroz
Not: Aşağıdaki yordam diseksiyonu başlamadan önce bir gün kadar yapılabilir. - Gevşek kapaklı 25 saniye boyunca diseksiyon tamponu, mikrodalga ~ 31 ml agaroz 0.9 g düşük erime noktasına karıştırın. Eritilmiş ve yapana kadar mikrodalga emin karışım taşma yok.
- Kadar gerekli 55-65 ° C'de tutun.
Not: Aşağıdaki yordam diseksiyonu başlamadan önce bir gün kadar yapılabilir.
4. Kat Laminin Dilim Kültür Uçlar
Not: Aşağıdaki yordam diseksiyonu başlamadan önce bir gün kadar yapılabilir.
- Bir doku kültürü kaputu steril forseps kullanarak, bir 6 plaka her kuyuda bir dilim kültür insert yerleştirin (eğer elde etmek niyetinde dilim sayısını maç yaklaşık 12 bir prosedür alınabilir. Aşağıdaki yordam için yazılmıştır Altı dilim). 15 ml konik t doldurun 1x PBS ile Ube (800 ul / insert) ve laminin (10 ug / ml) ekleyin.
- Her dilim kültür ucun üstüne laminin karışımı 800 ul ekleyin. Gerekli olana kadar 37 ° C'de inkübe edilir.
Diseksiyon 5. Hazırlık
- Dilim kültür ortamı 1200 ul, 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna doldurun. 1200 ul PBS ile Kullanılmayan kuyu doldurun ve PBS 1x 5 ml plakanın merkezi alanı doldurur. 37 ° C 'de, bu plaka saklayın.
- % 70 etanol içinde diseksiyon araçları sterilize edin. Yağ çıkarmak ve kullanmadan önce sterilize etmek aseton ile vibratome bıçağı silin.
- Üç adet 35 mm 2 yemekleri ve kaputu beş 10 cm 2 doku kültürü yemekleri yerleştirin. Buz üzerinde diseksiyon tamponu ve yeri ile bir adet 10 cm 2 çanak doldurun.
Not: Süreç seferinde bir yavrular.
6. Diseksiyon
Not: Süreç seferinde bir yavrular.
es / ftp_upload / 53304 / 53304fig2.jpg "/>
Şekil 2. Diseksiyon keser. Bu görüntüler bir P6 fare beyninden kafatasını kaldırmak için gerekli diseksiyon keser gösterir. Keser noktalı çizgiler olarak gösterilmiştir. (A) 1 gösterilmektedir kesin. Cuts 1 ve 2 çift taraflı her iki tarafta göz yuvasına bağlayan beyin / arka .. (B) 3 ve 4 gösterilmektedir Cuts yapılır. 3 1 ve 2. Cut 4 kesme 3 orta hat başlar ve koku ampuller arasındaki kafatası (Ölçek çubuğu = 4.4 mm) bölünmesi burun. Ucuna doğru devam diğer bağlantı Cuts bir göz çukurlarının yapılır kesilmiş Lütfen Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
- Izofluran pozlama (% 100 izofluran) kullanılarak P6 fare anestezisi. Yaklaşık 5 dakika sonra yavaşlar, nefes alma ve solunum belirtisi yok olduğunda, hızlı bir şekilde başını kesmekkeskin bir makas ile fare. Bir doku kültürü çanağı içinde 70% etanol ve yer ile baş püskürtün.
- Kullanılarak büyük künt forseps burun kapma sürekli kafa tutun. Orta ölçekli diseksiyon makas kullanarak, kafatası ortaya çıkarmak için fazla deri kaldırın.
- Göz soketine kesim bağlayan her iki tarafta öne doğru kafatası posterior, bilateral kafatası keserek kesikler 1 ve 2 yapın. Doku hasarı önlemek için mümkün olduğunca kafatasına yakın makas ucu tutun.
- Kesim 3 için, kesikler 1 bağlamak için küçük yaylı makas kullanın ve 2. Sonra yavaşça kafatası kalkmasına küçük künt forseps kullanabilir.
- Küçük yaylı makas kullanarak, yavaşça geriye kalan kafatası 2 yarıları olur, öyle ki üst orta hat boyunca kalan kafatası kesti (Şekil 2 # kesti 4). Forseps iki koku ampuller ortaya çıkarmak için kafatasını soyulabilir.
- Düz yüzlü spatula yerleştirin (diseksiyon tamponu ile nemlendirilmiş, yani doku ona sopa olmaz) b arasındabeyin ve kafatası tabanında ottom, yavaşça beyin kaldırmak ve buz üzerinde diseksiyon tampon içeren çanak içine yerleştirin.
- Dilimleme için ikinci bir beyin elde etmek için 6. adımı tekrarlayın
7. Agaroz içinde Brains katıştırma
- Buz üzerinde açık 35 mm 2 yemekleri iki koyun ve% 70 etanol ile büyük künt forseps bir çift silin.
- Üst kubbe oluşana kadar iki tabaklara (adım 3'te hazırlanan) 3% düşük erime noktalı agaroz dökün. 3 dakika boyunca zamanlayıcıyı ayarlayın. 3 dakika bir agaroz dolu 35 mm çanak yan içine künt forseps ve yer ile tek beyin pick up (agaroz polimerizasyon görülebilir eğer, agaroz dolu kubbe jant dokunarak testi, hazır), daha sonra hareket çanak merkezine (o daha iyi bağlar, böylece bu beynin çevresinde aşırı diseksiyon tampon kaldırır).
- 2. beyin için tekrarlayın. 10 dakika için bir zamanlayıcı başlatın.
- 10 dakika sonra, arasındaki boşluğa düz spatula yerleştirinAgaroz ve çanak P6 beyinleri içeren polimerize agarozun dışarı pop.
- Kenarları mümkün olduğunca düz olduğundan emin olun, beynin etrafında bir küp içine agaroz kesmek için düz bir jilet kullanın.
- Iki şeritte vibratome plaka üzerinde yapıştırıcı yerleştirin. Ardından, agaroz monte beyni pick up ve hafifçe sagital dilimleri için konumlandırılmış yapıştırıcı, üzerine açılan. Diğer beynin için de yapın. Her iki beyinleri birbirlerine dizilmiş emin olun.
- 5-8 dakika boyunca, oda sıcaklığında yapışkan kurumaya bırakın. Bu süre boyunca, ezilmiş buz ve su ile vibratome buz tutucusu alanı doldurmak.
8. Vibratome ile dilimleme
- Yerine oturtmak için sağa sekmeyi hareketli, buz tutucu alana kesme rezervuar yerleştirin.
- Dairesel kafa tornavida kullanarak, üzerinde yapıştırılmış beyinleri ile dairesel Vibratome plaka almak ve rezervuar içine sığacak. Vida sürücüsünü kaldırın ve inci ile yerde plaka sabitlemeke altıgen baş tornavida. Plaka ve kesim rezervuar yerinde oturduğundan emin olun.
- Forseps, pikap vibratome bıçak, altıgen tornavida ile yerde kesme kafası, kilide uyar. Ardından, yuvarlak vida kullanılarak vibratome üzerine takılı bıçak kesme kafasını sabitleyin.
- Emin yaparken jilet (sadece veya üzeri) aynı yükseklikte, beyinleri mümkün olduğunca agaroz gömülü beyinleri olarak yakın jilet konumunu getirin. Bıçağı karşılamak için yeterli soğuk diseksiyon tamponu ile odasına doldurun.
- Basın ↕ düğmesine bir kez (Eğer bıçak ileri geri gidecek bu düğmeye sınırlarını tanımlar, bu yanıp görmelisiniz), ardından ve jilet agaroz blok temizler kadar elle gömülü beyin, serbest kesmek için "İleri" tuşunu basılı tutun. Hemen bu otomatik kesim için aralığın sonunu belirleyecek, yine ↕ düğmesine basın.
- Bir kez "TEK / CONT" düğmesine basın ve lCONT tarafından ight gitmeli. Kırpma ayarı olacaktır 4. Bu, 5.5-6'ya sıklığını ve hız titreşimli, 400-450 um kesme kalınlığını ayarlayın.
- Bir zamanlar "başlatma / durdurma" düğmesine basın ve otomatik kesim başlamalıdır. Basın "pause" gerektiği gibi, delikli kaşık kullanarak doku toplamak için. Bu orta hatta yakın ulaşmak için, yaklaşık 5-10 dakika sürer. Bu noktada, basın "pause" ve 3 hızını değiştirmek ve 200 mikron kalınlık değiştirin. Bu değişikliği yaptıktan sonra üretilen ilk dilim toplamak yok.
- 200 mikron kalınlığında istenilen dilim beyincik ile koku alma ampul güzel tanımlanmış olacaktır. Bunlar buz üzerinde diseksiyon tampon ile doldurulmuş 6 oyuklu plakalar halinde kesilip gibi arzu edilen her bir dilim aktarın. , Mümkün olduğunca küçük dokunmadan, dilim yüzer o oluklu kaşık üzerinde kare iken tampon dışarı çıkarın doku etrafında dilimleme odasında tampon hareket ettirerek bunu yapın. Tipik olarak yaklaşık 1İstenilen yapılarla 2 dilim toplanabilir. Dilimleri kadar 20 dakika boyunca buz üzerinde tampon kesme bırakılabilir.
- Dilimler buz üzerinde iken, ekler 37 ° C inkübatör laminin ile kaplanmış olan 6-plaka çıkar. Diseksiyon kaput ekler zarar vermemeye özen göstererek laminin atın. Her ucun üstüne dilim kültür ortamı 3,5 ml ekleyin. Ortamın üst kuyu içine dökülüp olmadan kubbe şekli oluşturacak.
9. Kaplama Uçlar üzerine Dilimler
- Oluklu kaşık aracını kullanarak, yavaşça dilim tam sokulmasına iterek, insert medya içine beyin dilim yerleştirin. Tüm dilimleri için tekrarlayın.
- Insertin üst kesit kültür ortamı 1 ml çizmek ve de alt içine dağıtmak için P1000 kullanın. Çıkarın ve beynin etrafında agaroz kenarları görünür slicebecome kadar fazla medya atın. Kalan dilimleri için bunu yapın.
- T Pick upO forseps, tilt ile jant ile yerleştirin ve aşırı ortamı çıkarın. Daha sonra, hızlı bir şekilde dilim kültür ortamı 1 ml içeren 35 mm 2 çanak içine ekleme aktarın. Streç / zarar dilim veya agaroz çok kenarında gözyaşı yaparsanız, o zaman agaroz dışında çekin kolay (zarında delik açmak için özen, doku etrafında agaroz kaldırmak için keskin forseps 2 çift kullanın iki taraf da). Sonra geri 6-plaka elemanını taşımak ve geri kalan dilimleri için tekrarlayın.
- Körük kapalı bir doku kültürü kaputu (kurumasını dilim önlemek için) her zardan agaroz parçaları kaldırmak.
- Aşama 5.1'de hazırlanan bir 6-yuvalı plakaya dilimleri aktarın ve 37 ° C 'de plaka saklayın. 24-48 saat boyunca inkübe dilimleri.
10. Dilim Kültür Medya değiştirme
- Taze 6 plaka ile adımı yineleyin 5.1.
- Körük kapalı bir doku kültürü kaputu, devam yeni 6-kuyucuğu ekler transferiTaze dilim medya Aining.
Dilim 11. Kaplama Tümör Hücreleri
- 2 dakika boyunca orta hızda Cm-DII boya ve spin sonikasyon.
- Spin tümör hücreleri 5 dk için 201 x g'de bindirme için kullanılır. Daha sonra dilim kültür ortamı 2 ml yeniden süspanse edin.
- Hücreler ve ortam 2 ml Cm-DII 7 ul ilave edin ve 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Dilimleme medya 200 ul 5 dakika ve tekrar süspansiyon için 201 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün. Çiğnemek yavaşça (10-20 defa veya pelet bitene kadar) hücreleri ayırmak ve daha sonra 1000 ul toplam hacmi yapmak için medyayı dilimleme 800 ul ekleyin.
- Tripan mavi kullanarak canlı tümör hücreleri saymak. Hücreleri gibi aynı konsantrasyonda, tümör hücrelerine karşı, yeşil flüoresan mikro küreleri ekleyin. Bu atıl mikroküreler bir kontrol olarak görev yapacak. 5 dakika ve dilim kültür ortamı istenilen miktarda tekrar süspansiyon 201 xg'de hücre / Microsphere karışımı aşağı doğru döndürün. 6000 hücre yoğunluğunda Plaka hücre / sl65 ul hacminde buz. Dilim başına kaplama hücrelerin sayısı tercihi ve durumuna bağlı olarak artırılabilir.
- Doku kültürü kaputu dilim merkezi üzerine medya / dilim 65 ul hücreleri dağıtmak.
12. Görüntüleme ve Sabitleme
Not: Nikon Eclipse Ni C2si konfokal kırmızı ve yeşil floresan kanallı 4X de bütün sagital dilim büyük bir görüntü taraması almak için kullanılan dik. Tarama özelliği mevcut değilse, dilim boyunca birden çok görüntü sırayla alıp daha sonra (mikroküreler yerini ve gezinmek için dilimin kenarına kullanarak) Photoshop birlikte görüntüleri dikiş.
- Ertesi gün (gün 1 görüntüleme), 1 mi dilim kültür ortamı ile altı 35 mm2 tabaklar içine dilimlerini aktarın. Görüntü floresan dik mikroskop bir anda her dilim biri. Kırmızı ve yeşil floresan kanallı 4X de bütün sagital dilim bir büyük görüntü taraması atın. Lazer tutunve kazanç her dilim için aynı ayarları. Görüntüleme sonunda geri dilim taze ortam ihtiva eden bir 6-yuvalı plaka her dilim aktarın.
- EDU diğer proliferasyon markeri veya ilaç durumun eklenmesi isteniyorsa tedavi durum için hergün ortam değişiklikleri için kullanılacak bir ilaç ile bir dilim ortamının bir stoğunu yaratacak. Tedavi durumu (doğrudan Gün 1 görüntüleme sonra) aşama 12.1 olarak getirilmelidir. Herhangi EDU veya çoğalması işaretleyici medya da 12,1 başlayan eklenmiş ve (10 uM'de EDU'yu kullanın) her gün yenilenir edilmelidir.
- Görüntü yine Gün 7 Günü olarak 1 görüntüleri aynı ayarları kullanarak.
- Gün 7 görüntüleme işlemi tamamlandıktan sonra,% 4 paraformaldehit (PFA) ihtiva eden her bir göze 1,2 ml, 6 gözlü bir plakanın her bir dilim taşıyın. Dikkatle yavaş yavaş, her dilimin üstüne PFA ek 1 ml bırakın. 1 st için oda sıcaklığında bırakın.
- Her bir çukurdaki ve her dilim üst PFA çıkarın. PBS ile her bir kuyucuğa 3x yıkayın. PBS dilimleri MağazaLekelenme veya slaytlar üzerine monte edilmek üzere, 4 ° C.
Not: ImageJ ayarları, görüntü ve mikroskop kalitesi yanı sıra, tümör hücresi boyutu için hesap ayarlandı ve optimize edilmesi gerekebilir.
Görüntüler 13. Niceleme (ImageJ Kullanarak)
Not: ImageJ ayarları, görüntü ve mikroskop kalitesi yanı sıra, tümör hücresi boyutu için hesap ayarlandı ve optimize edilmesi gerekebilir.
- ImageJ, tüm dilim veya ölçmek istediğiniz bölgeyi anahat çokgen aracını kullanın. Eğer yeniden adlandırın ve kaydedebilirsiniz ROI yöneticisi bu seçimi ekleyin.
- Sağ seçilen alanın üzerine tıklayın ve yinelenen seçin. Bölge, dilim, gün bu yinelenen görüntü adlandırın. Basın CTL + Shift + E, ardından seçin Süreci anahat göstermek için - çıkarma arkaplan - Rolling topu Radius = 4.
- Arka plan çıkarma sonra, seçin "Görüntü" açılır menüsünden "ayarlayabilirsiniz.Özellik". Karanlık bir arka plan kontrol edin -; yakınlaştırma görüntüye bakmak ve eşiğini ayarlamak. Eğer eşik çubuğunu hareket ettirerek eşiğini ayarlamak üzere, tüm hücre / dahil vurgulanan ama (bir hücre veya daha küçük) enkaz son derece küçük noktalar dahil değildir sağlamak. Tüm görüntüler için aynı eşiği kullanın. Tarafına eşik penceresini taşıyın.
- Parçalı parçacıklar gibi Önizleme nokta seçimi, çıktı türü, alt eşiğin üstünde, kenar maxima hariç: "Maxima Find" 5 ile 10 arasında gürültü toleransı ayarlamak ve aşağıdakileri kontrol edin - "Süreç" seçeneğini seçin. Sonra CTL + Shift + E tuşlarına basarak ilgi bölgeyi yeniden seçin.
- Analiz açılan menüden "Parçacıklar Analiz" seçeneğini seçin. 4-40 piksel boyutu ve 0.00-1.00 kadar daireselliğe ayarlayın. Ayrıca "show bindirme hatlarını" "ekran sonuçlarını tıklayın" ve "ardından OK tuşuna basın" özetler.
- Tüm ham verileri ve Microsoft ofis belgesinde özeti kaydedin. Her bölge i için "Kont"kültürde hafta içinde katlık değişime hesaplamak için gerekli s.
- Eşik ve diğer ayarlar tutarlı kalmasını emin, tüm görüntülerin ve ilgi alanları için bu işlemi tekrarlayın.
- Benzer şekilde, 1. Günden dilim üzerinde hücrelerin sayısına göre Gün 7 dilim tümör hücrelerinin sayısına bölünmesiyle kültür hafta boyunca dilim hücre sayısındaki katlı değişim hesaplama her bir bölge içinde hücre sayısındaki katlı değişim Gün 1 bu bölgede hücrelerin sayısına göre Gün 7 bu bölgede hücrelerin sayısının bölünmesiyle hesaplanmaktadır.
- Yanı sıra mikroküreler için adım 13.8 gerçekleştirin. Dilim Microsphere numara Gün 1 (= 1 değişiklik katlayın) olduğu gibi Gün 7 aynı olmalıdır. Benzer şekilde, her bölgede Microsphere numarası Gün 1 (= 1 değişiklik katlayın) olduğu gibi Gün 7 aynı olmalıdır. Katlama değişiklik 1 farklıysa, bu zamanla dilim topografya değişiklikleri gösterir.
14. Boyama
- Bant th parafilm bir parçae lab tezgah ve (bir dilim boyutundan biraz daha büyük, her dilim için biri) bir sıvı bloker pap kalemle altı daireler çizin. Her dairenin ortasında bir nokta PBS yaklaşık 400 ul yerleştirin. Sayı her dilim tanımlamak için daireler etiket veya.
- 1 ml PBS içinde, dilim yaklaşık zarın bir boşluk bırakarak, dilim etrafında bir kare kesmek için bir traş makinesi bıçak kullanılır. Forseps ilk çemberin içine kesip dilim taşımak ve dikkatle PBS balonun üstünde dilim yatıyordu kullanma. Bu dilim kendi üzerine kat yok veya baş aşağı bu süreçte saygısız olsun emin olmak için gereklidir. Ardından, dilim altından PBS kaldırmak ve dilimin üstüne koydu ve batık kalır emin olmak için gerekirse daha fazla PBS ekleyin. Her dilim için bu adımı yineleyin.
- PBS içinde% 3 BSA, 10 ml sağlayın. 2 ml çıkartın ve ona digitonin 100 ul ekleyin. Karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika bloke etmek ve nüfuz edilebilir kılınması için dilimler ekle.
Not: Böyle Tri gibi diğer permeabilization maddelerinin kullanımıtonluk X-100 CM-DII etiketleme kaybına neden olur. - Permeabilizasyon / bloke çözeltisi çıkarın ve 10 dakika boyunca PBS ile 3 kez yıkayın.
- EDU için boyama ise, karışımın monte kiti tarafından sağlanan yönergeleri izleyin. 45 dakika boyunca karışımın uygulanır. Diğer antikorlar ile lekeleme, protokol primer ve sekonder antikor konsantrasyonu (~ birincil ve ikincil 1 saat, oda sıcaklığı) için optimize edilmelidir. 10 dakika boyunca PBS ile 3 kez yıkayın.
- PBS içinde 1.000 5 dk RT: DAPI 1 ile Leke. PBS ile 2x durulayın.
15. Dilimler Montaj
- Bir mikroskop lamı dilim aktarın. Dilim membran tarafı yukarı bakacak kalır ve kendi üzerine kat olmadığından emin olun. Bir sıvı bloker pap kalem dilim etrafında bir sınır çizin.
- Dilim her iki tarafında, küçük bir cam lamel (5 mm) yerleştirilir (hasar görmesini dilim tutmak için). Üstündeki (imüno) Fluoromount-G, iki veya üç damla damladilim zar zor onu karşılamak için. Sonra dilim uzun lamel (24 x 50 mm) kapsamaktadır.
- Her dilim için tekrarlayın. 4 ° C'de oje ve mağaza ile slaytlar kenarları mühür. Boyanma konfokal görüntüleme yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu bölüm sonuçlarının tip bölgesel mikroçevresinin tercih araştırmak için hem de yeni tedaviler test etmek için beyin tümörü / Organotipik dilim ko-kültür kullanmasını beklenen örneğidir. Biz tahlil doku örgütü olarak, beyin tümörleri için mikro çoğaltmak için tasarlanmış ve dilim proliferatif durumu (Şekil 3) muhafaza olduğunu göstermektedir. Ayrıca, zaman içinde dilim tümör hücrelerinin sayısında bir artış, kısmen beyin kesiti mikro-üzerine hücre göçü (Şekil 4) bağlı olabileceğini göstermektedir. Ayrıca dilimin belirli bölgeler için kültür hafta hücre sayısındaki katlı değişim hesaplanarak, bu ko-kültür kantitatif deneyi olarak kullanılabileceğini göstermiştir ya da tüm beyin dilim için (Şekil 6) çoklu ön sonuçları Tümör hücre tipleri, tümör hücrelerinin sayısı konfokal görüntüleme ile tayin edilebilir olduğunu göstermiştirhücreler sadece dilim içine 20-50 mikron derinliğinde göç olması nedeniyle 200 mikron kalınlığında dilim.
Biz kültür süresi boyunca sayısında herhangi bir hareketi ya da bir değişiklik gösterdiği için, yeşil floresan mikrosferler (Şekil 5) bir dilim topografideki değişiklikler yapılması için etkili bir kontrol olduğunu bulmuşlardır. Ko-kültür sabitledikten sonra, boyama tümör beyin mikro-hücreleri ve tümör hücre çoğalması, hücre ölümü ya da protein ekspresyonunda değişikliklere üzerinde ilaçların etkilerini (Şekil 7) incelemek için yapılabilir. Bu tahlil, bir Smo (Smoothened) antagonisti LDE225 (Sonidegib) ya da bir vasıta kontrol maddesi ile muamele ile fare medulloblastom hücrelerinin bir karşılaştırma yoluyla ilaç tedavileri test etmek için kullanılabileceğini göstermiştir. Kültürde bir haftadan sonra dilim hücre sayısındaki artış katlayın Bu veriler, nicel ve grafik (Gün 1 Gün 7 / hücre sayısı, hücre sayısı) ile temsil edildiği LDE225 büyük ölçüde dekontrol 6 ile karşılaştırıldığında katlanma tümör hücresi sayısı. Bu etki, aynı zamanda temsili görüntüleri görülebilir (Şekil 8) içermektedir. Ayrıca kesit kültürü deneyi (Şekil 9) yetiştirilen insan medulloblastoma hücrelerinin görüntüleri gösterir.
Şekil 3. Beyin Tümör / Organotipik Dilim Co-kültür Deney Tasarımı. (A) P6 fare Organotipik sajital beyin kesiti yarı-geçirgen zar üzerinde, doğrudan yerleştirilir ve orta kültür çanak tabanına ilave edilir. Kültür, bir tarafta ortamına daldırılmış ve diğer taraftan oksijen erişilebilir. Dilim ve hücre sayısı zamanla takip edilebilir üzerine Etiketli tümör hücrelerinin üst üste. (B) kültüründe, dilim yakından in vivo gözlenen benzer bir doku organizasyonunu tutar. PreservatioBeyin mikroçevresinin n dilim kültürü içinde beyincik dış granül tabakasında (EGL) proliferatif granül nöron öncüleri edu etiketleme ile gösterilmiştir. Bu gelişim aşamasında (P6) (beyaz ok EGL göstermektedir) in vivo gözlenen olacak gibi dilim kültür, bu öncü hücreleri, timidin analog edu dahil. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil beyin tümörü 4. İnsan Astrositom hücre / Organotipik Dilim Co-kültür Deneyi. Dilim kültür membran tümör hücrelerinin yerini değiştirmesi yansıtabilir dilim insan beyin tümörü hücrelerinde bir artış. (A) kenarında bir alan 1. Gün (üst) ve Gün 7 (alt) bir dilim hücreleri m olabilir beyin dilim üzerine zardan igrate. (B) olası hücre göçünün ikinci bir örnek beyin üzerine dilim kenarında. 1. Gün (üst) ve Günlük 7 (alt). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Floresan mikroküreler Şekil 5. Microsphere Kontrol Boncuk. Gün 1 (kırmızı) ve Günlük 7 (yeşil) kontrol görüntüleri kültürde bir hafta içinde mikroküreler hiçbir hareketi ortaya çıkarmak için (sarı) üst üste. Gün 1 ve Gün 7 görüntüleri dilim (Ölçek çubuğu = 45 um) içinde aynı pozisyonda alındı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
ImageJ Şekil 6. Kantitasyonu. (A) bir dilim görüntü ImageJ açıldı ve tüm dilim ve / veya bölgeler ölçümü için özetlenmiştir. (B) ilgi bölgesi seçilir ve yinelenen bir görüntü yapılır edilir. (C ) arka floresan görüntü dışına çıkartılır. (D) eşik hücre boyutu ve şekli için ayarlanmış, sayılır belirlenmesinde. (E) ilgi bölgesi içinde hücre sayısını saymak için parçacıkların analiz edin. Hücre sayısındaki Fold değişim daha sonra ilgi her bölge ya da dilim tüm alanı için Gün 1 hücre sayısına göre Günü 7 hücrelerinin sayısına bölünmesiyle hesaplanır. Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız .
Şekil Çoğalması 7. boyanması. Image (PFA dilim sabitleme sonra) boyama başarıyla kültüründe bir hafta sonra dilim yapılabilir nasıl örneğidir. Görüntü DAPInuclear boyama (mavi), kırmızı floresan etiketli fare medulloblastom hücreleri ve çoğalması için bir marker olarak DNA'ya Timidin analogunun dahil etmek için yeşil etiketleme gösterir. EDU (beyaz oklar EDU pozitif hücrelerini gösterir ve sarı oklar EDU negatif hücreler gösterir) (Ölçek çubuğu = 50 um) bir hafta boyunca dilim kültür ortamı (10 uM) eklenmiştir. Bu büyük halini görmek için tıklayınız rakam.
Şekil 8. Fare Medulloblas toma Hücreler LDE225 ile Tedavi. Bu rakam Dilim kaplama tahlil sisteminde tümör hücrelerinin ilaç tedavisini göstermektedir. Bir fare medulloblastom deneyinden toplanan verilerin (A) grafiksel gösterimi. DMSO kontrol koşulu (CTL) ve LDE225 (Sonidegib) (1 uM) (LDE) işlem durumu oldu. Kültürde bir haftadan sonra dilim hücre sayısındaki artış katlayın (n = 12 CTL, n = 13 LDE Hata çubukları = SEM). (B) Örnek (Gün 1 Gün 7 / hücre sayısı, hücre sayısı) nicelleştirilmiştir Gün 1 (yukarıda) ve Gün 7 (alt) araç kontrolü muamele edilmiş dilimlerinin ve görüntüler. (C) LDE temsili görüntüleri Gün 1 (yukarıda) ve Gün 7 (alt) dilimleri işlemden geçirildi. Görüntüler 4X büyütme alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
9 "src =" / files / ftp_upload / 53304 / 53304fig9.jpg "/>
Beyin Tümörü / Organotipik Dilim Co-kültür içinde 9. İnsan Medulloblastom Hücreleri Şekil. İnsan medulloblastoma hücreleri Washington Üniversitesi'nde James M. Olson elde edildi ve dilim kültür tahlilinde bir hafta büyütülmüştür. (A) Gün 1 görüntü ve fare beyin dilim yetiştirilen insan medulloblastom hücreleri. (B) kültüründe bir hafta (Günlük 7) sonra insan medulloblastom hücreleri ile aynı fare beyin dilim bir görüntü. Görüntüler 4X büyütme alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, beyin tümör hücreleri floresan etiketli ve P6 fare sagital beyin bölümünde kaplama ve sonra kültürde bir hafta izlenebilir açıklanır. Bu beyin tümörü / Organotipik dilim ko-kültür deneyi, tümör hücre sayısı bölgesel mikro-etkisini belirlemek için kullanılabilir ve aynı zamanda insan tümör büyümesi üzerine yeni bir ilaç tedavilerinin etkisini ölçmek için bir sistem olarak da kullanılabilir. Önceki çalışmalar nöral prekürsör çoğalma 7,8 beyin mikro-çevre rolünü değerlendirmek için benzer bir strateji kullandık.
Beyin tümörü hücreleri Organotipik dilim kültürü 9 tohumlandı edildiği Bu deney, normal hücre kültür koşullarında yaymak için zor olan, insan beyin tümörü hücrelerinin yetiştirilmesi için bir sistem sağlamaktadır. Bu prosedürün bir kritik yönü dilim ve tümör hücrelerinin sağlığını korumak önemidir. Dilimler d sırasında tampon içinde oturup süregörüntüleme sırasında issection ve oda sıcaklığında dilimleri ve hücreler, mümkün olduğu kadar sağlam kalmasını sağlamak amacıyla, sınırlı olmalıdır. Primer insan beyin tümör hücreleri, bu deneyde kullanılıyorsa, hücreler en kısa sürede biyopsi sonrası dilimleri kaplama olmalıdır. Bu nedenle, dilim ameliyattan önce hazırlanmalıdır. Dilimleri arasında görüntüleme zaman herhangi bir diferansiyel etkisini önlemek için, zamanın miktarı bir deneyde tüm dilim kültürler için kısa ve tutarlı olmalıdır kuluçka dışarı geçirdi. Zamanla mekansal tutarlı işaretleri sağladıkları gibi Microsphere kontrolleri önemlidir. Buna ek olarak, çekme, yırtılma ya da katlama dilim kültür bozulmalar mikroküre boncuk görüntüleme ile kolayca anlaşılacaktır.
Bu protokolün sınırlamalardan biri hücreler sadece yaklaşık bir hafta boyunca bu dilim kültür sistemi içinde yayılır edilebilmesidir. Bununla birlikte, beyin tümörlerinin bazı türleri için bu mevcut durumu o üzerinde önemli bir gelişmedirf işler. İkinci bir kısıtlama, kan-beyin bariyeri, beyin tümörleri tedavi etmek için kullanılabilen ilaçlar değerlendirilmesinde önemli bir husustur ki, ortadan kalkmasıdır. Üçüncü bir mesele, bu bileşiklerin bir kütüphanesi test etmek için kullanılamaz, düşük verim deney olmasıdır.
Bu tahlil, çok yönlü ve kolayca farklı tümör hücrelerinin tiplerini ve soruşturma çeşitli sorular incelemek için modifiye olduğunu. Bu protokol, tümör hücre hayatta kalması ve büyümesi üzerindeki yeni tedavilerin etkilerinin (Sun et al., Kişisel iletişim) incelemek için nicel bir tahlil olarak kullanılabilir. Beynin farklı bölgelerinde tümör hücre sayısındaki katlı değişim karşılaştırılması tümör büyümesi üzerinde mikro-etkilerini şifresini çözmek için bir yöntem temin etmektedir.
Bu beyin tümörü / Organotipik dilim ko-kültür sistemi de beyin tümörü hücreleri ve spesifik beyin mikroçevrelerde arasındaki ilişkiyi araştırmak imkanı sağlar. MaBeyin tümörlerinin ny tipleri belirli beyin bölgelerinin ve mikroçevrelerde 3,4 gelişmekte farklı bir desen göstermektedir. Sajital fare beyin dilim etiketli insan tümör hücrelerini yetiştirmek sureti ile, hücreler büyüme in vivo bölge ile tutarlı olabilir bölge tercihi için izlenebilir. Tümör hücreleri tümör hücre büyümesini destekleyen potansiyel faktörlerin belirlenmesine yol açabilecek tercih mikroçevresinin ayrıntılı incelenmesi. Bu deney in vitro hücre kültür koşullarında iyileştirilmesinde yardımcı olabilir ve ayrıca tümör başlaması önlenir ya da daha fazla etkin bir şekilde tedavi edilebilir nasıl çalışma için bir sistem temin edebilir.
Normal hücre kültürü koşullarında veya ortotopik fare veya deri altı xenografts tarafından yayılan edilemez beyin tümörleri belirli türleri vardır. Bu tümör türleri için, insan tümör hücreleri üzerinde yeni ilaç terapilerinin test etmek zordur. Bu protokol, insan beyin hücreleri tümörü dilim yetiştirilebilir göstermektedirKültür deneyi ve ilaç tedavileri nicel olarak değerlendirilebilir. Ardından ilaç tedavisi, tümör hücrelerinin ko-boyama tümör hücre proliferasyonu ve yol inhibisyonu üzerinde ilacın etkisinin daha fazla değerlendirme sağlayabilir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar 3D heterojen bir hücre kültürü ortamında 10 genel normal tek tabakalı hücre kültüründe kanser hücreleri üzerinde ilaçların etkisi arasında ciddi bir fark olabileceğini göstermektedir. In vitro olarak, kısa bir ömre sahip Benzer şekilde, yetişkin normal ve tümör epitelial hücreleri, 11 inhibitörü Rho kinaz ile bir arada fibroblast besleyici hücreleri üzerinde yetiştirilen koşullu proliferatif duruma yeniden programlamak gösterilmiştir. Bu çalışmalar ayrıca bir Organotipik, 3D, klinik olarak anlamlı mikroçevresinin ve mevcut kanser araştırma bu hücre kültür sistemi alaka tümör hücrelerini sürdürmenin önemini desteklemektedir. Bu nedenle, bu klinik relevan insan tümör hücreleri üzerinde ilaçların denenmesi için değerli bir deneydirt şekilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Invitrogen | 17504044 | |
| Glucose | Invitrogen | 17502048 | |
| Pennicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Neurobasal-A- Medium minus phenol red | Invitrogen | 12349015 | |
| Low Melting Point Agarose | Promega | V2111 | |
| Slice Culture Inserts | Milipore | PICM0RG50 | |
| laminin | Invitrogen | 23017015 | |
| Cm-DiI | Invitrogen | V22888 | |
| EDU (Labeling and Detection) | Life Technologies | c10337 | |
| Microspheres | Life Technologies | F-21010 | |
| Vibratome | Leica | ||
| Confocal Microscope | Nikon Eclipse Ni C2si | ||
| ImageJ software | |||
| 5 mm Cover Glasses | Fisher Scientific | 64-0700 (CS-5R) |
References
- Heddleston, J. M., et al. Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment. Curr Pharm Des. 17 (23), 2386-2401 (2013).
- Sasai, K. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66 (8), 4215-4222 (2006).
- Louis, D. N., et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol. 114 (2), 97-109 (2007).
- Duffau, H., Capelle, L.
- Chourmouzi, D., et al. Manifestations of pilocytic astrocytoma: a pictorial review. Insights Imaging. 5 (3), 387-402 (2014).
- Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci Transl Med. 2 (51), 51ra70 (2010).
- Choi, Y., Borghesani, P. R., Chan, J. A., Segal, R. A. Migration from a mitogenic niche promotes cell-cycle exit. J Neurosci. 25 (45), 10437-10445 (2005).
- Chan, J. A., et al. Proteoglycan interactions with Sonic Hedgehog specify mitogenic responses. Nat Neurosci. 12 (4), 409-417 (2009).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three- dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nat Commun. 6, 6220 (2015).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
