Introduction
La investigación reciente cáncer ha hecho avances significativos en la identificación de mutaciones genéticas, cambios moleculares y posibles tratamientos para una variedad de tumores cerebrales. A pesar de este progreso, los tumores cerebrales siguen siendo una de las principales causas de la mortalidad relacionada con el cáncer para adultos y niños. Los factores limitantes en la investigación tumor cerebral incluyen la disponibilidad limitada de muestras de pacientes primarios y líneas celulares y la dificultad en replicar el microambiente cerebro única y heterogénea en sistemas experimentales accesibles. Para muchos tumores cerebrales las condiciones necesarias para mantener las células tumorales con el tiempo aún no se conocen. Incluso para los tumores cerebrales que pueden ser cultivadas en suspensión celular como neuroesferas, condiciones de cultivo pueden afectar a las células del tumor 1,2. De hecho, la adición de factor básico de crecimiento de fibroblastos o factor de crecimiento epidérmico para fomentar la proliferación y diferenciación puede inhibir alterar la expresión génica 1. Otros métodos para crecimiento de células tumorales talescomo la propagación del tumor en ratones a través de xenoinjerto ortotópico o subcutánea de células tumorales son ensayos valiosos, pero están limitadas por factores tales como el tiempo de desarrollo de tumores (especialmente para los tumores de bajo grado), el costo y el número de células tumorales que se puede inyectar y estudió . Por lo tanto los métodos actuales para el crecimiento de las células tumorales del cerebro humano son inadecuados para el mantenimiento de ciertos tipos de tumores, ya menudo proporcionan ambientes artificiales que no lo hacen muy de cerca en vivo entornos tumorales imitan.
Distintos tipos de tumores cerebrales pediátricos crecen en lugares altamente especializados en el cerebro [3, 4] y esto es probable que refleje los requisitos microambientales diferentes para el crecimiento del tumor [5]. Este protocolo describe un novedoso sistema donde las células que son difíciles de propagar en condiciones de cultivo normales se pueden cultivar en un microambiente de cerebro organotípicos que imita en condiciones de crecimiento tumoral in vivo. En este ensayo cuantitativo, marcada con fluorescencialas células tumorales del cerebro se sembraron en juveniles rebanadas organotípicos de cerebro de ratón y monitoreados a través del tiempo. Este ensayo se puede utilizar para investigar el efecto de microambiente sobre el crecimiento tumoral, y para probar nuevas terapias con medicamentos en un microambiente cerebral clínicamente relevante.
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Protocol
Declaración de Ética: El siguiente procedimiento en seres animales se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional cáncer Dana-Farber. Todos los seres humanos trabajo fue revisado por los Comités de Revisión Institucional de la Junta del Hospital Brigham y de Mujeres y Dana-Farber Cancer Institute, y por la Universidad de Stanford para el uso apropiado, que el consentimiento informado se obtuvo de todos los sujetos cuando se requiera, y renuncia apropiada de los requisitos de consentimiento se obtuvo de los estudios de riesgo mínimo.
Cronología de Protocolo Cultura Slice:
Figura 1. Cronología de Protocolo tumor cerebral / organotípicos rebanada Co-cultura. Esta cifra representa la línea de tiempo del procedimiento de la cultura rebanada abarca los ocho días of el experimento y los principales pasos del procedimiento. La línea de tiempo es relativo al Día 0 cuando las células se sembraron en el corte con el fin de resaltar la importancia de comenzar los días de procedimiento de las placas, las células. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. Disección Buffer
- Preparar 15 mM HEPES (1 M), 6,5 mg / ml de glucosa, 1,3 mM MgSO4 (1 M), KCl 20 mM (2 M) y 1% de penicilina / estreptomicina en 1X HBSS.
- Ajustar el pH a 7,4 con NaOH.
- Filtrar y almacenar a -20 ° C.
2. Cortar Medios de Cultivo
- Preparar 2% de B-27, 1% de suplemento N2, 1% de penicilina / estreptomicina, 1% Glutamax, y 1,5 mg / ml de glucosa en Neurobasal-A menos fenol rojo mediano.
- Filtrar y almacenar a -20 ° C. Descongelar según sea necesario, y desechar después de 1 semana a 4 ° C.
Nota: El siguiente procedimiento se puede realizar hasta ele días antes de comenzar la disección. - 3% de agarosa de bajo punto de fusión
Nota: El siguiente procedimiento se puede hacer hasta un día antes de comenzar la disección. - Mezclar 0,9 g bajo punto de fusión de agarosa en ~ 31 ml de tampón de disección, microondas durante 25 segundos con la tapa suelta. Microondas hasta que se derrita y asegúrese de que la mezcla no se desborde.
- Mantener a 55-65 ° C hasta que se necesite.
Nota: El siguiente procedimiento se puede hacer hasta un día antes de comenzar la disección.
4. Cubra la Cultura Inserta la rebanada con la laminina
Nota: El siguiente procedimiento se puede hacer hasta un día antes de comenzar la disección.
- En una campana de cultivo de tejidos, utilizando una pinza estéril, coloque inserto de cultivo una rebanada en cada pocillo de una placa de 6 pocillos (que coincida con el número de cortes que la intención de obtener, en torno a 12 se pueden recoger en un solo procedimiento. El siguiente procedimiento está escrito para seis rebanadas). Llene un 15 ml cónico t ube con 1x PBS (800 l / insertar) y añadir laminina (10 mg / ml).
- Añadir 800 l de la mezcla de laminina en la parte superior de cada inserción cultura rebanada. Incubar a 37 ° C hasta que se necesite.
5. Preparación para disección
- Llenar cada pocillo de una placa de 6 pocillos con 1.200 l de medio de cultivo rebanada. Rellene los pocillos no utilizados con 1.200 l de PBS y llenar el espacio del centro de la placa con 5 ml de PBS 1x. Guarde esta placa a 37 ° C.
- Esterilizar las herramientas de disección en etanol al 70%. Limpiar vibratome cuchilla con acetona para eliminar el aceite y esterilizar antes de su uso.
- Coloque tres 35 mm 2 platos y cinco 10 cm 2 platos de cultivo de tejidos en el capó. Llene un 10 cm2 plato con tampón de disección y el lugar en el hielo.
Nota: Proceso de cachorros de una en una.
6. Disección
Nota: Proceso de cachorros de una en una.
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Figura 2. Cortes disección. Estas imágenes muestran los cortes de disección necesarias para eliminar el cráneo del cerebro de un ratón P6. Los cortes se muestran como líneas de puntos. (A) Cortar 1 se muestra. Los cortes 1 y 2 se realizan desde el tronco encefálico / posterior bilateral se conecta a la cuenca del ojo en cada lado .. (B) corta 3 y 4 se muestran. Corte 3 está hecho de una cuenca del ojo a los otros cortes de conexión 1 y 2. Cortar 4 comienza en la línea media de corte 3 y continúa hacia la punta de la nariz que divide el cráneo entre los bulbos olfatorios (Escala bar = 4,4 mm). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Anestesiar el ratón P6 utilizando la exposición isoflurano (100% isoflurano). Después de aproximadamente 5 minutos cuando la respiración es lenta o no hay ninguna señal de la respiración, decapitar rápidamente elratón con tijeras afiladas. Rocíe la cabeza con 70% de etanol y colocar en una placa de cultivo de tejidos.
- Uso de grandes pinzas romas tienen cabeza firme por el acaparamiento de la nariz. Con unas tijeras de disección de tamaño medio, eliminar el exceso de piel para revelar cráneo.
- Haga cortes 1 y 2 mediante la reducción de la calavera bilateralmente, desde posterior del cráneo hacia la parte delantera en cada lado, que conecta el corte a la cuenca del ojo. Mantenga la punta de las tijeras tan cerca del cráneo como sea posible para evitar daños en los tejidos.
- Para corte 3, use pequeñas tijeras de primavera para conectar cortes 1 y 2. A continuación, utilice las pequeñas pinzas romas pelar suavemente el cráneo.
- Usando las pequeñas tijeras de primavera, cortar suavemente el cráneo restante a lo largo de la línea media en la parte superior, de tal manera que el cráneo restante se convierte en 2 mitades (Figura 2, cortado # 4). Uso de fórceps se despegan del cráneo para revelar los dos bulbos olfatorios.
- Inserte una espátula de cara plana (humedecido con tampón de disección, para el tejido no se pega a él) en el medio bottom del cerebro y la base del cráneo, retire suavemente el cerebro y colocar en el plato que contiene tampón de disección en el hielo.
- Repita el paso 6 para obtener un segundo cerebro para cortar
7. Incorporación de los cerebros en agarosa
- Coloque dos de los 35 mm 2 platos abiertos en el hielo y polvo por un par de grandes pinzas romas con etanol al 70%.
- Vierta 3% de agarosa de bajo punto de fusión (preparado en el paso 3) en los dos platos hasta que se forme de cúpula en la parte superior. Ajuste del temporizador de 3 min. A los 3 minutos (prueba por tocar el borde de la cúpula de agarosa lleno, si polimerización de agarosa se puede observar, está listo) recoger un cerebro con unas pinzas romas y lugar en la ladera de una placa de 35 mm de agarosa lleno, entonces movimiento al centro del plato (esto elimina el exceso de tampón de disección alrededor del cerebro por lo que se monta mejor).
- Repita el procedimiento para el cerebro 2º. Iniciar un temporizador durante 10 min.
- Después de 10 min, insertar una espátula plana en el espacio entreagarosa y plato para estallar hacia fuera la agarosa polimerizado que contiene el cerebro P6.
- Utilice una hoja de afeitar plana para recortar la agarosa en un cubo alrededor del cerebro, asegurándose de que los bordes son lo más recto posible.
- Coloca pegamento en la placa vibratome en dos tiras. Luego, recoger el cerebro de agarosa montada y suavemente caer hacia abajo sobre el pegamento, posicionado para rebanadas sagital. Haga lo mismo con el otro cerebro. Asegúrese de que ambos cerebros están alineados entre sí.
- Deje que el pegamento se seque a temperatura ambiente durante 5-8 minutos. Durante este tiempo, llene el área de soporte de hielo del vibratome con hielo picado y agua.
8. Cortando con el Vibratome
- Coloque el depósito de corte en el área de soporte de hielo, moviendo la pestaña hacia la derecha hasta que encaje en su lugar.
- Utilizando el destornillador de cabeza circular, recoger la placa vibratome circular con los cerebros pegados en él, y encajarlo en el depósito. Retire el destornillador y fijar la placa en su lugar con la famie destornillador de cabeza hexagonal. Asegúrese de que la placa y el embalse de corte están firmemente en su lugar.
- Uso de fórceps, recogida de la hoja vibratome, caben en la cabeza de corte, bloqueo en su lugar con el destornillador hexagonal. A continuación, fije el cabezal de corte con la hoja adjunta a la vibratome utilizando el tornillo ronda.
- Haga que aparezca la posición de la máquina de afeitar como cerca de los cerebros de agarosa embebidos como sea posible, mientras se asegura de la navaja está a la misma altura (o justo por encima) de los cerebros. Llene la cámara con suficiente tampón de disección fría para cubrir la cuchilla.
- Presione ↕ botón una vez (debería ver que parpadea, este botón se definen los límites cuando la hoja irá hacia atrás y adelante), a continuación, pulse y mantenga pulsado "Adelante" para cortar manualmente el cerebro incrustado, liberación hasta la navaja despeja el bloque de agarosa. Inmediatamente presione ↕ botón de nuevo, esta definirá el final del rango para el corte automático.
- Pulse el botón "SINGLE / CONT" una vez y el lvuelo por CONT debería continuar. Ajuste el espesor de corte de 400 a 450 micras, vibrando frecuencia a 5,5-6, y la velocidad a 4. Este será el ajuste de recorte.
- Pulse el botón "start / stop" una vez, y corte automático debe comenzar. Pulse el botón "pausa" para recoger tejido utilizando la cuchara con agujeros, según sea necesario. Se debe tomar alrededor de 5-10 minutos, para llegar más cerca de la línea media. En este punto, pulse "pausa" y cambiar la velocidad a 3 y cambie el espesor de 200 micras. No recoja la primera rebanada producido después de hacer este cambio.
- Las rebanadas deseadas de espesor 200 micras tendrán el bulbo olfatorio a través del cerebelo muy bien definido. Traslado cada rebanada deseada, ya que se cortan en placas de 6 pocillos llenos de buffer de la disección en el hielo. Haga esto moviendo el tampón en la cámara de corte alrededor del tejido para flotar la rodaja, tocarlo lo menos posible, la saca de la memoria intermedia cuando está de lleno sobre la cuchara ranurada. Por lo general alrededor de 12 rebanadas con las estructuras deseadas se pueden recoger. Las rodajas se pueden dejar en la disección de tampón en hielo durante 20 min hasta.
- Mientras que las rebanadas son en hielo, sacar la placa de 6 pocillos con insertos están recubiertas con laminina de 37 ° C incubadora. En la capilla de disección descartar la laminina cuidando de no dañar las inserciones. Añadir 3,5 ml de la rebanada medios de cultivo a la parte superior de cada inserción. La parte superior de los medios de comunicación va a formar una cúpula en forma sin derramar a cabo en los pocillos.
9. Chapado de las rodajas en los insertos
- Con la herramienta espumadera, coloque una rebanada cerebro en los medios de comunicación en el inserto, empujando suavemente el corte esté completamente sumergido. Repita para todos los sectores.
- Use un p1000 para extraer 1 ml de rodaja de medios de cultivo de la parte superior de la inserción y dispensar en el fondo del pozo. Retire y deseche el exceso de medios de comunicación hasta que los bordes de la agarosa alrededor del cerebro slicebecome visible. Haga esto para las rebanadas restantes.
- Recoge tse inserte por el borde con fórceps, inclinación y eliminar el exceso de medios de comunicación. A continuación, transferir rápidamente el inserto en 35 mm 2 plato que contiene 1 ml de medio de cultivo rebanada. Utilice 2 pares de pinzas afiladas para eliminar la agarosa alrededor del tejido, teniendo cuidado de no estirar / rebanada daños o hacer un agujero en la membrana (más fácil si haces un desgarro en el mismo borde de la agarosa, luego separar la agarosa de cualquier lado). A continuación, mueva el inserto de nuevo a la placa de 6 pocillos y repita para las rebanadas restantes.
- En una campana de cultivo de tejidos con el ventilador apagado (para evitar las rebanadas de desecación) eliminar los fragmentos de agarosa de cada membrana.
- Transfiera las rebanadas a la placa de 6 pocillos preparada en el paso 5.1 y almacenar la placa a 37 ° C. Incubar las rebanadas de 24 a 48 h.
10. Cambio de la rebanada Medios de Cultivo
- Repita el paso 5.1 con una placa de 6 pocillos fresco.
- En una campana de cultivo de tejidos con el ventilador apagado, transferir los insertos a nuevas placas de 6 pocillos containing medios rebanada fresca.
11. Revestimiento células tumorales en la rebanada
- Sonicar el tinte Cm-Dil y girar a velocidad media durante 2 min.
- Centrifugar las células tumorales se utilizan para la superposición en 201 g durante 5 min. A continuación, volver a suspender en 2 ml de medio de cultivo rebanada.
- Añadir 7 l de Cm-Dil en los 2 ml de las células y los medios de comunicación y se incuba a 37 ° C durante 20 minutos.
- Centrifugar las células a 201 xg durante 5 minutos y resuspender en 200 l de los medios de corte. Se tritura suavemente para disociar las células (10-20 veces o hasta de pellets se ha ido) y luego añadir 800 l rebanar medios para hacer 1.000 l volumen total.
- Recuento de células tumorales viables utilizando azul tripán. Añadir microesferas fluorescentes verdes a las células tumorales, a la misma concentración como células. Estas microesferas inertes servirán como control. Centrifugar la mezcla de células / microesfera a 201 xg durante 5 min y resuspender en cantidad deseada de medios de cultivo rebanada. Células de placas a una densidad de 6.000 células / slhielo en 65 l de volumen. El número de células sembradas por rebanada puede incrementarse dependiendo de la preferencia y la disponibilidad.
- En la campana de cultivo de tejido dispensar las células en 65 l de media / rebanada en el centro de la rebanada.
12. Imágenes y Fijación
Nota: una Nikon Eclipse Ni C2si vertical confocal se utilizó para tomar un examen de imagen grande de toda la rebanada sagital a 4X con canales fluorescentes rojos y verdes. Si función de escaneado no está disponible, tome varias imágenes de forma secuencial a través de la porción y luego unir las imágenes en Photoshop (mediante la ubicación de microesferas y el borde de la rebanada para navegar).
- Al día siguiente (día 1 de imágenes), la transferencia de las rebanadas en seis 35 mm 2 platos con 1 ml rebanada medios de cultivo. Image cada rebanada uno a la vez en el microscopio vertical fluorescente. Tome una exploración de imagen grande de toda la rebanada sagital a 4X con canales fluorescentes rojos y verdes. Mantenga lásery el aumento de ajustes el mismo para cada rebanada. Al final de la proyección de imagen, transferir todos los cortes de nuevo a una placa de 6 pocillos que contiene medios rebanada fresca.
- Si se desea la adición de EDU, otro marcador de proliferación o condición de drogas, crear un stock de medios rebanada con el fármaco que se utilizará para los cambios de medios de comunicación al día durante la condición de tratamiento. La condición de tratamiento debe ser introducido en el paso 12.1 (justo después del día 1 de imágenes). Cualquier EDU o proliferación marcador debe añadirse a los medios de comunicación también a partir de las 12.1 y actualiza todos los días (utilizar EDU a las 10 M).
- Imagen de nuevo en el día 7 con la misma configuración como el Día 1 imágenes.
- Después del día 7 de imagen es completa, mueva cada rebanada en una placa de 6 pocillos conteniendo cada pocillo 1,2 ml de 4% paraformaldehído (PFA). Con cuidado y lentamente deje caer un adicional de 1 ml de PFA en la parte superior de cada rebanada. Deja a temperatura ambiente durante 1 hora.
- Eliminar PFA de cada pocillo y desde la parte superior de cada rebanada. Lavar cada pocillo 3 veces con PBS. Guarde las rebanadas en PBS a4 ° C para la tinción o de montaje en portaobjetos.
Nota: Los valores ImageJ pueden necesitar ser ajustado y optimizado para dar cuenta de imagen y calidad de microscopio así como el tamaño de las células tumorales.
13. Cuantificación de Imágenes (Uso de ImageJ)
Nota: Los valores ImageJ pueden necesitar ser ajustado y optimizado para dar cuenta de imagen y calidad de microscopio así como el tamaño de las células tumorales.
- En ImageJ, utilice la herramienta polígono para delinear todo el sector o la región que desea cuantificar. Añadir esta selección con el gerente ROI donde se puede cambiar el nombre y guardarlo.
- Haga clic derecho sobre el área seleccionada y elija duplicar. Nombre esta imagen duplicada con la región, rebanada, día. Presione Ctrl + Shift + E para mostrar el contorno, a continuación, seleccione Proceso - restar de fondo - Rolling Ball Radio = 4.
- Después de sustracción de fondo, seleccione "ajustar umbral" en la "imagen" del menú desplegable. Compruebe el fondo oscuro -; ver imagen ampliada y establecer el umbral. Como establece el umbral moviendo la barra de umbral, asegurar que todas las células se incluyen / destacaron pero extremadamente pequeños puntos que son restos (o más pequeño que una célula) no están incluidos. Utilice el mismo umbral para todas las imágenes. Mover la ventana de umbral a un lado.
- Seleccione "Proceso" - "Encuentra Maxima" y establecer la tolerancia de ruido entre 5 y 10, y compruebe lo siguiente: selección del punto de vista previa, tipo de salida como partículas segmentados, excluir máximos borde, por encima del umbral inferior. Luego vuelva a seleccionar la región de interés pulsando Ctrl + Shift + E.
- Seleccione "Analizar partículas" en el menú Analizar desplegable. Ajuste el tamaño de píxel de 4-40 y la circularidad de 0,00 a 1,00. También haga clic "mostrar contornos de superposición", "mostrar resultados" y "resumen", a continuación, pulse Aceptar.
- Registre todos los datos en bruto y el resumen en un documento de Microsoft Office. La "Cuenta" para cada región is necesaria para calcular el cambio veces durante la semana en la cultura.
- Repita este proceso para todas las imágenes y áreas de interés, asegurándose de que el umbral y otros ajustes siguen siendo coherentes.
- Calcular el factor de cambio en el número de células en la rebanada durante la semana en cultivo dividiendo el número de células tumorales en la rebanada en el día 7 por el número de células en la rebanada en el Día 1. Del mismo modo, doble cambio en el número de células dentro de cada región se calcula dividiendo el número de células en esa región en el día 7 por el número de células en esa región en el Día 1.
- Realice el paso 13.8 de microesferas también. El número de microesferas en el segmento debe ser el mismo en el día 7 como en el Día 1 (Doble cambio = 1). Del mismo modo, el número de microesferas dentro de cada región debe ser el mismo en el día 7 como en el Día 1 (Doble cambio = 1). Si cambio veces difiere de 1, esto indica cambios en la topografía rebanada a través del tiempo.
14. La tinción
- Pegue un pedazo de parafina en el thmesa de laboratorio electrónico y dibujar seis círculos con un lápiz pap bloqueador de líquido (una para cada rebanada, justo mayor que el tamaño de una rebanada). Colocar aproximadamente 400 l de PBS en un punto en el centro de cada círculo. Número o etiquetar los círculos para identificar cada rebanada.
- En 1 ml de PBS, utilizar una hoja de afeitar para cortar un cuadrado alrededor de la rebanada, dejando un poco de espacio de la membrana alrededor de la rebanada. Con unas pinzas se mueven la rebanada cortada en el primer círculo y con cuidado ponen el corte en la parte superior de la burbuja de PBS. Es esencial para asegurarse de que la rodaja no se pliega sobre sí misma o conseguir volteado al revés durante este proceso. Luego, retire la PBS de debajo de la rebanada y lo puso en la parte superior de la rodaja y añadir más PBS si es necesario para asegurarse de que permanece sumergido. Repita este paso para cada rebanada.
- Hacer 10 ml de 3% de BSA en PBS. Saque 2 ml, y añadir 100 l de digitonina a ella. Mezclar y añadir a rodajas para bloquear y permeabilizar, 30 min a TA.
Nota: El uso de otros agentes de permeabilización, tales como Triton X-100 se traducirá en la pérdida de etiquetado CM-Dil. - Retire la permeabilización solución / bloqueo y enjuagar 3x con PBS durante 10 min.
- Si la tinción de EDU, siga las instrucciones proporcionadas por el kit para montar la mezcla. Aplicar la mezcla durante 45 min. Si la tinción con otros anticuerpos, el protocolo debe ser optimizado para la concentración de anticuerpos primarios y secundarios (RT ~ 1 h para primaria y secundaria). Enjuagar 3 veces con PBS durante 10 min.
- Mancha con DAPI 1: 1000 en PBS durante 5 min RT. Enjuague 2x con PBS.
15. Montaje del Rebanadas
- Transferir la rebanada a un portaobjetos de microscopio. Asegúrese de que el lado de la membrana con la rebanada permanece hacia arriba, y no se pliega sobre sí misma. Dibuja un borde alrededor de la rebanada con una pluma pap bloqueador líquido.
- Coloque una pequeña cubreobjetos de vidrio (5 mm) en cada lado de la división (para mantener el corte se dañe). Caída de dos o tres gotas de Fluoromount-G (por inmunofluorescencia) en la parte superior de larebanada de apenas cubre. Luego cubra el cubreobjetos mucho slice (24 x 50 mm).
- Repita el procedimiento para cada rebanada. Selle los bordes de las diapositivas con esmalte de uñas y se almacena a 4 ° C. Haga imagen confocal de la tinción.
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Representative Results
Esta sección ejemplifica el tipo de resultados que cabe esperar de la utilización del tumor cerebral / rebanada de co-cultivo organotípico para investigar la preferencia microambiente regional, así como para probar nuevas terapias. Se demuestra que el ensayo está diseñado para replicar el microambiente de los tumores cerebrales, ya que la organización del tejido y el estado proliferativo de la rodaja se mantiene (Figura 3). También demuestran que un aumento en el número de células tumorales en la rebanada con el tiempo puede ser parcialmente debido a la migración de las células en el microambiente de cortes de cerebro (Figura 4). También hemos demostrado que este co-cultivo se puede utilizar como un ensayo cuantitativo mediante el cálculo de las veces el cambio en número de células durante la semana en cultivo para las regiones específicas de la rebanada, o para todo el corte de cerebro (Figura 6) Los resultados preliminares de múltiples tipos de células tumorales han demostrado que el número de células tumorales puede cuantificarse mediante formación de imágenes confocal dela rebanada 200 m de espesor debido al hecho de que las células migran solamente a una profundidad de un 20-50 micras en la rodaja.
Hemos encontrado que las microesferas fluorescentes verdes son un control efectivo de los cambios en la topografía rebanada porque muestran ningún movimiento o cambio en el número a lo largo del tiempo en cultivo (Figura 5). Después de fijar el co-cultivo, la tinción se puede hacer para examinar las células tumorales en un microambiente cerebro y los efectos de los fármacos sobre la proliferación de células tumorales, la muerte celular, o cambios en la expresión de la proteína (Figura 7). Hemos demostrado que este ensayo puede ser utilizado para probar terapias con fármacos a través de una comparación de las células de meduloblastoma de ratón tratados con un Smo (Smoothened) antagonista LDE225 (Sonidegib) o con un control del vehículo. Las veces de aumento en el número de células en la rebanada más de una semana en cultivo se cuantificó y se representan gráficamente (número de células en el día número 7 / célula en el Día 1) Estos datos indican que LDE225 en gran medida depliegues número de células tumorales en comparación con el control 6. Este efecto también se puede ver en las imágenes representativas incluyen (Figura 8). También mostramos imágenes de células de meduloblastoma humanos cultivados en el ensayo de cultivo de cortes (Figura 9).
Figura 3. Tumores Cerebrales / organotípicos Slice Co-cultura diseño de ensayo. (A) organotípicos de cortes de cerebro sagital de un ratón P6 se coloca directamente sobre una membrana semi-poroso y se añade medio a la parte inferior de la placa de cultivo. El cultivo se sumerge en el medio de un lado y es accesible al oxígeno desde el otro lado. Células tumorales marcadas se superponen sobre la porción y número de células se puede seguir a través del tiempo. (B) En la cultura, la rodaja mantiene una organización del tejido que se asemeja a la observada in vivo. Preservation del microambiente cerebral se demuestra por Edu etiquetado de los precursores neuronales de gránulos proliferativos en la capa de gránulos externa (EGL) del cerebelo en la cultura rebanada. En la cultura rebanada, estas células precursoras incorporan el análogo de timidina EdU, como sería observado in vivo en esta etapa del desarrollo (P6) (flecha blanca indica EGL). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. células de astrocitoma humano en tumor cerebral / organotípicos rebanada Co-cultura de ensayo. Un aumento en las células tumorales del cerebro humano en la rebanada puede reflejar relocalización de las células tumorales de la membrana a la cultura rebanada. (A) Un área en el borde de una rebanada en el Día 1 (arriba) y el día 7 (abajo) donde las células pueden m igrate de la membrana sobre la rebanada de cerebro. (B) Un segundo ejemplo de la posible migración de células en el cerebro en el borde de la rebanada. Día 1 (arriba) y el día 7 (abajo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Las bolas de control de microesferas. Día 1 (roja) y el Día 7 imágenes de control (verde) de microesferas fluorescentes se superponen (amarillo) para revelar ningún movimiento de las microesferas más de una semana en la cultura. Día 1 y Día 7 imágenes fueron tomadas en la misma posición dentro de la rebanada (barra de escala = 45 micras). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. La cuantificación en ImageJ. (A) La imagen de una rebanada se abre en ImageJ y toda la corte y / o regiones se describen para la cuantificación. (B) Se selecciona la región de interés y una imagen duplicada está hecho. (C ) La fluorescencia de fondo se resta de la imagen. (D) El umbral se fija para el tamaño de las células y la forma, la determinación de lo que se contaba. (E) Analizar partículas para contar el número de células dentro de la región de interés. Veces el cambio en el número de células se puede calcular dividiendo el número de células en el día 7 por el número de células en el día 1 de cada región de interés o la totalidad del área del corte. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .
Figura 7. Tinción para la proliferación. Image ejemplifica cómo la tinción (después de la fijación de la rebanada en PFA) con éxito se puede hacer en la rebanada después de una semana en cultivo. La imagen muestra la tinción DAPInuclear (azul), células de meduloblastoma de ratón marcados con fluorescencia de color rojo, verde y etiquetado para la incorporación del análogo de timidina en el ADN como un marcador para la proliferación. EDU se incluyó en los medios de cultivo rebanada (10 M) durante una semana (flechas blancas indican células positivas para EDU y flechas amarillas indican células negativas para EDU) (Escala bar = 50 micras). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 8. mouse Medulloblas Las células Toma tratados con LDE225. Esta figura demuestra el tratamiento farmacológico de las células tumorales en el sistema de ensayo de solapamiento de división. (A) Representación gráfica de los datos obtenidos de un experimento de meduloblastoma de ratón. DMSO era la condición de control (CTL) y LDE225 (Sonidegib) (1 mM) (LDE) era la condición de tratamiento. Las veces de aumento en el número de células en la rebanada más de una semana en cultivo se cuantificó (número de células en el día número / célula 7 en el Día 1), (n = 12 de CTL, n = 13 LDE, barras de error = SEM). (B) Representante imágenes de las secciones tratadas de control del vehículo en el Día 1 (arriba) y el día 7 (abajo). (C) Imágenes representativas de LDE tratados rebanadas en el Día 1 (arriba) y el día 7 (abajo). Las imágenes fueron tomadas con un aumento de 4X. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 9. células de meduloblastoma humano en tumor cerebral / organotípicos rebanada Co-cultura. Células de meduloblastoma humanos se obtuvieron de James M. Olson en la Universidad de Washington, y se cultivaron durante una semana en el ensayo de cultivo de cortes. (A) Día 1 imagen de células humanas cultivadas meduloblastoma en el segmento de cerebro de ratón. (B) Una imagen de la misma rebanada de cerebro de ratón con células de meduloblastoma humanos después de una semana en la cultura (día 7). Las imágenes fueron tomadas con un aumento de 4X. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe cómo las células tumorales del cerebro pueden ser etiquetados con fluorescencia y se sembraron en una sección sagital del cerebro de un ratón P6 y luego monitoreados durante una semana en la cultura. Este / ensayo rebanada co-cultivo organotípico tumor cerebral se puede utilizar para determinar el efecto del microambiente regional en el número de células tumorales y también puede ser utilizado como un sistema para medir la eficacia de nuevos tratamientos farmacológicos sobre el crecimiento del tumor humano. Estudios anteriores han utilizado una estrategia similar para evaluar el papel de cerebro micro-entorno en neural 7,8 proliferación precursor.
Este ensayo en el que las células tumorales del cerebro se siembran en un cultivo de cortes organotípicos 9 proporciona un sistema para el cultivo de células tumorales cerebrales humanas que son difíciles de propagar en condiciones normales de cultivo celular. Un aspecto crítico de este procedimiento es la importancia de mantener la salud de la rebanada y las células tumorales. La longitud de tiempo que las rodajas se sientan en tampón durante el dissection y a TA durante la exploración se deben limitar, para asegurar que las rebanadas y las células se mantienen lo más saludable posible. Si las células tumorales cerebrales humanas primarias están siendo utilizados en este ensayo, las células deben ser chapada en las rebanadas tan pronto como sea posible después de la biopsia. Por lo tanto los cortes deben estar preparados antes de la cirugía. Para evitar cualquier efecto diferencial de tiempo de imágenes entre las rebanadas, la cantidad de tiempo pasado fuera de la incubadora debe ser corto y consistente para todos los cultivos de cortes en un experimento. Los controles de microesferas son importantes ya que proporcionan marcas espacialmente coherentes en el tiempo. Además, las distorsiones en la cultura rebanada debido a la contracción, lagrimeo, o plegado son evidentes por imágenes de las cuentas de microesferas.
Una de las limitaciones de este protocolo es que las células sólo pueden propagarse en este sistema de cultivo rebanada durante aproximadamente una semana. Sin embargo, para algunos tipos de tumores cerebrales esto es una mejora significativa sobre la corriente o estadoasuntos f. Una segunda limitación es que la barrera hematoencefálica se elimina, lo cual es una consideración importante en la evaluación de fármacos que pueden ser utilizados para el tratamiento de tumores cerebrales. Una tercera consideración es que se trata de un ensayo de bajo rendimiento que no puede ser utilizado para probar una biblioteca de compuestos.
Este ensayo es versátil y fácilmente modificado para estudiar diferentes tipos de células tumorales y una variedad de preguntas de investigación. Este protocolo se puede utilizar como un ensayo cuantitativo para examinar los efectos de nuevas terapias sobre la supervivencia de células tumorales y el crecimiento (Sun et al., Comunicación personal). Una comparación de las veces el cambio en el número de células tumorales en regiones distintas del cerebro proporciona un método para descifrar los efectos de microambiente sobre el crecimiento tumoral.
Este sistema tumor cerebral / organotípicos rebanada de co-cultivo también proporciona la posibilidad de investigar la relación entre las células tumorales del cerebro y microambientes específicos del cerebro. Massachusettsny tipos de tumores cerebrales muestran un patrón distinto de desarrollo en las regiones y microambientes 3,4 específicas del cerebro. Al cultivar células tumorales humanas marcadas sobre una rebanada de cerebro de ratón sagital, las células pueden ser monitorizados para detectar preferencia regional que puede ser consistente con la región in vivo del crecimiento. Un examen más detallado del microambiente que las células tumorales prefieren podría conducir a la identificación de los posibles factores que apoyan el crecimiento de células tumorales. Este ensayo puede ayudar a mejorar en condiciones de cultivo celular in vitro y también puede proporcionar un sistema para estudiar cómo la iniciación del tumor puede prevenirse o tratarse de manera más eficaz.
Hay tipos específicos de tumores cerebrales que no puede ser propagado en condiciones normales de cultivo celular o por el ratón ortotópico o xenoinjertos subcutáneos. Para estos tipos de tumores es difícil probar nuevas terapias de fármacos sobre las células tumorales humanas. Este protocolo demuestra que las células tumorales del cerebro humano pueden ser cultivadas en la rebanadaensayo de cultivo y los tratamientos farmacológicos pueden evaluarse cuantitativamente. Después del tratamiento de drogas, co-tinción de las células tumorales puede proporcionar una evaluación adicional del efecto del fármaco sobre la proliferación de células tumorales y la inhibición de la vía. Estudios recientes han demostrado que puede existir una diferencia drástica entre un efecto de los fármacos sobre las células cancerosas en un cultivo normal de células monocapa frente a un ambiente de cultivo celular heterogénea 3D 10. Las células epiteliales normales y tumorales mismo modo adultas, que tienen una vida corta in vitro, se ha demostrado que reprogramar condicionalmente a un estado proliferativo cuando se cultivan en células alimentadoras de fibroblastos en combinación con un inhibidor de la quinasa Rho 11. Estos estudios apoyan aún más la importancia de mantener las células tumorales en un organotípico, 3D, microambiente clínicamente relevante, y la relevancia de este sistema de cultivo celular para la investigación del cáncer en curso. Por lo tanto, este es un ensayo valioso para probar fármacos en células tumorales humanas en un relevan clínicamentet modo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Invitrogen | 17504044 | |
| Glucose | Invitrogen | 17502048 | |
| Pennicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Neurobasal-A- Medium minus phenol red | Invitrogen | 12349015 | |
| Low Melting Point Agarose | Promega | V2111 | |
| Slice Culture Inserts | Milipore | PICM0RG50 | |
| laminin | Invitrogen | 23017015 | |
| Cm-DiI | Invitrogen | V22888 | |
| EDU (Labeling and Detection) | Life Technologies | c10337 | |
| Microspheres | Life Technologies | F-21010 | |
| Vibratome | Leica | ||
| Confocal Microscope | Nikon Eclipse Ni C2si | ||
| ImageJ software | |||
| 5 mm Cover Glasses | Fisher Scientific | 64-0700 (CS-5R) |
References
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