Der Transfer von bm12-Lymphozyten in einen C57BL/6-Empfänger ist ein etabliertes Modell des systemischen Lupus erythematodes. Hier beschreiben wir, wie man mit diesem Modell eine Krankheit auslösen kann und wie man T-follikuläre Helferzellen, Keimzentrum-B-Zellen und Plasmazellen mittels Durchflusszytometrie charakterisiert.
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Methodenartikel
Das BM12 Inducible Modell des systemischen Lupus erythematodes (SLE) in C57BL / 6-Mäuse
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Systemischer Lupus erythematodes (SLE) ist eine Autoimmunerkrankung mit vielfältigen klinischen und immunologischen Manifestationen. Mehrere spontane und induzierbare Tiermodelle spiegeln gemeinsame Komponenten menschlicher Krankheiten wider, darunter das bm12-Transfermodell. Nach dem Transfer von bm12-Splenozyten oder gereinigten CD4-T-Zellen entwickeln C57BL/6-Mäuse schnell große Frequenzen von follikulären T-Helferzellen (Tfh), B-Zellen des Keimzentrums (GC) und Plasmazellen, gefolgt von hohen Konzentrationen zirkulierender antinukleärer Antikörper. Da dieses Modell Mäuse auf einem reinen C57BL/6-Hintergrund verwendet, können die Forscher schnell und einfach das Fortschreiten der Krankheit in transgenen oder Knockout-Mausstämmen in relativ kurzer Zeit untersuchen. Hier beschreiben wir Protokolle für die Induktion des Modells und die Quantifizierung von Tfh, GC B-Zellen und Plasmazellen mittels Mehrfarben-Durchflusszytometrie. Wichtig ist, dass diese Protokolle auch zur Charakterisierung von Krankheiten in den meisten Mausmodellen von SLE und zur Identifizierung von Tfh, GC B-Zellen und Plasmazellen in anderen Krankheitsmodellen verwendet werden können.
Einleitung
Systemischer Lupus erythematodes (SLE) ist eine komplexe Autoimmunerkrankung prototypisch durch Anti-Atom-Antikörper (ANA) Produktion und Glomerulonephritis gekennzeichnet. Zahlreiche weitere Folgeerscheinungen, einschließlich Haut, Herz-Lungen-und Leberläsionen mit Krankheit bei einigen Personen verbunden. Prävalenzschätzungen in den USA sind sehr unterschiedlich, von 150,000-1,500,000 1,2, mit besonders hohen Inzidenz bei Frauen und Minderheiten 3. Obwohl die Ätiologie von SLE ist schwer zu erkennen, ist es gedacht, um aus dem Zusammenspiel verschiedener genetischer und Umweltfaktoren, die bei der systemischen Autoimmunität gipfeln auftreten. ....
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Protokoll
Tier Arbeit wurde unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Gesellschaft für Evaluierung und Akkreditierung von Laboratory Animal Care International und unserer Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) eingestellt durchgeführt.
HINWEIS: Integrieren Mäuse eine kongene Marker exprimieren, wie CD45.1 entweder Spender oder Empfängertiere falls möglich, da auf diese Weise für die Überwachung des Spendertransplantat Effizienz und spezifischen Dehnung des Spenders CD4 T-Zellpopulation. Wenn unter Berücksichtigung der Verwendung von ansonsten genetisch veränderten Mäusen als Spender ....
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Ergebnisse
Erkrankten Mäuse entwickeln Splenomegalie in weniger als 14 Tagen aufweisen Milzen 2-3 mal die Größe des gesunden Mäusen in Bezug auf Masse und Zellularität (Abbildung 2).
Splenozyten werden nacheinander auf Lichtstreuung (FSC-A von SSC-A) gated, Eliminierung von Dubletten (FSC-W oder -H von FSC-A), lebensfähigen Zellen (niedrige Färbung der Lebensfähigkeit Farbstoff) und CD4 + TCR & bgr; + (Abbildung 3A). Spenderzellen unterscheide.......
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Diskussion
Das BM12 induzierbaren Modell ist eine relativ einfache und effiziente Möglichkeit, die zellulären und molekularen Prozesse der SLE-Studie. Chronische Aktivierung adoptiv transferierte CD4 T-Zellen gegen Selbstantigene gerichtet führt zur Akkumulation von Tfh, GC-B-Zellen und Plasmazellen, die durch Flusszytometrie gemessen werden kann, wie hier beschrieben. Zukünftige Studien unter Verwendung dieses Modells können schnell und einfach abfragen, die Rolle von Kandidatengenen und neuartiger Therapien in den Autoimmunkeimz.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch das Lupus Research Institute, NCI Grant CA138617, NIDDK Grant DK090978, Charlotte Schmidlapp Award (an E.M.J.) und das Albert J. Ryan Fellowship (an J.K.). Wir sind dankbar für die Unterstützung und Instrumentierung durch den Research Flow Cytometry Core in der Abteilung für Rheumatologie am Cincinnati Children's Hospital Medical Center, der zum Teil von NIH AR-47363, NIH DK78392 und NIH DK90971 unterstützt wird.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ | The Jackson Laboratory | 001162 | CD45.1+ BoyJ Mausstamm |
| B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ | The Jackson Laboratory | 001162 | Bm12 Mausstamm |
| FastDigest PsuI | Life Technologies | FD1554 | Restriktionsverdau-Enzym für die Genotypisierung |
| von 1X RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| IMDM | GE Healthcare | SH30228.01 | |
| Plasma-Trennröhrchen (PST) | BD | 365974 | Blutentnahmeröhrchen mit Dikalium-EDTA |
| Serum-Trennröhrchen (SST) | BD | 365967 | Blutentnahmeröhrchen mit Gerinnselaktivator / SST-Gel |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Lösung zur Zelltrennung mit hoher Dichte |
| Lympholyte-M | Cedarlane | CL5030 | Lösung zur Zelltrennung mit hoher Dichte |
| GL-7-Biotin | eBioscience | 13-5902-82 | |
| Streptavidin-BUV395 | BD | 564176 | |
| CD138-BV421 | BioLegend | 142508 | |
| CD4-BV510 | BioLegend | 100559 | |
| TCRβ-BV605 | BD | 562840 | |
| CD45.1-BV711 | BioLegend | 110739 | |
| CD45.2-FITC | BioLegend | 109806 | |
| PD-1-PE | BioLegend | 135206 | |
| CD19-PerCP | BioLegend | 115532 | |
| Fas-PE-Cy7 | BD | 557653 | |
| CXCR5-APC | BioLegend | 145506 | |
| Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff ef780 | eBioscience | 65-0865-18 | |
| CD4-BV421 | BioLegend | 100443 | |
| 1,2 ml FACS-Tubeneinsätze, USA | Scientific | 1412-1400 | |
| BD Falcon™ Rohre mit rundem Boden | BD | 352017 |
Referenzen
- Helmick, C. G., Felson, D. T., et al. Part I. Arthritis Rheum. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. 58, 15-25 (2008).
- Lupus Foundation of America Web Site. , Available from: http://www.lupus.org/answers/entry/what-is-lupus (2015).
- Somers, E. C., Marder, W., e....
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Nachdrucke und Genehmigungen
