Introduction
최근 암 연구는 뇌종양의 다양한 유전 적 변이, 분자량 변화 및 가능한 치료를 확인하는데 상당한 진보를 이루어왔다. 이 진행에도 불구하고, 뇌 종양은 성인과 어린이를위한 암 관련 사망의 상단 원인 중 하나 남아있다. 뇌 종양 연구에 제한 요인이 주 환자 샘플 및 세포주의 제한된 가용성 및 접근 실험 시스템의 고유 한 이기종 뇌 미세 복제의 어려움을들 수있다. 많은 뇌에 대해 시간이 아직 공지되지 않은 종양 세포를 유지하기 위해 필요한 조건을 종양이. 심지어 neurosphere를 같은 세포 현탁액에서 성장 될 수 뇌종양, 배양 조건은 종양 세포 1,2- 영향을 미칠 수있다. 실제로, 염기성 섬유 아세포 성장 인자 또는 표피 성장 인자의 첨가는 증식을 유도 유전자 발현을 변경시킬 수 1 분화를 억제한다. 종양 세포의 성장을 그러한 다른 방법종양 세포의 동소 또는 피하 이종 이식을 통해 마우스에서 종양 증식으로 유용한 분석법하지만 이러한 주입 연구 될 수있는 종양 발생 (특히 저급 종양), 비용 및 종양 세포의 수와 시간 등의 요인에 의해 제한된다 . 인간 뇌종양 세포를 성장시키기위한 현재의 방법은 따라서 특정 유형의 종양을 유지 불충분하고, 종종 가깝게 모방 생체 내 종양 환경 안 인공 환경을 제공한다.
뇌종양의 독특한 유형의 뇌 내에서 고도의 전문 사항 성장 [3, 4]와이 종양의 성장을위한 별개의 미세 환경의 요구 조건을 반영하는 것 같다 [5]. 이 프로토콜은 통상의 배양 조건으로 전파하기 어려운 세포의 Organotypic 뇌 미세 환경에서 성장 될 수 신규 시스템을 기술 생체 내 종양 성장 조건을 모방한다. 이 정량 분석에서, 형광 표지뇌종양 세포 청소년 마우스 뇌의 Organotypic 슬라이스에 도금 시간에 걸쳐 모니터링된다. 이 분석은 종양 성장에 미세 환경의 영향을 조사하기 위해, 그리고 임상 적으로 뇌의 미세 환경에서 새로운 약물 요법을 테스트하는데 사용될 수있다.
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Protocol
윤리 문 : 동물 과목을 포함하는 다음 절차는 건강 지침의 국립 연구소에 따라 수행하고, 다나 - 파버 암 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 사람을 대상으로 작업은 임상 시험 심사위원회 필요한 경우 모든 주제에서 얻은 동의를 통보 브리검 여성 병원과 다나 - 파버 암 연구소의 적절한 사용을위한 스탠포드 대학의위원회, 동의 요건의 적절한 면제 검토했다 최소한의 위험 연구에 얻었다.
슬라이스 문화 프로토콜의 타임 라인 :
뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공동 문화 프로토콜 1. 타임 라인을 그림. 이 그림은 모든 팔일 O 포괄 슬라이스 문화 절차의 타임 라인을 묘사실험 및 과정의 주요 단계 F. 세포가 세포를 도금하기 전에 프로 시저 일 시작의 중요성을 강조하기 위해 조각에 도금 할 때 타임 라인은 일 0에 상대적입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 해부 버퍼
- 15 mM의 HEPES (1 M), 6.5mg / ml의 포도당, 1.3 mM의 황산 (1 M), 20 밀리미터의 KCl (2 M)과 1 % 페니실린 / 1X HBSS에 스트렙토 마이신을 준비합니다.
- NaOH로 7.4으로 산도를 조정합니다.
- -20 ° C에서 필터 및 저장.
2. 슬라이스 문화 미디어
- 배지로 Neurobasal-마이너스 페놀 레드 B-27, 1 % N2 보충제, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % 루타, 1.5 ㎎ / ㎖ 글루코스 2 %를 준비한다.
- -20 ° C에서 필터 및 저장. 필요에 따라 해동, 4 ℃에서 일주 후 폐기합니다.
참고 : 다음 절차는에까지 수행 할 수 있습니다해부를 시작하기 전에 전자 날입니다. - 3 % 저 융점 아가로 오스
참고 : 다음 절차는 해부를 시작하기 전에 일일까지 수행 할 수 있습니다. - 느슨한 모자 25 초 동안 해부 버퍼, 전자 레인지의 ~ 31 ml의에 아가로 오스 0.9 g을 저 융점을 섞는다. 용융 할 때까지 전자 레인지는 확인 혼합물 오버 플로우하지 않습니다.
- 필요할 때까지 55 ~ 65 ℃에서 보관하십시오.
참고 : 다음 절차는 해부를 시작하기 전에 일일까지 수행 할 수 있습니다.
4. 코트 라미닌과 슬라이스 문화 삽입
참고 : 다음 절차는 해부를 시작하기 전에 일일까지 수행 할 수 있습니다.
- 조직 배양 후드에서 무균 핀셋을 사용하여 6 웰 플레이트의 각 웰에 한 조각 배양 삽입물을 배치 (만약 획득하려는 슬라이스의 수와 일치하는 약 12는 하나의 과정에서 수집 될 수있다. 다음의 절차를 위해 작성 여섯 조각). 15 ML 원뿔 (T)를 작성 1X PBS와 우베 (800 μL / 삽입) 및 라미닌 (10 μg의 / ㎖)를 추가합니다.
- 각 슬라이스 문화 삽입의 상단에 라미닌 혼합물의 800 μl를 추가합니다. 필요할 때까지 37 ° C에서 품어.
해부 5. 준비
- 슬라이스 배양 배지 1200 μL로 6 웰 플레이트의 각 웰을 채운다. 1200 μL PBS로 사용하지 않는 우물을 입력하고 PBS 1X 5 mL로 판의 중심 공간을 채우기. 37 ° C에서이 판을 보관하십시오.
- 70 % 에탄올로 절개 도구가 소독. 기름을 제거하고 사용하기 전에 소독 아세톤으로 vibratome 블레이드를 닦아냅니다.
- 세 35mm 2 요리와 후드에 5 ~ 10 cm2로 조직 배양 접시를 놓습니다. 얼음 해부 버퍼와 장소 하나 10cm 2 접시를 채우십시오.
참고 : 프로세스는 한번에 하나의 새끼.
6. 해부
참고 : 프로세스는 한번에 하나의 새끼.
ES / ftp_upload / 53304 / 53304fig2.jpg "/>
그림 2. 해부 인하. 이러한 이미지는 P6 마우스의 뇌에서 두개골을 제거하는 데 필요한 해부 컷을 보여줍니다. 인하는 점선으로 표시됩니다. (A) (1)가 표시됩니다 잘라. 컷 1, 2 좌우 양쪽 눈의 소켓에 접속 뇌간 / 후방 ... (B) (3, 4)가 도시되어 인하 만들어진다. 3은 1과 2 컷 4 컷 3의 중간 선에서 시작하여 후각 전구의 두개골 (스케일 바 = 4.4 mm)를 나누어 코.의 끝을 향해 계속 다른 연결 인하 한 눈 소켓에서 이루어집니다 잘라 주십시오 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 노광 이소 플루 란 (100 % 이소 플루 란)를 사용 P6 마우스를 마취. 약 5 분 후에 느려진다 호흡이나 호흡의 흔적이없는 경우, 신속을 참살날카로운 가위로 마우스. 조직 배양 접시에 70 % 에탄올과 장소 머리를 스프레이.
- 사용하여 큰 무딘 집게 코를 잡아 꾸준한 머리를 잡아. 중간 크기의 해부 가위를 사용하여 두개골을 공개하는 여분의 피부를 제거합니다.
- 눈 소켓에 상처를 연결, 양쪽의 앞쪽으로 두개골의 뒤쪽에서, 양자 두개골을 절단하여 절단 1과 2를 확인합니다. 조직 손상을 피하기 위해 가능한 한 가깝게 두개골 위의 끝을 유지한다.
- 컷 3, 인하 (1)를 연결하는 작은 봄 가위를 사용하여 2. 그런 다음 부드럽게 두개골을 벗겨 작은 무딘 집게를 사용합니다.
- 작은 봄 가위를 사용하여 조심스럽게 남아있는 두개골이 절반이되도록, 상단의 중간 선을 따라 남아있는 두개골을 잘라 (그림 2 # 잘라 4). 사용 포셉은 두 개의 후각 전구를 공개 두개골을 벗겨.
- 편평한 주걱 삽입 (해부 버퍼 적신를, 그래서 조직은 그것에 충실하지 않을 것이다) (B) 사이에뇌와 두개골의 기지 ottom 부드럽게 뇌를 제거하고 얼음에 해부 버퍼를 포함하는 접시에 놓습니다.
- 공격 태도를 보여준 두 번째 뇌를 얻기 위해 6 단계를 반복
7. 아가로 오스의 두뇌를 포함하기
- 얼음에 열려 35mm 2 요리 두 가지를 놓고 70 % 에탄올로 큰 무딘 포셉 한 쌍을 닦아.
- 위에 돔이 형성 될 때까지 두 개의 접시로 (3 단계에서 제조 됨)을 3 % 저 융점 아가로 오스를 붓는다. 3 분 동안 타이머를 설정합니다. 3 분에서 아가로 오스 가득 35mm 접시의 측면에 무딘 집게와 장소 하나의 뇌를 데리러 (아가로 오스의 중합을 관찰 할 수있는 경우, 아가로 오스 가득한 돔의 테두리를 터치하여 테스트, 그것을 준비), 다음 이동 접시의 센터로 (더 나은 마운트 있도록이 뇌 주위 초과 해부 버퍼를 제거합니다).
- 2 차 뇌에 대해 반복합니다. 10 분 동안 타이머를 시작합니다.
- 10 분후, 사이 공간으로 평평한 주걱 삽입아가로 오스와 요리 P6 뇌를 포함하는 중합 아가로 오스를 팝업합니다.
- 가장자리가 가능한 똑바로되어 있는지 확인하고, 뇌 주위 큐브에 아가로 오스를 트리밍 플랫 면도날을 사용합니다.
- 두 스트립에 vibratome 접시에 순간 접착제를 놓습니다. 그런 다음, 아가로 오스 장착 뇌를 선택하고 부드럽게 시상 조각에 대한 위치 접착제 위에 내려 놓습니다. 다른 뇌에 대해 동일한 작업을 수행합니다. 모두 뇌가 서로 줄 지어되어 있는지 확인하십시오.
- 5-8 분 동안 실온에서 접착제 건조하자. 이 기간 동안, 얼음 조각 물과 vibratome의 얼음 홀더 영역을 채 웁니다.
8. Vibratome으로 조각화
- 제자리에 고정 할 수있는 권리에 탭을 이동, 얼음 홀더 영역으로 절단 저수지를 놓습니다.
- 원형 헤드 나사 드라이버를 사용하여, 거기에 붙어 두뇌와 원형 vibratome 판을 선택하고 저수지로 적합. 스크류 드라이버를 제거하고 차와 장소에 플레이트를 고정전자 육각 머리 나사 드라이버. 플레이트와 절단 저수지가 고정되어 있는지 확인합니다.
- 사용 집게는, 픽업 vibratome 블레이드, 육각 나사 드라이버와 장소에 커팅 헤드, 잠금 장치로 적합. 그런 다음, 둥근 나사로 vibratome에 부착 블레이드와 절삭 헤드를 고정.
- 확인하는 동안 면도기 (바로 위 또는) 같은 높이에있다, 머리를 가능한 한 아가로 오스 - 임베디드 두뇌에 가까운에 면도기의 위치를 가져 오십시오. 블레이드를 충당하기 위해 충분히 차가운 해부 버퍼 챔버를 입력합니다.
- 를 눌러 ↕ 버튼을 한 번 (당신이 날이 앞뒤로 갈 때이 버튼의 경계를 정의가 깜박 볼 수), 다음 Enter 키를 눌러 및 면도기는 아가로 오스 블록을 빠져 나올 때까지 수동으로 포함 된 뇌, 릴리스를 잘라 "앞으로"를 개최합니다. 바로이 자동 절단 범위의 끝을 정의하는 것, 다시 ↕ 버튼을 누릅니다.
- 한 번 "SINGLE / CONT"버튼과 L을 눌러연속으로 ight는 계속해야한다. 트리밍 설정 될 것 4.이에 5.5-6에 주파수, 속도 진동, 400 ~ 450 μm의 절단 두께를 설정합니다.
- 한 번 "시작 / 정지"버튼을 누르면, 자동 절단 시작해야한다. 를 눌러 "일시 중지"필요에 따라 구멍에 숟가락을 사용하여 조직을 수집합니다. 그것은 중간 선에 가까이 도달하기 위해, 약 5 ~ 10 분 소요됩니다. 이 시점에서, 언론은 "일시 중지"및 3에 속도를 변경하고 200 μm의 두께를 변경합니다. 이 변경 한 후 생성 된 첫 번째 슬라이스를 수집하지 마십시오.
- 200 μm의 두께의 원하는 조각은 소뇌를 통해 후각 망울은 잘 정의해야합니다. 그들은 얼음 해부 버퍼 가득 6 웰 플레이트로 절단으로 원하는 각 조각을 전송합니다. , 가능한 한 작은 감동, 조각을 떠가 슬롯 스푼을 통해 정면으로 때 버퍼 빼 내십시오 조직 주위에 슬라이스 챔버에서 버퍼를 이동하여이 작업을 수행합니다. 일반적으로 약 1원하는 구조와 2 조각을 수집 할 수 있습니다. 슬라이스는 최대 20 분 동안 얼음 위에서 완충액 해부에 남아있을 수있다.
- 조각 얼음에있는 동안, 삽입이 37 ° C 배양기에서 라미닌으로 코팅 된 6 웰 플레이트를 꺼내. 해부 후드에 삽입 손상되지 라미닌 복용주의를 폐기합니다. 각 삽입의 상단에 슬라이스 문화 매체의 3.5 ML을 추가합니다. 미디어의 정상은 우물에 쏟아져없이 돔 모양을 형성 할 것이다.
9. 도금 삽입 위에 조각
- 슬롯 숟가락 도구를 사용하여 부드럽게 슬라이스가 완전히 침수 될 밀어 삽입에 미디어에 뇌 조각을 배치합니다. 모든 조각에 대해 반복합니다.
- 인서트의 상부에서 슬라이스 배양 배지 1 ㎖를 끌어와 웰의 바닥에 그것을 분배하도록 P1000을 사용한다. 제거하고 뇌 주변의 아가로 오스의 가장자리를 볼 수 slicebecome까지 초과 용지를 폐기합니다. 나머지 조각에 대해이 작업을 수행합니다.
- T 픽업그는 집게, 틸트와 RIM의 삽입 및 초과 용지를 제거합니다. 그 후, 신속하게 슬라이스 배양 배지 1 ㎖를 함유하는 2 35mm 접시에 삽입 옮긴다. 스트레칭 / 손상 슬라이스 또는 아가로 오스의 매우 가장자리에 눈물을 할 경우, 아가로 오스에서 떨어져 당겨 쉬운 (막에 구멍을 찌르지 않도록주의하면서, 조직의 주위에 아가로 오스를 제거하기 위해 날카로운 집게 2 쌍을 사용 양쪽). 그런 다음 다시 6 웰 플레이트에 삽입을 이동하고 나머지 조각에 대해 반복합니다.
- 송풍기 오프와 조직 문화 후드에서 (건조에서 슬라이스를 방지하기 위해) 각 막에서 아가로 오스 조각을 제거합니다.
- 단계 5.1에서 제조 된 6 웰 플레이트에 슬라이스를 전송하고 37 ° C에서 접시를 저장합니다. 24 ~ 48 시간 동안 조각을 품어.
10. 슬라이스 문화 미디어 변경
- 신선한 6 잘 플레이트 단계를 반복 5.1.
- 송풍기 오프와 조직 문화 후드에서 계속 새로운 6 웰 플레이트에 삽입을 전송신선한 슬라이스 매체를 aining.
슬라이스 11. 도금 종양 세포
- 2 분 동안 중간 속도에 CM-DII 염료와 스핀을 sonicate하세요.
- 스핀 다운 종양 세포를 5 분 동안 201 XG에 오버레이 사용되고. 이어서 슬라이스 배양 배지 2 ㎖에 재현 탁.
- 세포와 미디어의 2 ml의에 CM-DII의 7 μl를 추가하고 20 분 동안 37 ° C에서 품어.
- 슬라이스 매체의 200 μL에 5 분 및 재현 탁 201 XG에 세포를 스핀 다운. 씹다 부드럽게 (10 ~ 20 번 또는 펠렛이 사라 때까지) 세포를 해리하고 1,000 μl의 총 부피를 만들기 위해 미디어를 슬라이스 800 μl를 추가합니다.
- 트리 판 블루를 사용하여 가능한 종양 세포를 계산합니다. 세포와 동일한 농도에서 종양 세포에 녹색 형광 미립자를 추가한다. 이 불활성 미소는 제어 될 것입니다. 5 분 슬라이스 문화 미디어의 원하는 금액에 재현 탁 201 XG에서 세포 / 마이크로 스피어 혼합물을 스핀 다운. 6000 세포의 밀도로 접시 세포 / SL65 μL 볼륨에서 얼음. 슬라이스 당 도금 셀의 개수는 환경 및 가용성에 따라 증가 될 수있다.
- 조직 배양 후드에서 조각의 중심에 미디어 / 슬라이스의 65 μL의 셀을 분배.
(12) 이미징 및 수정
참고 : 니콘 이클립스 니켈 C2si을 공 초점 빨간색과 녹색 형광 채널 4 배에서 전체 시상 조각의 큰 이미지 스캔을하는 데 사용 된 수직입니다. 스캔 기능을 사용할 수없는 경우, 슬라이스에 걸쳐 다수의 이미지를 순차적으로 받아 이상 (미소 구의 위치와 탐색 조각의 에지 사용) 포토샵 함께 이미지를 만들기.
- 다음 날 (1 일 영상은), 1 ml의 슬라이스 문화 매체와 여섯 35mm 2 요리로 조각을 전송합니다. 이미지 형광 직립 현미경에 한 번에 각 슬라이스 하나. 빨간색과 녹색 형광 채널 4 배에서 전체 시상 조각의 큰 이미지 스캔하십시오. 레이저를 유지이득은 각 슬라이스에 대한 동일한 설정. 촬영이 끝나면 다시 신선한 슬라이스 매체를 함유 6- 웰 플레이트에 모든 슬라이스 옮긴다.
- EDU 다른 증식 마커 또는 약물의 첨가 조건을 원하는 경우, 처리 조건에 대해 매일 미디어 변경에 사용되는 약물로 슬라이스 미디어 콘텐츠를 생성한다. 처리 조건은 (직접 1 일 촬영 후) 단계 12.1 도입해야한다. 모든 EDU 또는 증식 마커는 미디어도 12.1에서 시작에 추가 (10 μM에서 EDU를 사용) 매일 갱신되어야한다.
- 이미지는 다시 7 일에의 날 (1) 이미지를 동일한 설정을 사용하여.
- 일 7 촬상이 완료된 후, 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 각 웰에 1.2 ㎖로 함유하는 6- 웰 플레이트에 각 슬라이스를 이동. 조심스럽게 천천히 각 조각의 상단에 PFA의 추가 1 ml에 놓습니다. 1 시간 동안 실온에서 둡니다.
- 각 우물에서 각 조각의 상단에서 PFA를 제거합니다. PBS로 각 웰 배를 씻으십시오. 에 PBS에서 조각을 저장염색 또는 슬라이드에 장착 4 ° C를.
주 : ImageJ에 설정하고 현미경 이미지 품질뿐만 아니라 종양 세포의 크기를 고려하도록 조정되고 최적화 될 필요가있다.
이미지 13. 정량 (ImageJ에 사용)
주 : ImageJ에 설정하고 현미경 이미지 품질뿐만 아니라 종양 세포의 크기를 고려하도록 조정되고 최적화 될 필요가있다.
- ImageJ에에서, 전체 슬라이스 또는 정량화 할 영역을 대략적으로 다각형 도구를 사용합니다. 당신이 그것을 이름을 변경하고 저장할 수 있습니다 투자 수익 (ROI) 관리자에게이 선택을 추가합니다.
- 마우스 오른쪽 버튼으로 선택 영역을 클릭하고 복제를 선택합니다. 지역, 슬라이스, 일이 중복 이미지 이름을 지정합니다. 를 눌러 FET의 + 시프트 + E는 선택 프로세스 개요를 보여 - 빼기 배경 - 롤링 볼 반경 = 4.
- 배경 공제 한 후, 선택 "이미지"드롭 다운 메뉴에서 "임계 값을 조정합니다." 어두운 배경을 확인합니다 -; 확대 이미지를보고 임계 값을 설정합니다. 만약 임계 바를 이동하여 임계 값을 설정 한대로, 모든 셀 / 포함 강조하지만 (또는 셀보다 더 작은) 파편이다 매우 작은 도트가 포함되지 않은되도록. 모든 이미지에 대해 동일한 임계 값을 사용합니다. 옆에 임계 창을 이동합니다.
- 분할 입자로 미리 포인트 선택, 출력 유형, 낮은 임계 값을 초과, 에지 최대 제외 : "맥시마 찾기"5와 10 사이의 잡음 내성을 설정하고 다음을 확인 - "프로세스"를 선택합니다. 그리고 FET의 + 시프트 + E를 눌러 관심 영역을 다시 선택합니다.
- 분석 드롭 다운 메뉴에서 "입자를 분석"을 선택합니다. 4-40에 픽셀 크기와 0.00-1.00에 원형을 설정합니다. 또한 "쇼 오버레이 개요" "결과 표시를 클릭"과 "다음 OK를 누릅니다"요약한다.
- 모든 원시 데이터와 마이크로 소프트 오피스 문서의 요약을 기록합니다. 각 지역의 난에 대해 "개수"문화의 주 이상 배의 변화를 계산하는 데 필요한 s의.
- 임계 값 및 기타 설정이 일관성을 유지해야하고, 모든 이미지와 관심 분야에 대해이 과정을 반복합니다.
- 마찬가지로, 1 일째에 슬라이스에 셀의 수에 의해 7 일째 슬라이스에 종양 세포의 수를 나누어 배양 주 동안 슬라이스 세포 수의 배 변화를 계산하는 각각의 영역 내에서 세포 수의 변화를 접어 제 1 일에 그 영역에 세포의 수에 의해 제 7 일에 해당 영역에 셀의 수를 나눔으로써 계산된다.
- 뿐만 아니라 마이크로위한 단계 13.8를 수행합니다. 슬라이스에 마이크로 스피어 번호는 1 일 (= 1로 변경 배)에 같은 날 7에서 동일해야합니다. 마찬가지로, 각 지역 내에서 마이크로 스피어 번호는 1 일 (= 1로 변경 배)에 같은 날 7에서 동일해야합니다. 폴드 변경 1과 다른 경우,이 시간이 지남에 슬라이스 지형의 변화를 나타냅니다.
(14) 염색
- 테이프 일에 파라 필름의 조각전자 실험실 벤치와 (조각의 크기보다 단지 더 큰 각 슬라이스 하나) 액체 차단 아빠 펜으로 여섯 원을 그립니다. 각 원의 중간 점에 PBS의 약 400 μl를 놓습니다. 번호는 각 슬라이스를 식별하는 원 또는 라벨.
- PBS 1 ㎖에, 슬라이스 주위 막의 일부 공간을 남기고, 슬라이스 주위 사각형 잘라 면도날을 사용한다. 집게가 첫 번째 원형으로 잘라 슬라이스를 이동하고 조심스럽게 PBS의 거품 위에 슬라이스를 배치하여. 이 조각 자체에 이상 접어하지 않거나 거꾸로이 과정에서 이성을 상실 얻을 있는지 확인하는 것이 필수적입니다. 그런 다음, 슬라이스 아래에서 PBS를 제거하고 슬라이스의 상단에 넣어가 잠긴 상태로 유지됩니다 있는지 확인하기 위해 필요한 경우 더 PBS를 추가 할 수 있습니다. 각 슬라이스에 대해이 단계를 반복합니다.
- PBS에서 3 % BSA의 10 mL로한다. 2 ml의를 가지고, 그것에 디기 토닌의 100 μl를 추가합니다. 혼합하고, 실온에서 30 분을 차단하고 Permeabilize 하시려면 위해 조각을 추가 할 수 있습니다.
참고 사항 : 트라이와 같은 다른 투과성으로 에이전트의 사용톤 X-100은 CM-DII 라벨의 손실됩니다. - 투과성으로 / 차단 솔루션을 제거하고 10 분 동안 PBS로 3 배 씻어.
- EDU에 대한 염색 경우, 혼합물을 조립 키트가 제공하는 지침을 따르십시오. 45 분 동안 혼합물을 적용합니다. 다른 항체로 염색하는 경우, 프로토콜은 일차 및 이차 항체의 농도 (~ 초등 1 열연 RT)에 대해 최적화되어야한다. 10 분 동안 PBS로 3 배를 씻어.
- PBS에서 1000 5 분 RT 용 : DAPI 1 얼룩. PBS로 2 배를 씻어.
15. 조각 실장
- 현미경 슬라이드에 슬라이스를 전송합니다. 슬라이스 멤브레인의면이 위를 향하게 남아 있고, 그 자체에 이상 접하지 않습니다 있는지 확인하십시오. 액체 차단제 아빠 펜으로 조각 주위에 테두리를 그립니다.
- 슬라이스의 각 측면에 작은 유리 커버 슬립 (5mm)를 배치했다 (손상되는 슬라이스를 유지). 위에 (면역에 대한) Fluoromount-G의 두 세 방울을 드롭슬라이스는 겨우 그것을 커버한다. 그런 다음 조각 긴 커버 슬립 (24 × 50 mm)를 커버한다.
- 각각의 조각에 대해 반복합니다. 4 ° C에서 매니큐어 및 저장과 슬라이드의 가장자리를 밀봉합니다. 염색의 공 초점 이미징 작업을 수행합니다.
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Representative Results
이 절 결과의 종류가 지역 미세 환경을 조사 할뿐만 아니라 새로운 치료법을 테스트 뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공동 배양을 이용하여 예상 될 예시한다. 우리는 세이 조직으로서 조직, 뇌 종양 미세 환경을 복제 할 수 있도록 설계되어 슬라이스의 증식 상태는 (도 3)로 유지되는 것을 보여준다. 우리는 또한 시간이 지남에 따라 슬라이스 종양 세포 수의 증가는 부분적 뇌 조각 위에 미세 세포의 이동 (도 4)에 기인 할 수 있음을 입증한다. 우리는 또한 조각의 특정 지역에 대한 문화의 주 이상 세포 수의 배의 변화를 계산하여이 공동 문화는 정량적 인 분석으로 사용될 수 있음을 보여 주었다, 또는 전체 뇌 슬라이스 (그림 6) 복수의 예비 결과 종양 세포 유형의 종양 세포의 수의 공 초점 화상에 의해 정량화 될 수 있음을 보여 주었다세포만을 슬라이스로 20-50 ㎛의 깊이로 이동한다는 사실에 기인 200 μm의 두께 슬라이스.
우리는 그들이 문화의 시간에 걸쳐 수에는 이동이나 변화를 보여 없기 때문에 녹색 형광 마이크로 (그림 5) 슬라이스 지형의 변화에 대한 효과적인 제어를 것을 발견했다. 공 배양을 고정 후, 염색은 종양의 뇌 미세 세포 및 종양 세포 증식, 세포 사멸, 또는 단백질 발현의 변화에 대한 약물의 효과 (도 7)을 검사 할 수있다. 우리는이 분석은 SMO (평활화) 길항제 LDE225 (Sonidegib) 또는 차량 제어 처리 마우스 모세포종 세포의 비교를 통해 약물 치료를 테스트하는데 사용될 수 있다는 것을 증명하고있다. 문화 일주를 통해 슬라이스에 세포 수의 증가를 접어 이러한 데이터를 나타내는 계량 및 그래픽 (1 일에서 7 일 / 휴대폰 번호에 휴대폰 번호)를 표시 한 것 LDE225 크게 드제어부 (6)에 비해 종양 세포 주름 번호. 이 효과는 또한 대표 이미지에서 볼 수있다 (그림 8)를 포함. 또한 슬라이스 배양 분석 (도 9)에서 자란 인간 모세포종 세포의 이미지를 나타낸다.
그림 3. 뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공동 문화 분석 디자인. (A) P6 마우스에서의 Organotypic 시상 뇌 조각은 반 다공성 막에 직접 배치하고, 매체는 배양 접시의 바닥에 추가됩니다. 배양은 일측에 매체 중에 침지하고, 다른 측면에서 산소가 액세스된다. 슬라이스와 세포 수는 시간이 지남에 따라 할 수 있습니다에 레이블이 종양 세포가 중첩되어있다. (B) 문화에서, 슬라이스는 밀접하게 생체 내에서 관찰 된 것으로 유사한 조직의 조직을 유지합니다. Preservatio뇌의 미세 환경의 N은 슬라이스 문화 내에서 소뇌의 외부 과립 층 (EGL)의 증식 과립 신경 세포 전구체의 에듀 라벨에 의해 증명된다. 이 발달 단계 (P6) (흰색 화살표가 EGL을 나타냅니다)에서 생체 내에서 관찰되는 바와 같이 슬라이스 문화에서, 이러한 전구 세포가, 티미 딘 아날로그 에듀를 통합합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 뇌종양 4. 인간 성상 세포종 세포 / Organotypic 슬라이스 공 배양 분석법. 슬라이스 문화 막에서 종양 세포의 relocalization을 반영 슬라이스 인간 뇌종양 세포에서 증가했다. (A)의 가장자리 영역 1 일 (위)과 7 일 (하단)에 조각 세포가 M 월 뇌 슬라이스 상 막으로부터 igrate. (B) 가능한 세포 이동의 제 2 예를 뇌에 슬라이스의 가장자리. 1 일 (위)과 7 일 (아래). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
형광 마이크로 그림 5. 마이크로 스피어 제어 구슬. 1 일 (적색)과 7 일 (녹색) 제어 이미지는 문화에 일주일 동안 미소의 어떤 움직임을 표시하지 않으려면 (노란색) 중첩된다. 1 일 및 7 일 이미지가 슬라이스 (스케일 바 = 45 μm의) 내에서 같은 위치에서 촬영되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ImageJ에도 6 부량. (A) 조각의 영상은 ImageJ에 오픈 및 전체 조각 및 / 또는 영역은 정량 약술된다. (B)의 관심 영역이 선택되고, 복사 영상이 이루어진다된다. (C ) 배경 형광 이미지로부터 감산된다. (D) 임계 값이 셀 크기 및 형상 설정되어, 계산 될지 결정하는 단계를 포함한다. (E) 관심 영역 내의 세포 수를 계산하기 위해 입자를 분석한다. 세포 수에서의 배 변화 후 관심있는 각각의 영역 또는 슬라이스의 전체 면적에 대한 제 1 일에 세포 수에 의해 7 일째 세포 수를 나눔으로써 계산 될 수있다. 이 도면의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하세요 .
그림 확산 7. 염색. 이미지 (PFA에서 슬라이스를 고정 후) 염색이 성공적으로 문화 일주 후 슬라이스에서 수행 할 수있는 방법을 예시한다. 이미지 DAPInuclear 염색 (파란색), 적색 형광 표지 된 마우스 모세포종 세포 증식 마커로 DNA로 티미 딘 아날로그의 결합을위한 녹색 라벨을 보여줍니다. EDU (흰색 화살표 EDU 양성 세포를 나타내고, 노란색 화살표가 EDU에 대한 부정적인 세포 표시) (스케일 바 = 50 μm의) 일주에 대한 슬라이스 문화 미디어 (10 μM)에 포함되었다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.
그림 8. 마우스 Medulloblas 토마 세포 LDE225로 처리 하였다. 이 도면은 슬라이스 오버레이 분석 시스템에서 종양 세포의 약물 치료를 보여준다. 모세포종 마우스 실험에서 수집 된 데이터 (A) 그래픽 표시. DMSO는 제어 조건 (CTL) 및 LDE225 (Sonidegib) (1 μM) (LDE) 처리 조건이었다. 문화 일주를 통해 슬라이스에 세포 수의 증가를 접어은 (N = 12 CTL, N = 13 LDE, 오류 바 = SEM). (B) 대표, (1 일에서 7 일 / 휴대폰 번호에 휴대폰 번호)를 정량 하였다 1 일 (위)과 7 일 (하단)의 차량 제어 처리 조각의 이미지. (C) LDE의 대표 이미지는 1 일 (위)과 7 일 (하단)에 조각을 처리 하였다. 이미지는 4 배의 배율로 촬영되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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뇌종양 / Organotypic 슬라이스가 공동 문화 9. 인간의 Medulloblastoma의 세포 그림. 인간 모세포종 세포는 워싱턴 대학의 제임스 M. 올슨로부터 획득하고, 슬라이스 배양 분석에서 일주일 동안 배양 하였다. (A) 주 1 화상을 마우스 뇌 조각에 성장 인간 모세포종 세포. (B) 문화 일주 (7 일) 후 인간 모세포종 세포와 같은 마우스의 뇌 조각의 이미지입니다. 이미지는 4 배의 배율로 촬영되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 뇌 종양 세포가 형광 표지 및 P6 마우스의 시상 뇌 부분에 도금 한 후 문화에 일주일 동안 모니터링 할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이 뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공동 배양 분석은 종양 세포 수의 지역 미세 환경의 영향을 결정하기 위해 사용될 수 있으며, 인간 종양의 성장에 대한 새로운 약물 치료의 효능을 측정하기위한 시스템으로 사용될 수있다. 이전의 연구는 신경 전구 증식 7,8에서 뇌 미세 환경의 역할을 평가하기 위해 동일한 전략을 이용했다.
뇌종양 세포 Organotypic 슬라이스 배양 9에 접종하는 상기 분석은 정상적인 세포 배양 조건에서 번식하기 어려운 인간 뇌종양 세포를 성장시키기위한 시스템을 제공한다. 이 절차의 하나의 중요한 측면은 슬라이스와 종양 세포의 건강 유지의 중요성이다. 슬라이스는 D시 버퍼에 앉아 시간의 길이이미징 동안 issection 및 실온에서는 슬라이스와 세포가 가능한 한 건강하게 유지하려면, 제한되어야한다. 일차 인간 뇌종양 세포는이 분석에 사용되는 경우, 세포는 가능한 빨리 생검 후 슬라이스에 플레이 팅한다. 따라서 슬라이스는 수술 전에 준비를해야합니다. 슬라이스 중에서 촬상 시간 중 어느 차동 효과를 방지하기 위해, 시간은 실험에서 모든 슬라이스 배양 용 짧고 일관되어야 인큐베이터에서 보냈다. 그들은 시간이 지남에 따라 공간적으로 일관된 부호를 제공하기 때문에 미세 제어가 중요하다. 또한, 인해 수축, 찢어, 또는 접는에 슬라이스 문화의 왜곡은 마이크로 스피어 비드 이미징에 의해 쉽게 알 수 있습니다.
이 프로토콜의 제한 중 하나는 세포가 약 1 주일 만이 슬라이스 배양 시스템으로 전파 될 수 있다는 것이다. 그럼에도 불구하고, 뇌종양의 일부 유형이 현재 상태 O 비해 상당한 개선이다F 문제. 두 번째 제한은 혈액 - 뇌 장벽 뇌종양의 치료에 이용 될 수있는 약물을 평가하는 중요한 고려 사항이되는, 제거된다는 것이다. 세 번째 고려 사항은이 화합물의 라이브러리를 시험하기 위해 사용될 수 없다 낮은 처리량 분석 점이다.
이 분석은 다양하고 쉽게 다른 종양 세포의 종류 및 조사의 질문에 대한 다양한 연구를 수정된다. 이 프로토콜은 종양 세포의 생존 및 성장에 대한 새로운 치료의 효과 (일 등., 개인 통신)을 조사하는 정량적 분석법으로 사용될 수있다. 뇌의 특정 영역에있는 종양 세포 수의 배 변화 비교는 종양 성장에 미세 환경의 영향을 해독하기위한 방법을 제공한다.
이 뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공 배양 시스템은 뇌종양 세포 및 뇌의 특정 미세 환경과의 관계를 조사 할 수있는 가능성을 제공한다. 엄마뇌종양 NY 유형은 특정 뇌 영역과 3,4- 미세 환경에서의 개발을 구별를 나타낸다. 시상 마우스 뇌 슬라이스 표지 인간 종양 세포를 성장시켜, 세포의 성장을 생체 내 영역과 일치 할 수있다 지역 환경에 대해 모니터 할 수있다. 종양 세포는 종양 세포의 성장을 지원하는 전위 인자의 동정으로 이어질 수 선호 미세 환경의 추가적인 시험. 이 분석은 시험 관내 세포 배양 조건 개선에 도움이 될 수 있으며 종양의 개시가 방지되거나보다 효과적으로 처리 할 수있는 방법을 연구 할 수있는 시스템을 제공 할 수있다.
정상적인 세포 배양 조건에서 동소 또는 마우스 또는 피하 이종 이식에 의해 전달 될 수없는 뇌종양의 특정 유형이있다. 이러한 유형의 종양 대 인간 종양 세포에 대한 새로운 약물 요법을 시험하는 것은 곤란하다. 이 프로토콜은 인간 뇌종양 세포 슬라이스에 성장 될 수 있음을 보여문화 분석 및 약물 치료를 정량적으로 평가 될 수있다. 다음 약물 치료, 종양 세포의 공동 - 염색은 종양 세포 증식 억제 및 통로에 약물의 효과의 추가 평가를 제공 할 수있다. 최근 연구는 3D 이종 세포 배양 환경을 10 대 정상 세포 단층 배양 암세포에 대한 약물의 효과 사이의 급격한 차이가있을 수 있음을 보여 주었다. 시험관 내에서 수명이 짧은 마찬가지로 성인 정상 및 종양 상피 세포를, 11 저해제 Rho 키나아제와 조합하여 섬유 아세포를 피더 세포 성장시 조건부로 증식 상태로 재 프로그래밍하는 것으로 나타났다. 이러한 연구들은 상기의 Organotypic, 3D, 임상 적 미세 환경, 및 현재 암 연구에이 세포 배양 시스템의 관련성에 종양 세포를 유지하는 것의 중요성을지지한다. 따라서, 이는 임상 relevan 인간 종양 세포에 약물을 시험하기위한 유용한 분석은T 방식.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Invitrogen | 17504044 | |
| Glucose | Invitrogen | 17502048 | |
| Pennicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Neurobasal-A- Medium minus phenol red | Invitrogen | 12349015 | |
| Low Melting Point Agarose | Promega | V2111 | |
| Slice Culture Inserts | Milipore | PICM0RG50 | |
| laminin | Invitrogen | 23017015 | |
| Cm-DiI | Invitrogen | V22888 | |
| EDU (Labeling and Detection) | Life Technologies | c10337 | |
| Microspheres | Life Technologies | F-21010 | |
| Vibratome | Leica | ||
| Confocal Microscope | Nikon Eclipse Ni C2si | ||
| ImageJ software | |||
| 5 mm Cover Glasses | Fisher Scientific | 64-0700 (CS-5R) |
References
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