The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.
Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.
El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enfermedad compleja caracterizada prototípicamente por el anticuerpo antinuclear (ANA) la producción y la glomerulonefritis. Numerosas otras secuelas, incluyendo dérmica, cardio-pulmonar y lesiones hepáticas están asociadas con la enfermedad en algunas personas. Las estimaciones de prevalencia en los EE.UU. varían ampliamente, desde 150,000-1,500,000 1,2, con especial incidencia en las mujeres de alto y las minorías 3. Aunque la etiología de LES ha sido difícil de discernir, se cree que surgen de la interacción de diversos factores genéticos y ambientales, que culminan en la autoinmunidad sistémica.
Se han empleado numerosos modelos animales para estudiar los factores que conducen a la aparición de enfermedades y la progresión. Los modelos clásicos de ratón de LES incluyen cepas de ratones genéticamente predispuestos incluido el NZB x NZW modelo F1 y sus derivados NZM, la cepa / lpr MLR, y la cepa BXSB / Yaa, y los sistemas inducibles, tales como el penfermedad crónica de injerto contra huésped (cGVHD) modelos de 4 y ristane. Los primeros informes de la producción de autoanticuerpos en los modelos de EICH utilizan diversas cepas de ratón o cepas de hámster para padres en las transferencias de F1 5 – 8; métodos más comunes utilizados para estudiar la enfermedad similar al lupus incluyen actualmente el DBA / 2 padres → (C57BL / 6 x DBA / 2) F1, y el modelo de transferencia BM12 se describe aquí. Cada modelo tiene sus propias advertencias, pero generalmente comparten un conjunto común de características que se correlacionan con las características clínicas de la enfermedad humana. Los parámetros más frecuentemente reportados en modelos de ratón incluyen esplenomegalia, linfadenopatía, la nefritis, la producción de ANA, y en el nivel celular, la expansión de las células T helper (foliculares TFH), centro (GC) células B germinales y células plasmáticas.
El modelo BM12 inducible se consigue mediante la transferencia adoptiva de linfocitos de IA BM12 B6 (C) – H2 – Ab1 BM12 / KhEgJ (BM12) ratones, una cepa identical de C57BL / 6 a excepción de 3 sustituciones de aminoácidos en el MHC de clase II, en IA b / 6 (B6) ratones C57BL. Alloactivation de donantes de células T CD4 por destinatario APC lleva a cGVHD con síntomas muy parecidas a LES. Específicamente, éstos incluyen expansión de donante derivado Tfh, la expansión de las células B GC receptores derivados y células plasmáticas, y la producción de ANAs incluyendo anti-dsDNA, anti-ssDNA, anti-cromatina, y los anticuerpos anti-RBC 9. Con el tiempo, los ratones receptores desarrollan glomerulonefritis asociada con depósitos de IgG en el glomerular, intersticial, y regiones vasculares de los riñones 10. Recientemente hemos demostrado que, similar a la enfermedad humana, también hay un papel crítico para la IFN de tipo I en este modelo 11. En particular, los criterios que definen para SLE humano incluyen el desarrollo de nefritis compatible con SLE en presencia de anticuerpos anti-dsDNA 12, ambos de los cuales son características prominentes de este modelo de ratón.
Hay seVeral ventajas del modelo BM12 en los modelos espontáneos. Los modelos clásicos que se desarrollan signos-LES como espontáneamente se basan en cualquiera de las cepas de ratón híbridos, cepas puras ratón no en el fondo B6, o grande loci genéticos en el fondo B6, que hacen que cruzan a octavos de final, o de lo contrario los ratones modificados genéticamente difícil y lleva mucho tiempo. Con el modelo inducible BM12, los ratones modificados genéticamente pueden servir ya sea como el donante o el receptor, lo que permite más rápida identificación del compartimento celular en el que genes en particular puede ser importante para la enfermedad. Además, el desarrollo de la enfermedad en el modelo BM12 es mucho más rápido, que requiere sólo 2 semanas hasta la aparición de ANA, en comparación con varios meses para los modelos más espontáneas. Además, en contraste con los modelos espontáneos que se desarrollan la enfermedad en diferentes puntos de tiempo, el inicio de la enfermedad y la progresión en el modelo B6 BM12 → es altamente sincronizadas. Esto permite la generación de cohortes de tamaño apropiado que se be utiliza para estrategias de intervención o terapéuticos en cualquier etapa del desarrollo de la enfermedad.
Lo que sigue es un protocolo detallado para iniciar-LES como autoinmunidad por la transferencia adoptiva de linfocitos BM12, los cuales en ratones C57BL / 6, o variantes genéticas en el fondo B6. Además, se describe un protocolo de tinción de citometría de flujo para enumerar Tfh, las células B GC, y los tipos de células células plasmáticas asociadas con la enfermedad humana. Es importante destacar que estos protocolos también pueden ser utilizados para caracterizar la enfermedad en la mayoría de los modelos de ratón de SLE e identificar Tfh, las células B GC y células plasmáticas en otros modelos de enfermedad.
El modelo inducible BM12 es una manera relativamente fácil y eficiente para estudiar los procesos celulares y moleculares de la LES. La activación crónica de las células T CD4 adoptivamente transferidas dirigidas contra antígenos propios conduce a la acumulación de Tfh, las células B GC, y las células plasmáticas que puede ser medida por citometría de flujo, tal como se describe aquí. Futuros estudios que utilizan este modelo de forma rápida y sencilla puede interrogar al papel de los genes candidatos y nuev…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by the Lupus Research Institute, NCI grant CA138617, NIDDK grant DK090978, Charlotte Schmidlapp Award (to E.M.J.), and the Albert J. Ryan Fellowship (to J.K.). We are grateful for the support and instrumentation provided by the Research Flow Cytometry Core in the Division of Rheumatology at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, supported in part by NIH AR-47363, NIH DK78392 and NIH DK90971.
B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ | The Jackson Laboratory | 001162 | CD45.1+ BoyJ mouse strain |
B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ | The Jackson Laboratory | 001162 | Bm12 mouse strain |
FastDigest PsuI | Life Technologies | FD1554 | Restriction digest enzyme for genotyping |
1X RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
IMDM | GE Healthcare | SH30228.01 | |
Plasma Separation Tube (PST) | BD | 365974 | Blood collection tube with Dipotassium EDTA |
Serum Separation Tube (SST) | BD | 365967 | Blood collection tube with Clot activator / SST Gel |
Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | High density cell separation solution |
Lympholyte-M | Cedarlane | CL5030 | High density cell separation solution |
GL-7-biotin | eBioscience | 13-5902-82 | |
Streptavidin-BUV395 | BD | 564176 | |
CD138-BV421 | BioLegend | 142508 | |
CD4-BV510 | BioLegend | 100559 | |
TCRβ-BV605 | BD | 562840 | |
CD45.1-BV711 | BioLegend | 110739 | |
CD45.2-FITC | BioLegend | 109806 | |
PD-1-PE | BioLegend | 135206 | |
CD19-PerCP | BioLegend | 115532 | |
Fas-PE-Cy7 | BD | 557653 | |
CXCR5-APC | BioLegend | 145506 | |
Fixable Viability Dye ef780 | eBioscience | 65-0865-18 | |
CD4-BV421 | BioLegend | 100443 | |
1.2 ml FACS tube inserts, racked | USA Scientific | 1412-1400 | |
BD Falcon™ Round-Bottom Tubes | BD | 352017 |