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Medicine

दवा के उपचारों ट्यूमर microenvironment अध्ययन और लक्षित के लिए एक मस्तिष्क ट्यूमर / Organotypic स्लाइस प्रणाली सह संस्कृति

Published: November 7, 2015 doi: 10.3791/53304
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1,4, 1, 5, 6, 1, 1
1Department of Cancer Biology, Dana-Farber Cancer Institute, 2Department of Pediatrics, Children's Hospital, 3Department of Biostatistics & Computational Biology, Dana-Farber Cancer Institute, 4Department of Developmental Biology and Cancer Research, Hebrew University of Jerusalem, 5Department of Neurosurgery, Children's Hospital, 6Center for Molecular Oncologic Pathology, Department of Medical Oncology, Dana-Farber Cancer Institute

Introduction

हाल ही कैंसर अनुसंधान ब्रेन ट्यूमर की एक किस्म के लिए आनुवंशिक परिवर्तन, आणविक परिवर्तन और संभव उपचार की पहचान करने में महत्वपूर्ण प्रगति कर दिया है। इस प्रगति के बावजूद, ब्रेन ट्यूमर वयस्कों और बच्चों के लिए कैंसर से संबंधित मृत्यु दर के शीर्ष कारणों में से एक बना हुआ है। ब्रेन ट्यूमर अनुसंधान के क्षेत्र में सीमित कारकों प्राथमिक रोगी के नमूने और सेल लाइनों के प्रतिबंधित उपलब्धता और पहुंच प्रायोगिक प्रणाली में अनूठा और विषम मस्तिष्क microenvironment नकल करने में कठिनाई शामिल हैं। कई मस्तिष्क के लिए समय के साथ अभी तक ज्ञात नहीं कर रहे हैं ट्यूमर कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए आवश्यक शर्तों ट्यूमर। यहाँ तक कि neurospheres के रूप में सेल निलंबन में उगाया जा सकता है कि मस्तिष्क ट्यूमर के लिए, संस्कृति की स्थिति ट्यूमर कोशिकाओं 1,2 प्रभावित कर सकता है। दरअसल, बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक या epidermal वृद्धि कारक के अलावा प्रसार को प्रोत्साहित करने और जीन अभिव्यक्ति 1 बदल सकता भेदभाव को बाधित करने के लिए। ट्यूमर कोशिकाओं के विकास में इस तरह के लिए अन्य तरीकोंट्यूमर कोशिकाओं के ओर्थोटोपिक या चमड़े के नीचे जेनोग्राफ्ट के माध्यम से चूहों में ट्यूमर प्रचार के रूप में मूल्यवान assays हैं, लेकिन इस तरह के इंजेक्शन और अध्ययन किया जा सकता है कि ट्यूमर के विकास (विशेष रूप से कम ग्रेड ट्यूमर के लिए), लागत, और ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या का समय जैसे कारकों द्वारा सीमित हैं । मानव मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं को उगाने के लिए इस प्रकार मौजूदा तरीकों कुछ ट्यूमर प्रकार बनाए रखने के लिए अपर्याप्त हैं, और अक्सर निकट नकल इन विवो ट्यूमर वातावरण ऐसा नहीं है कि कृत्रिम वातावरण प्रदान करते हैं।

बाल चिकित्सा ब्रेन ट्यूमर के विशिष्ट प्रकार के मस्तिष्क के भीतर अति विशिष्ट स्थानों में बढ़ने [3, 4] और इस ट्यूमर के विकास के लिए अलग microenvironmental आवश्यकताओं को प्रतिबिंबित करने की संभावना है [5]। इस प्रोटोकॉल सामान्य संस्कृति की स्थिति में प्रचार करने के लिए मुश्किल हो जाता है कि कोशिकाओं को एक organotypic मस्तिष्क microenvironment में उगाया जा सकता है, जहां एक उपन्यास प्रणाली का वर्णन विवो ट्यूमर के विकास की स्थिति में जो mimics। इस मात्रात्मक परख में, fluorescently लेबलमस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं किशोर माउस मस्तिष्क organotypic स्लाइस पर चढ़ाया और समय के साथ निगरानी कर रहे हैं। इस परख ट्यूमर के विकास पर microenvironment के प्रभाव की जांच करने के लिए, और एक चिकित्सकीय प्रासंगिक मस्तिष्क microenvironment में नई दवा के उपचारों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

आचार कथन: पशु विषयों को शामिल निम्न प्रक्रिया स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार किया गया था और दाना-Farber कैंसर संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। सभी मानव विषयों काम संस्थागत समीक्षा बोर्ड जरूरत पड़ने पर सभी विषयों से प्राप्त हुई थी सहमति बताया कि ब्रिघम और महिला अस्पताल और दाना-फार्बर कैंसर संस्थान, की और उचित उपयोग के लिए स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय द्वारा समितियों, और सहमति आवश्यकताओं की उचित छूट द्वारा समीक्षा की गई कम से कम जोखिम के अध्ययन के लिए प्राप्त हुई थी।

टुकड़ा संस्कृति प्रोटोकॉल की समय रेखा:

चित्र 1
ब्रेन ट्यूमर / Organotypic स्लाइस सह संस्कृति प्रोटोकॉल 1. समय चित्रा। यह आंकड़ा सभी आठ दिन ओ को शामिल टुकड़ा संस्कृति प्रक्रिया का समय दर्शाया गया हैप्रयोग और प्रक्रिया के प्रमुख कदम च। कोशिकाओं कोशिकाओं चढ़ाना पहले प्रक्रिया दिनों शुरुआत के महत्व को उजागर करने के क्रम में टुकड़ा पर चढ़ाया जाता है जब समय दिवस 0 के सापेक्ष है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1. विच्छेदन बफर

  1. 15 मिमी HEPES (1 एम), 6.5mg / एमएल ग्लूकोज, 1.3 मिमी MgSO4 (1 एम), 20 मिमी KCl (2 एम) और 1% पेनिसिलिन / 1x HBSS में स्ट्रेप्टोमाइसिन तैयार करें।
  2. NaOH के साथ 7.4 पीएच को समायोजित करें।
  3. -20 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर और दुकान।

2. स्लाइस संस्कृति मीडिया

  1. Neurobasal-ए मझौले शून्य से फिनोल लाल में B-27, 1% एन 2 के पूरक, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% Glutamax, और 1.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर ग्लूकोज 2% तैयार करें।
  2. -20 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर और दुकान। जरूरत के रूप में पिघलना, और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह के बाद त्यागें।
    नोट: निम्न प्रक्रिया पर अप करने के लिए किया जा सकता हैविच्छेदन शुरू करने से पहले ई दिन।
  3. 3% कम पिघलने बिंदु agarose
    नोट: निम्न प्रक्रिया विच्छेदन शुरू करने से पहले एक दिन तक किया जा सकता है।
  4. ढीले टोपी के साथ 25 सेकंड के लिए विच्छेदन बफर, माइक्रोवेव के ~ 31 मिलीलीटर में agarose 0.9 ग्राम कम पिघलने बिंदु मिलाएं। पिघल गए और जब तक माइक्रोवेव यकीन मिश्रण अतिप्रवाह नहीं है।
  5. जरूरत तक 55-65 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: निम्न प्रक्रिया विच्छेदन शुरू करने से पहले एक दिन तक किया जा सकता है।

4. कोट laminin के साथ स्लाइस संस्कृति इंसर्ट

नोट: निम्न प्रक्रिया विच्छेदन शुरू करने से पहले एक दिन तक किया जा सकता है।

  1. एक टिशू कल्चर हुड में, बाँझ संदंश का उपयोग, 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में एक टुकड़ा संस्कृति डालने जगह (आप प्राप्त करने का इरादा स्लाइस की संख्या मैच, लगभग 12 एक प्रक्रिया से एकत्र किया जा सकता है। निम्न प्रक्रिया के लिए लिखा है छह स्लाइस)। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार टी भरें 1x पीबीएस के साथ उबे (800 μl / डालने) और laminin (10 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें।
  2. प्रत्येक टुकड़ा संस्कृति डालने के शीर्ष करने के laminin मिश्रण के 800 μl जोड़ें। जरूरत तक 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

विच्छेदन के लिए 5. तैयारी

  1. टुकड़ा संस्कृति मीडिया के 1,200 μl के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से भरें। 1,200 μl पीबीएस के साथ किसी भी अप्रयुक्त कुओं भरें और पीबीएस 1x 5 मिलीलीटर के साथ प्लेट के केंद्र स्थान को भरने के। 37 डिग्री सेल्सियस पर इस प्लेट स्टोर।
  2. 70% इथेनॉल में विच्छेदन उपकरण जीवाणुरहित। तेल निकालने और उपयोग करने से पहले बाँझ एसीटोन के साथ vibratome ब्लेड साफ कर लें।
  3. तीन 35 मिमी 2 व्यंजन और हुड में पांच से 10 सेमी 2 टिशू कल्चर बर्तन रखें। बर्फ पर विच्छेदन बफर और जगह के साथ एक 10 सेमी 2 पकवान भरें।
    नोट: प्रक्रिया एक समय में एक पिल्ले।

6. विच्छेदन

नोट: प्रक्रिया एक समय में एक पिल्ले।

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चित्रा 2. विच्छेदन कटौती। इन छवियों को एक पी 6 माउस के मस्तिष्क से खोपड़ी को दूर करने के लिए आवश्यक विच्छेदन कटौती दिखा। कटौती बिंदीदार लाइनों के रूप में दिखाया गया है। (ए) 1 दिखाया गया है काटें। कटौती 1 और 2 द्विपक्षीय स्तर पर प्रत्येक पक्ष पर थैली को जोड़ने के मस्तिष्क / पीछे .. (बी) 3 और 4 में दिखाया जाता है कटौती से बना रहे हैं। 3 1 और 2 कट 4 कटौती 3 के midline में शुरू होता है और घ्राण बल्ब के बीच खोपड़ी (स्केल बार = 4.4 मिमी) विभाजित नाक। के सिरे की ओर जारी है अन्य को जोड़ने कटौती करने के लिए एक थैली से बना कटौती करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. Isoflurane जोखिम (100 isoflurane%) का उपयोग कर पी 6 माउस anesthetize। लगभग 5 मिनट के बाद धीमा है साँस लेने या श्वसन के कोई संकेत नहीं है, जब जल्दी से सिर काटनातेज कैंची के साथ माउस। एक टिशू कल्चर पकवान में 70% इथेनॉल और जगह के साथ सिर का छिड़काव करें।
  2. का उपयोग बड़े कुंद संदंश नाक हथियाने के द्वारा स्थिर सिर पकड़। मध्यम आकार के विच्छेदन कैंची का प्रयोग, खोपड़ी प्रकट करने के लिए अतिरिक्त त्वचा को हटा दें।
  3. थैली में कटौती को जोड़ने, प्रत्येक पक्ष पर सामने की ओर खोपड़ी के पीछे से, द्विपक्षीय रूप से खोपड़ी में कटौती करके कटौती 1 और 2 बनाओ। ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए संभव के रूप में खोपड़ी के करीब के रूप कैंची की नोक रखें।
  4. कटौती 3 के लिए, कटौती 1 कनेक्ट करने के लिए छोटे वसंत कैंची का उपयोग करें और 2. फिर धीरे खोपड़ी बंद छील करने के लिए छोटे कुंद संदंश का उपयोग करें।
  5. छोटे वसंत कैंची का प्रयोग, धीरे शेष खोपड़ी 2 हिस्सों हो जाता है, जैसे कि शीर्ष पर midline के साथ शेष खोपड़ी में कटौती (चित्रा 2 # कटौती 4)। संदंश का प्रयोग दो घ्राण बल्ब प्रकट करने के लिए खोपड़ी दूर छील।
  6. एक फ्लैट का सामना करना पड़ा रंग डालें (विच्छेदन बफर के साथ सिक्त, इसलिए ऊतक यह छड़ी नहीं होगा) बी के बीच मेंमस्तिष्क और खोपड़ी के आधार के ottom, धीरे मस्तिष्क को हटा दें और बर्फ पर विच्छेदन बफर युक्त डिश में जगह है।
  7. टुकड़ा करने की क्रिया के लिए एक दूसरे मस्तिष्क प्राप्त करने के लिए 6 चरण को दोहराएँ

7. agarose में दिमाग एम्बेड

  1. बर्फ पर खुला 35 मिमी 2 व्यंजनों की दो जगह और 70% इथेनॉल के साथ बड़े कुंद संदंश की एक जोड़ी नीचे पोंछे।
  2. शीर्ष पर एक गुंबद रूपों तक दो बर्तन में (चरण 3 में तैयार) 3% कम पिघलने बिंदु agarose डालो। 3 मिनट के लिए टाइमर सेट। 3 मिनट पर एक agarose से भरे 35 मिमी पकवान के पक्ष में कुंद संदंश और जगह के साथ एक मस्तिष्क को लेने (agarose के polymerization मनाया जा सकता है, तो agarose से भरे गुंबद के रिम को छू द्वारा परीक्षण, यह तैयार है), तो चाल डिश के केंद्र के लिए यह (यह बेहतर mounts तो यह मस्तिष्क के आसपास अतिरिक्त विच्छेदन बफर हटा)।
  3. 2 एन डी मस्तिष्क के लिए दोहराएँ। 10 मिनट के लिए एक टाइमर शुरू करो।
  4. 10 मिनट के बाद, के बीच अंतरिक्ष में एक फ्लैट रंग डालनेagarose और पकवान पी 6 दिमाग युक्त polymerized agarose बाहर पॉप।
  5. किनारों के रूप में सीधे संभव के रूप में कर रहे हैं, यकीन है कि मस्तिष्क के चारों ओर एक घन में agarose ट्रिम करने के लिए एक फ्लैट धार का प्रयोग करें।
  6. दो स्ट्रिप्स में vibratome थाली पर superglue रखें। फिर, agarose घुड़सवार मस्तिष्क उठाओ और धीरे से बाण के स्लाइस के लिए तैनात गोंद, पर यह ड्रॉप डाउन। अन्य मस्तिष्क के लिए एक ही मत करो। दोनों दिमाग एक दूसरे के साथ लाइन में खड़ा कर रहे हैं सुनिश्चित करें।
  7. 5-8 मिनट के लिए आरटी पर गोंद शुष्क करते हैं। इस समय के दौरान, कुचल बर्फ और पानी के साथ vibratome की बर्फ धारक क्षेत्र को भरने के।

8. vibratome साथ टुकड़ा करने की क्रिया

  1. यह जगह में बंद करने के लिए सही करने के लिए टैब चलती है, बर्फ धारक क्षेत्र में काटने जलाशय रखें।
  2. परिपत्र सिर स्क्रू ड्राइवर का उपयोग करना, उस पर चिपके दिमाग के साथ परिपत्र vibratome थाली उठा, और जलाशय में फिट बैठते हैं। स्क्रू ड्राइवर निकालें और वें के साथ जगह में थाली सुरक्षितई हेक्सागोनल सिर स्क्रू ड्राइवर। प्लेट और काटने जलाशय जगह में मजबूती से कर रहे हैं सुनिश्चित करें।
  3. संदंश का प्रयोग, पिक vibratome ब्लेड, हेक्सागोनल स्क्रू ड्राइवर के साथ जगह में काटने के सिर, ताला में फिट बैठते हैं। फिर, दौर पेंच का उपयोग vibratome पर संलग्न ब्लेड के साथ सिर काटने सुरक्षित है।
  4. सुनिश्चित कर रही है, जबकि उस्तरा (बस के ऊपर या) एक ही ऊंचाई पर है, दिमाग में संभव के रूप agarose एम्बेडेड दिमाग के करीब के रूप उस्तरा की स्थिति को ऊपर लाने के लिए। ब्लेड को कवर करने के लिए पर्याप्त ठंड विदारक बफर के साथ चैम्बर भरें।
  5. प्रेस ↕ बटन एक बार (आप ब्लेड आगे और पीछे जाना होगा जब इस बटन सीमाओं को परिभाषित करता है, यह पलक देखना चाहिए), तो प्रेस और उस्तरा agarose ब्लॉक को साफ करता है जब तक मैन्युअल एम्बेडेड मस्तिष्क, रिलीज कटौती करने के लिए "आगे" पकड़ो। इसके तत्काल बाद यह स्वत: काटने के लिए रेंज के अंत को परिभाषित करेगा, फिर ↕ बटन दबाएँ।
  6. एक बार "एकल / CONT" बटन और l दबाएँCONT द्वारा ight पर जाना चाहिए। Trimming स्थापित हो जाएगा 4. यह करने के लिए 5.5-6 आवृत्ति, और गति हिल, 400-450 माइक्रोन को काटने मोटाई निर्धारित करें।
  7. एक बार "/ बंद शुरू" बटन दबाएँ, और स्वत: काटने शुरू करना चाहिए। प्रेस "ठहराव" की जरूरत है, के रूप में छेद के साथ चम्मच का उपयोग ऊतक लेने के लिए। यह midline के करीब तक पहुंचने के लिए, के बारे में 5-10 मिनट के लिए ले जाना चाहिए। इस बिंदु पर, प्रेस "थामने" और 3 को गति बदलने के लिए और 200 माइक्रोन मोटाई बदल जाते हैं। इस परिवर्तन करने के बाद उत्पादन पहला टुकड़ा एकत्र नहीं है।
  8. 200 माइक्रोन मोटाई के वांछित स्लाइस सेरिबैलम के माध्यम से घ्राण बल्ब अच्छी तरह से परिभाषित करना होगा। वे बर्फ पर विच्छेदन बफर के साथ भरा 6 अच्छी तरह प्लेटों में कटौती कर रहे हैं के रूप में प्रत्येक वांछित टुकड़ा स्थानांतरण। संभव के रूप में यह रूप में छोटे छू टुकड़ा फ्लोट यह slotted चम्मच भर में squarely है जब बफर से बाहर लिफ्ट करने के लिए ऊतक के आसपास टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष में बफर ले जाकर यह मत करो। आम तौर पर लगभग 1वांछित संरचनाओं के साथ 2 स्लाइस एकत्र किया जा सकता है। स्लाइस करने के लिए 20 मिनट के लिए बर्फ पर बफर विदारक में छोड़ा जा सकता है।
  9. स्लाइस बर्फ पर हैं, सम्मिलित करता है 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से laminin के साथ लेपित किया जा रहा के साथ 6 अच्छी तरह से थाली बाहर ले। विच्छेदन हुड में सम्मिलित करता है को नुकसान नहीं laminin देखभाल त्यागें। प्रत्येक डालने के शीर्ष करने के लिए टुकड़ा संस्कृति मीडिया के 3.5 मिलीलीटर जोड़ें। मीडिया के शीर्ष कुओं में बाहर spilling के बिना एक गुंबद के आकार के रूप में होगा।

9. चढ़ाना इंसर्ट पर स्लाइस

  1. Slotted चम्मच उपकरण का उपयोग, धीरे टुकड़ा पूरी तरह से जलमग्न होने के लिए प्रेरित कर रहा, डालने पर मीडिया में एक मस्तिष्क टुकड़ा जगह है। सभी स्लाइस के लिए दोहराएँ।
  2. डालने के ऊपर से टुकड़ा संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर बाहर निकालना और अच्छी तरह से नीचे में वितरित करने के लिए एक P1000 का प्रयोग करें। निकालें और मस्तिष्क के आसपास agarose के किनारों दिखाई दे slicebecome जब तक अतिरिक्त मीडिया त्यागें। शेष स्लाइस के लिए यह मत करो।
  3. टी उठाओवह संदंश, झुकाव के साथ रिम द्वारा डालने और अतिरिक्त मीडिया को हटा दें। फिर, जल्दी टुकड़ा संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर युक्त 35 मिमी 2 डिश में डालने के हस्तांतरण। खिंचाव / क्षति टुकड़ा या आप agarose की बहुत किनारे पर एक आंसू करते हैं, तो agarose से अलग खींच सबसे आसान (झिल्ली में एक छेद प्रहार करने के लिए नहीं, देखभाल करने के ऊतक के आसपास agarose दूर करने के लिए तेज संदंश के 2 जोड़े उपयोग दोनों ओर)। फिर वापस 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए डालने के लिए कदम और शेष स्लाइस के लिए दोहराएँ।
  4. धौंकनी बंद के साथ एक टिशू कल्चर हुड में (बाहर सुखाने से स्लाइस रोकने के लिए) प्रत्येक झिल्ली से agarose टुकड़े को हटा दें।
  5. 5.1 कदम में तैयार 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए स्लाइस स्थानांतरण और 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली की दुकान। 24-48 घंटे के लिए स्लाइस सेते हैं।

10 स्लाइस संस्कृति मीडिया बदल रहा है

  1. एक ताजा 6 अच्छी तरह से थाली के साथ दोहराएँ कदम 5.1।
  2. धौंकनी बंद के साथ एक टिशू कल्चर हुड में, शेष भाग नया 6 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए सम्मिलित करता है हस्तांतरणताजा टुकड़ा मीडिया aining।

स्लाइस पर 11. चढ़ाना ट्यूमर कोशिकाओं

  1. 2 मिनट के लिए मध्यम गति पर मुख्यमंत्री DiI डाई और स्पिन Sonicate।
  2. स्पिन ट्यूमर कोशिकाओं 5 मिनट के लिए 201 XG पर ओवरले के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है। तब टुकड़ा संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर में resuspend।
  3. कोशिकाओं और मीडिया के 2 मिलीलीटर में मुख्यमंत्री DiI के 7 μl जोड़ें और 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. टुकड़ा करने की क्रिया मीडिया के 200 μl में 5min और resuspend के लिए 201 XG कोशिकाओं स्पिन। Triturate धीरे (10-20 बार या गोली चला गया है जब तक) कोशिकाओं को अलग कर देना और उसके बाद 1000 μl कुल मात्रा बनाने के लिए मीडिया को काटने के 800 μl जोड़ें।
  5. Trypan नीले रंग का उपयोग कर व्यवहार्य ट्यूमर कोशिकाओं की गणना। कोशिकाओं के रूप में एक ही एकाग्रता में, ट्यूमर कोशिकाओं को हरी फ्लोरोसेंट microspheres जोड़ें। ये अक्रिय microspheres एक नियंत्रण के रूप में काम करेगा। 5 मिनट और टुकड़ा संस्कृति मीडिया के वांछित राशि में resuspend के लिए 201 XG पर सेल / microsphere मिश्रण स्पिन। 6000 कोशिकाओं के घनत्व पर प्लेट कोशिकाओं / SL65 μl मात्रा में बर्फ। टुकड़ा प्रति चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या वरीयता और उपलब्धता के आधार पर बढ़ाया जा सकता है।
  6. टिशू कल्चर हुड में टुकड़ा के केंद्र पर मीडिया / टुकड़ा के 65 μl में कोशिकाओं को बांटना।

12. इमेजिंग और फिक्सिंग

नोट: एक Nikon ग्रहण नी C2si कोंफोकल लाल और हरे रंग का फ्लोरोसेंट चैनल के साथ 4X पर पूरे बाण टुकड़ा की एक बड़ी छवि स्कैन लेने के लिए इस्तेमाल किया गया था ईमानदार। स्कैनिंग सुविधा उपलब्ध नहीं है, तो टुकड़ा भर में एकाधिक छवियों को क्रमिक रूप से ले और बाद में (microspheres के स्थान और नेविगेट करने के लिए टुकड़ा के किनारे का उपयोग) फ़ोटोशॉप में एक साथ छवियों सिलाई।

  1. अगले दिन (1 दिवस इमेजिंग), 1 मिलीलीटर टुकड़ा संस्कृति मीडिया के साथ छह से 35 मिमी 2 व्यंजन में स्लाइस हस्तांतरण। छवि फ्लोरोसेंट ईमानदार माइक्रोस्कोप पर एक समय में एक टुकड़ा है। लाल और हरे रंग का फ्लोरोसेंट चैनल के साथ 4X पर पूरे बाण टुकड़ा की एक बड़ी छवि स्कैन ले। लेजर रखेंऔर लाभ प्रत्येक टुकड़ा के लिए एक ही सेटिंग्स। इमेजिंग के अंत में, पीठ ताजा टुकड़ा मीडिया वाले 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए सभी स्लाइस हस्तांतरण।
  2. EDU, अन्य प्रसार मार्कर या दवा हालत के अलावा वांछित है, उपचार हालत के लिए दैनिक मीडिया परिवर्तन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि दवा के साथ टुकड़ा मीडिया के एक शेयर पैदा करते हैं। उपचार हालत (सीधे दिवस 1 इमेजिंग के बाद) कदम 12.1 पर पेश किया जाना चाहिए। किसी भी EDU या प्रसार मार्कर मीडिया भी 12.1 पर शुरुआत करने के लिए जोड़ा गया है और (10 माइक्रोन से कम EDU का उपयोग करें) दैनिक ताजा हो जाना चाहिए।
  3. छवि फिर 7 दिन पर दिवस के रूप में 1 छवियों को एक ही सेटिंग्स का उपयोग।
  4. 7 दिन इमेजिंग पूर्ण होने पर, 4% paraformaldehyde (पीएफए) के प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त 1.2 मिलीलीटर के साथ 6 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक टुकड़ा ले जाते हैं। ध्यान से और धीरे प्रत्येक टुकड़ा के शीर्ष पर पीएफए ​​के एक अतिरिक्त 1 मिलीलीटर ड्रॉप। 1 घंटे के लिए आरटी पर छोड़ दें।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से और प्रत्येक टुकड़ा के ऊपर से पीएफए ​​निकालें। पीबीएस के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक 3x धो लें। पीबीएस में स्लाइस स्टोरधुंधला हो जाना या स्लाइड पर बढ़ते के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
    नोट: ImageJ सेटिंग्स छवि और माइक्रोस्कोप गुणवत्ता के साथ ही ट्यूमर कोशिका के आकार के लिए खाते में समायोजित करने और अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।

छवियाँ 13. मात्रा (ImageJ का उपयोग)

नोट: ImageJ सेटिंग्स छवि और माइक्रोस्कोप गुणवत्ता के साथ ही ट्यूमर कोशिका के आकार के लिए खाते में समायोजित करने और अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।

  1. ImageJ में, पूरे टुकड़ा या आप यों करना चाहते हैं कि इस क्षेत्र की रूपरेखा तैयार करने के लिए बहुभुज उपकरण का उपयोग करें। आप यह नाम बदलने और इसे बचाने के लिए कर सकते हैं जहां आरओआई प्रबंधक को इस चयन जोड़ें।
  2. सही चयनित क्षेत्र पर क्लिक करें और नकल चुनें। क्षेत्र, टुकड़ा, दिन के साथ इस डुप्लिकेट छवि नाम। प्रेस सीटीएल + Shift + ई तो, चयन प्रक्रिया रूपरेखा दिखाने के लिए - घटाना पृष्ठभूमि - गेंद रोलिंग त्रिज्या = 4।
  3. पृष्ठभूमि घटाव के बाद, चुनें "छवि" लटकती मेनू में "सीमा समायोजित"। काले रंग की पृष्ठभूमि की जाँच करें -; में तेजी से बढ़ी छवि को देखो और सीमा निर्धारित किया है। आप दहलीज बार ले जाकर सीमा निर्धारित है, सभी कोशिकाओं / शामिल प्रकाश डाला लेकिन (एक सेल से या छोटे) मलबा हैं कि बेहद छोटे डॉट्स शामिल नहीं हैं सुनिश्चित कर रहे हैं। सभी छवियों के लिए एक ही सीमा का उपयोग करें। ओर करने के लिए सीमा खिड़की ले जाएँ।
  4. खंडित कणों के रूप में पूर्वावलोकन बिंदु चयन, उत्पादन प्रकार, कम सीमा से ऊपर, धार Maxima को बाहर निकाल: "Maxima खोजें" और 5 और 10 के बीच शोर सहिष्णुता की स्थापना की और निम्न जांच - "प्रक्रिया" का चयन करें। तब सीटीएल + Shift + ई दबाकर हित के क्षेत्र भि।
  5. विश्लेषण ड्रॉप डाउन मेनू से "कणों का विश्लेषण" का चयन करें। 4-40 के लिए पिक्सेल आकार और 0.00-1.00 को घेरा सेट करें। इसके अलावा 'शो ओवरले रूपरेखा "" प्रदर्शन के परिणाम पर क्लिक करें "और", तो प्रेस ठीक है "संक्षेप।
  6. सभी कच्चे डेटा और एक दस्तावेज़ में सारांश रिकॉर्ड। प्रत्येक क्षेत्र के लिए मैं "गणना"संस्कृति में एक सप्ताह से अधिक गुना परिवर्तन की गणना करने की जरूरत है।
  7. सीमा और अन्य सेटिंग्स लगातार बने हुए हैं, यकीन है कि सभी चित्र और हित के क्षेत्रों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  8. इसी प्रकार 1 दिन पर टुकड़ा पर कोशिकाओं की संख्या से 7 दिन पर टुकड़ा पर ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या से विभाजित करके संस्कृति में इस सप्ताह के दौरान टुकड़ा पर सेल नंबर में गुना परिवर्तन की गणना प्रत्येक क्षेत्र के भीतर सेल नंबर में परिवर्तन गुना 1 दिवस पर उस क्षेत्र में कोशिकाओं की संख्या से 7 दिन पर उस क्षेत्र में कोशिकाओं की संख्या से विभाजित करके गणना की है।
  9. के रूप में अच्छी तरह से microspheres के लिए कदम 13.8 प्रदर्शन करते हैं। टुकड़ा पर microsphere संख्या दिन 1 (= 1 परिवर्तन गुना) पर के रूप में 7 दिन पर ही होना चाहिए। इसी तरह, प्रत्येक क्षेत्र के भीतर microsphere संख्या दिन 1 (= 1 परिवर्तन गुना) पर के रूप में 7 दिन पर ही होना चाहिए। मोड़ो परिवर्तन 1 से अलग है, तो यह समय के साथ टुकड़ा स्थलाकृति में परिवर्तन का संकेत है।

14. धुंधला

  1. टेप वें पर parafilm का एक टुकड़ाई प्रयोगशाला बेंच और (एक टुकड़ा के आकार की तुलना में सिर्फ बड़े प्रत्येक टुकड़ा के लिए एक,) एक तरल अवरोधक पैप कलम के साथ छह हलकों आकर्षित। प्रत्येक चक्र के मध्य में एक बिंदु में पीबीएस के बारे में 400 μl रखें। संख्या प्रत्येक टुकड़ा की पहचान करने के लिए हलकों लेबल या।
  2. पीबीएस के 1 एमएल में, टुकड़ा के आसपास झिल्ली की कुछ जगह छोड़ने टुकड़ा के चारों ओर एक वर्ग में कटौती करने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें। संदंश के पहले चक्र में कटौती से बाहर टुकड़ा ले जाने के लिए और ध्यान से पीबीएस के बुलबुले के शीर्ष पर टुकड़ा रखना का उपयोग करना। यह टुकड़ा पर ही खत्म गुना नहीं करता या उल्टा इस प्रक्रिया के दौरान से फ़्लिप मिल सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। फिर, टुकड़ा नीचे से पीबीएस निकालें और टुकड़ा के शीर्ष पर रख दिया और यह जलमग्न रहता है सुनिश्चित करने के लिए यदि आवश्यक हो तो अधिक पीबीएस जोड़ने। प्रत्येक टुकड़ा के लिए इस चरण को दोहराएँ।
  3. पीबीएस में 3% BSA के 10 मिलीलीटर बनाओ। 2 मिलीलीटर बाहर ले लो, और यह करने के लिए digitonin के 100 μl जोड़ें। मिक्स और, आरटी पर 30 मिनट के लिए ब्लॉक और permeabilize स्लाइस में जोड़ें।
    नोट: इस तरह के त्रि के रूप में अन्य permeabilization के एजेंटों के उपयोगटन एक्स 100 सेमी-DiI लेबलिंग का नुकसान होगा।
  4. Permeabilization / अवरुद्ध समाधान निकालें और 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3x कुल्ला।
  5. EDU लिए धुंधला हो जाना है, तो मिश्रण को इकट्ठा करने के लिए किट द्वारा प्रदान निर्देशों का पालन करें। 45 मिनट के लिए मिश्रण को लागू करें। अन्य एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो, तो प्रोटोकॉल प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता (~ प्राथमिक और माध्यमिक के लिए 1 घंटा आरटी) के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3x कुल्ला।
  6. पीबीएस में 1,000 5 मिनट आरटी के लिए: DAPI एक साथ दाग। पीबीएस के साथ 2x कुल्ला।

15. स्लाइस बढ़ते

  1. एक खुर्दबीन स्लाइड करने के लिए टुकड़ा स्थानांतरण। टुकड़ा के साथ झिल्ली की ओर का सामना करना पड़ बनी हुई है, और खुद पर खत्म गुना नहीं करता है सुनिश्चित करें। एक तरल अवरोधक पैप कलम के साथ टुकड़ा चारों ओर एक सीमा ड्रा।
  2. टुकड़ा के प्रत्येक पक्ष पर एक छोटे से गिलास coverslip (5 मिमी) की जगह (क्षतिग्रस्त होने से टुकड़ा रखने के लिए)। के शीर्ष पर (immunofluorescence के लिए) Fluoromount-जी के दो या तीन बूँदें गिराटुकड़ा अभी मुश्किल से इसे कवर करने के लिए। तब टुकड़ा लंबे coverslip (24 x 50 मिमी) को कवर किया।
  3. प्रत्येक टुकड़ा के लिए दोहराएँ। 4 डिग्री सेल्सियस पर नेल पॉलिश और दुकान के साथ स्लाइड के किनारों को सील। धुंधला की confocal इमेजिंग करो।

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Representative Results

यह खंड परिणामों के प्रकार क्षेत्रीय microenvironment वरीयता की जांच करने के साथ ही नए उपचारों का परीक्षण करने के लिए मस्तिष्क ट्यूमर / organotypic टुकड़ा सह संस्कृति के उपयोग से उम्मीद की जा रही एक मिसाल है। हम परख ऊतक संगठन के रूप में, ब्रेन ट्यूमर के लिए microenvironment को दोहराने के लिए बनाया गया है और टुकड़ा के proliferative राज्य (चित्रा 3) बनाए रखा है कि पता चलता है। हम यह भी समय के साथ टुकड़ा पर ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि आंशिक रूप से मस्तिष्क टुकड़ा microenvironment पर कोशिकाओं के प्रवास (चित्रा 4) के कारण हो सकता है कि प्रदर्शित करता है। हम यह भी टुकड़ा के विशिष्ट क्षेत्रों के लिए संस्कृति में एक सप्ताह से अधिक सेल नंबर में गुना परिवर्तन की गणना के द्वारा इस सह-संस्कृति एक मात्रात्मक परख के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि पता चला है, या पूरी मस्तिष्क टुकड़ा के लिए (चित्रा 6) कई से प्रारंभिक परिणाम ट्यूमर सेल प्रकार के ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या के confocal इमेजिंग द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है कि पता चला हैकोशिकाओं केवल टुकड़ा में 20-50 माइक्रोन की गहराई की ओर पलायन है कि इस तथ्य के कारण 200 माइक्रोन मोटी टुकड़ा।

हम वे संस्कृति में समय भर में संख्या में कोई आंदोलन या परिवर्तन दिखा क्योंकि हरी फ्लोरोसेंट microspheres (चित्रा 5) टुकड़ा स्थलाकृति में परिवर्तन के लिए एक प्रभावी नियंत्रण हो पाया है। सह संस्कृति फिक्सिंग के बाद, धुंधला ट्यूमर एक मस्तिष्क microenvironment में कोशिकाओं और ट्यूमर सेल प्रसार, कोशिका मृत्यु, या प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन पर दवाओं के प्रभाव (चित्रा 7) की जांच करने के लिए किया जा सकता है। हम इस परख एक Smo (smoothened) प्रतिपक्षी LDE225 (Sonidegib) के साथ या एक वाहन पर नियंत्रण के साथ इलाज माउस medulloblastoma कोशिकाओं की एक तुलना के माध्यम से दवा के उपचारों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया है। संस्कृति में एक सप्ताह से अधिक टुकड़ा पर सेल संख्या में वृद्धि गुना इन आंकड़ों से संकेत मिलता है और मात्रा निर्धारित रेखांकन (1 दिन पर दिन 7 / सेल नंबर पर सेल नंबर) का प्रतिनिधित्व किया था कि LDE225 बहुत डेनियंत्रण 6 की तुलना में क्रीज ट्यूमर सेल नंबर। इस आशय भी प्रतिनिधि छवियों में देखा जा सकता है (चित्रा 8) शामिल थे। हम यह भी टुकड़ा संस्कृति परख (9 चित्रा) में उगाया मानव medulloblastoma कोशिकाओं की छवियों को दिखाने के।

चित्र तीन
चित्रा 3. ब्रेन ट्यूमर / Organotypic स्लाइस सह संस्कृति परख डिजाइन। (ए) एक पी 6 माउस से organotypic बाण मस्तिष्क टुकड़ा एक अर्द्ध झरझरा झिल्ली पर सीधे रखा जाता है और मध्यम संस्कृति डिश के तल में जोड़ा जाता है। संस्कृति एक तरफ माध्यम में डूबे और दूसरी तरफ से ऑक्सीजन के लिए सुलभ है। टुकड़ा और सेल नंबर समय के साथ पीछा किया जा सकता है पर लेबल ट्यूमर कोशिकाओं मढ़ा जाता है। (बी) संस्कृति में, टुकड़ा बारीकी से vivo में मनाया कि जैसा एक ऊतक संगठन बनाए रखता है। Preservatioमस्तिष्क microenvironment के एन टुकड़ा संस्कृति के भीतर सेरिबैलम के बाहरी दाना परत (EGL) में proliferative दाना न्यूरॉन व्यापारियों की edu लेबलिंग द्वारा प्रदर्शन किया है। इस विकास मंच (पी 6) (सफेद तीर EGL इंगित करता है) पर विवो में मनाया जाएगा के रूप में टुकड़ा संस्कृति में, इन कोशिकाओं अग्रदूत, thymidine अनुरूप edu शामिल। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा ब्रेन ट्यूमर में 4. मानव Astrocytoma प्रकोष्ठों / Organotypic स्लाइस सह संस्कृति परख। टुकड़ा संस्कृति के लिए झिल्ली से ट्यूमर कोशिकाओं के पुनर्स्थानीकरण को प्रतिबिंबित कर सकते टुकड़ा पर मानव मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं में वृद्धि हुई है। (ए) के किनारे पर एक क्षेत्र दिन 1 (ऊपर) और 7 दिवस (नीचे) पर एक टुकड़ा जहां कोशिकाओं मीटर हो सकती है मस्तिष्क टुकड़ा पर झिल्ली से igrate। (बी) संभव सेल प्रवास का एक दूसरा उदाहरण के मस्तिष्क पर टुकड़ा के किनारे पर। दिन 1 (ऊपर) और 7 दिवस (नीचे)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
फ्लोरोसेंट microspheres की चित्रा 5. Microsphere नियंत्रण मोती। दिन 1 (लाल) और 7 दिवस (हरा) नियंत्रण छवियों संस्कृति में एक सप्ताह से अधिक microspheres की कोई आंदोलन प्रकट करने के लिए (पीला) मढ़ा जाता है। दिन 1 और 7 दिन छवियों टुकड़ा (स्केल बार = 45 माइक्रोन) के भीतर एक ही स्थान पर ले जाया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

> "lways चित्रा 6
ImageJ में चित्रा 6 मात्रा। (ए) एक टुकड़ा की छवि ImageJ में खोला गया था और पूरे टुकड़ा और / या क्षेत्रों मात्रा का ठहराव के लिए रेखांकित कर रहे हैं। (बी) के हित के क्षेत्र का चयन किया जाता है और एक नकली छवि बना है। (सी ) पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति छवि से बाहर घटाया जाता है। (डी) दहलीज सेल आकार और आकार के लिए निर्धारित है, गिना जाएगा निर्धारण क्या। (ई) हित के क्षेत्र के भीतर सेल संख्या गिनने के लिए कणों का विश्लेषण करें। सेल नंबर में गुना परिवर्तन तो ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र या टुकड़ा के पूरे क्षेत्र के लिए दिन 1 पर कोशिकाओं की संख्या से 7 दिन पर कोशिकाओं की संख्या से विभाजित करके गणना की जा सकती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।


चित्रा प्रसार के लिए 7. धुंधला हो जाना। छवि (पीएफए ​​में टुकड़ा फिक्सिंग के बाद) धुंधला सफलतापूर्वक संस्कृति में एक सप्ताह के बाद टुकड़ा पर कैसे किया जा सकता मिसाल है। छवि DAPInuclear धुंधला (नीला), लाल fluorescently लेबल माउस medulloblastoma कोशिकाओं, और प्रसार के लिए एक मार्कर के रूप में डीएनए में Thymidine एनालॉग के समावेश के लिए हरे रंग की लेबलिंग से पता चलता है। Edu (सफेद तीर EDU के लिए सकारात्मक कोशिकाओं को इंगित करता है और पीले तीर EDU के लिए नकारात्मक कोशिकाओं से संकेत मिलता) (स्केल बार = 50 माइक्रोन) एक सप्ताह के लिए टुकड़ा संस्कृति मीडिया (10 माइक्रोन) में शामिल किया गया था। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा।

आंकड़ा 8
8 चित्रा माउस Medulloblas Toma प्रकोष्ठों LDE225 साथ इलाज किया। यह आंकड़ा टुकड़ा ओवरले परख प्रणाली में ट्यूमर कोशिकाओं के नशीली दवाओं के उपचार को दर्शाता है। एक माउस medulloblastoma प्रयोग से एकत्र किए गए आंकड़ों के (ए) ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। DMSO के नियंत्रण हालत (सीटीएल) और LDE225 (Sonidegib) (1 माइक्रोन) (LDE) उपचार हालत थी। संस्कृति में एक सप्ताह से अधिक टुकड़ा पर सेल संख्या में वृद्धि गुना (एन = 12 सीटीएल, एन = 13 LDE, त्रुटि सलाखों = SEM)। (बी) के प्रतिनिधि, (1 दिन पर दिन 7 / सेल नंबर पर सेल नंबर) की मात्रा निर्धारित किया गया था, दिन 1 (ऊपर) और 7 दिवस (नीचे) पर वाहन नियंत्रण में इलाज स्लाइस की छवियों। (सी) LDE की छवियों प्रतिनिधि दिवस 1 (ऊपर) और 7 दिवस (नीचे) पर स्लाइस का इलाज किया। छवियाँ 4X बढ़ाई ले जाया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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ब्रेन ट्यूमर / Organotypic स्लाइस सह संस्कृति में 9. मानव medulloblastoma कोशिकाओं चित्रा। मानव medulloblastoma कोशिकाओं वाशिंगटन विश्वविद्यालय में जेम्स एम ओल्सन से प्राप्त किया गया है, और टुकड़ा संस्कृति परख में एक सप्ताह के लिए बड़े हो रहे थे। (ए) दिन 1 छवि के माउस मस्तिष्क टुकड़ा पर हो मानव medulloblastoma कोशिकाओं। (बी) संस्कृति में एक सप्ताह दिवस (7) के बाद मानव medulloblastoma कोशिकाओं के साथ ही माउस मस्तिष्क टुकड़ा की एक छवि। छवियाँ 4X बढ़ाई ले जाया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं fluorescently लेबल और एक पी 6 माउस की एक बाण मस्तिष्क खंड पर चढ़ाया और फिर संस्कृति में एक सप्ताह के लिए नजर रखी जा सकती कैसे करें। यह ब्रेन ट्यूमर / organotypic टुकड़ा सह संस्कृति परख ट्यूमर सेल नंबर पर क्षेत्रीय microenvironment के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और यह भी मानव ट्यूमर के विकास पर नई दवा उपचार के प्रभाव को मापने के लिए एक प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। पिछले अध्ययनों से तंत्रिका अग्रदूत प्रसार 7.8 पर मस्तिष्क सूक्ष्म वातावरण की भूमिका का आकलन करने के लिए एक समान रणनीति का इस्तेमाल किया है।

ब्रेन ट्यूमर कोशिकाओं को एक organotypic टुकड़ा संस्कृति 9 में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, जिसमें यह परख सामान्य सेल संस्कृति की स्थिति में प्रचार करने के लिए मुश्किल हो जाता है कि मानव मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं को उगाने के लिए एक प्रणाली प्रदान करता है। इस प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण पहलू टुकड़ा और ट्यूमर कोशिकाओं के स्वास्थ्य को बनाए रखने के महत्व है। स्लाइस डी दौरान बफर में बैठते हैं कि समय की लंबाईइमेजिंग के दौरान issection और आरटी पर स्लाइस और कोशिकाओं के रूप में संभव के रूप में स्वस्थ रहने को सुनिश्चित करने के लिए, सीमित होना चाहिए। प्राथमिक मानव मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं को इस परख में इस्तेमाल किया जा रहा है, कोशिकाओं के रूप में जल्द से जल्द बायोप्सी के बाद स्लाइस पर चढ़ाया जाना चाहिए। इसलिए स्लाइस सर्जरी से पहले तैयार किया जाना चाहिए। स्लाइस के बीच इमेजिंग समय के किसी भी अंतर प्रभाव को रोकने के लिए समय की राशि एक प्रयोग में सभी टुकड़ा संस्कृतियों के लिए छोटी और अनुरूप होना चाहिए इनक्यूबेटर से बाहर बिताया। वे समय के साथ स्थानिक लगातार निशान प्रदान के रूप में microsphere नियंत्रण महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, कारण संकोचन, फाड़, या तह करने के लिए टुकड़ा संस्कृति में विकृतियों microsphere मोतियों इमेजिंग द्वारा आसानी से स्पष्ट कर रहे हैं।

इस प्रोटोकॉल की सीमाओं में से एक कोशिकाओं ही लगभग एक सप्ताह के लिए इस टुकड़ा संस्कृति प्रणाली में प्रचारित किया जा सकता है। बहरहाल, ब्रेन ट्यूमर के कुछ प्रकार के लिए इस वर्तमान स्थिति ओ पर एक महत्वपूर्ण सुधार हैच मामलों। एक दूसरा सीमा रक्त मस्तिष्क बाधा ब्रेन ट्यूमर के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि दवाओं का मूल्यांकन करने में एक महत्वपूर्ण विचार है, जो समाप्त हो रहा है कि है। एक तीसरा विचार इस यौगिकों की एक पुस्तकालय के परीक्षण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है कि एक कम throughput परख है।

इस परख बहुमुखी और आसानी से विभिन्न ट्यूमर कोशिकाओं के प्रकार और खोजी सवालों की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया गया है। इस प्रोटोकॉल ट्यूमर सेल अस्तित्व और विकास पर उपन्यास के उपचारों के प्रभाव (सूर्य एट अल।, व्यक्तिगत संचार) की जांच के लिए एक मात्रात्मक परख के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। मस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों में ट्यूमर सेल नंबर में गुना परिवर्तन की तुलना से ट्यूमर के विकास पर microenvironment के प्रभाव का गूढ़ रहस्य के लिए एक तरीका प्रदान करता है।

यह ब्रेन ट्यूमर / organotypic टुकड़ा सह संस्कृति प्रणाली भी मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं और विशिष्ट मस्तिष्क microenvironments के बीच संबंधों की जांच करने की संभावना प्रदान करता है। माब्रेन ट्यूमर के एनवाई प्रकार के विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों और microenvironments 3,4 में विकसित करने का एक विशिष्ट स्वरूप दिखा। एक बाण माउस मस्तिष्क टुकड़ा पर लेबल मानव ट्यूमर कोशिकाओं से बढ़ रहा करके, कोशिकाओं के विकास के vivo क्षेत्र के साथ लगातार हो सकता है, जो क्षेत्रीय वरीयता के लिए नजर रखी जा सकती है। ट्यूमर कोशिकाओं को ट्यूमर कोशिकाओं के विकास का समर्थन करने वाले संभावित कारकों की पहचान करने के लिए ले जा सकता है पसंद करते हैं कि microenvironment के आगे की परीक्षा। इस परख इन विट्रो सेल संस्कृति की स्थिति में सुधार लाने में सहायता कर सकते हैं और यह भी ट्यूमर दीक्षा रोका या अधिक प्रभावी ढंग से इलाज किया जा सकता है कि कैसे अध्ययन करने के लिए एक प्रणाली प्रदान कर सकता है।

सामान्य सेल संस्कृति की स्थिति में या ओर्थोटोपिक माउस या चमड़े के नीचे xenografts द्वारा प्रचारित नहीं किया जा सकता है, जो मस्तिष्क ट्यूमर के विशिष्ट प्रकार के होते हैं। इन ट्यूमर प्रकार के लिए यह मानव ट्यूमर कोशिकाओं पर नई दवा के उपचारों का परीक्षण करने के लिए मुश्किल है। इस प्रोटोकॉल मानव मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं टुकड़ा में उगाया जा सकता है कि यह दर्शाता हैसंस्कृति परख और दवा उपचार मात्रात्मक आकलन किया जा सकता है। निम्नलिखित दवा उपचार, ट्यूमर कोशिकाओं के सह-धुंधला ट्यूमर सेल प्रसार और मार्ग निषेध पर दवा के प्रभाव के आगे मूल्यांकन प्रदान कर सकते हैं। हाल के अध्ययनों से एक 3 डी विषम सेल संस्कृति वातावरण 10 बनाम एक सामान्य monolayer सेल संस्कृति में कैंसर की कोशिकाओं पर एक दवाओं के प्रभाव के बीच एक कठोर अंतर हो सकता है कि पता चला है। इन विट्रो में एक कम उम्र की है जो इसी तरह वयस्क सामान्य और ट्यूमर उपकला कोशिकाओं, 11 अवरोध करनेवाला एक रो kinase के साथ संयोजन में fibroblast फीडर कोशिकाओं पर हो जब सशर्त एक proliferative राज्य के लिए reprogram करने के लिए दिखाया गया है। इन अध्ययनों से आगे एक organotypic, 3 डी, चिकित्सकीय प्रासंगिक microenvironment, और वर्तमान कैंसर अनुसंधान के लिए इस सेल संस्कृति प्रणाली की प्रासंगिकता में ट्यूमर कोशिकाओं को बनाए रखने के महत्व को समर्थन करते हैं। इसलिए, यह एक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक में मानव ट्यूमर कोशिकाओं पर दवाओं के परीक्षण के लिए एक मूल्यवान परख हैटी तरीके से।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Invitrogen  17504044
Glucose Invitrogen 17502048
Pennicillin Streptomycin Life Technologies 15140-122
HBSS Life Technologies 14185-052
B-27 Life Technologies 17504-044
N2 Life Technologies 17502-048
Glutamax Life Technologies 35050061
Neurobasal-A- Medium minus phenol red Invitrogen  12349015
Low Melting Point Agarose Promega V2111
Slice Culture Inserts  Milipore PICM0RG50
laminin Invitrogen 23017015
Cm-DiI  Invitrogen  V22888
EDU (Labeling and Detection)  Life Technologies c10337
Microspheres  Life Technologies F-21010
Vibratome  Leica
Confocal Microscope  Nikon Eclipse Ni C2si
ImageJ software 
5 mm Cover Glasses  Fisher Scientific 64-0700 (CS-5R)

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References

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चिकित्सा अंक 105 ट्यूमर ब्रेन Microenvironment उपचार माउस Astrocytoma स्लाइस सह संस्कृति
दवा के उपचारों ट्यूमर microenvironment अध्ययन और लक्षित के लिए एक मस्तिष्क ट्यूमर / Organotypic स्लाइस प्रणाली सह संस्कृति
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Chadwick, E. J., Yang, D. P.,… More

Chadwick, E. J., Yang, D. P., Filbin, M. G., Mazzola, E., Sun, Y., Behar, O., Pazyra-Murphy, M. F., Goumnerova, L., Ligon, K. L., Stiles, C. D., Segal, R. A. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. J. Vis. Exp. (105), e53304, doi:10.3791/53304 (2015).

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