The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.
Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.
Le lupus érythémateux disséminé (SLE) est une maladie auto-immune complexe caractérisé prototypiquement par l'anticorps anti-nucléaire (ANA) et de la production glomérulonéphrite. De nombreux autres séquelles, y compris dermique, cardio-pulmonaire, et des lésions hépatiques sont associés à la maladie chez certains individus. Les estimations de prévalence aux États-Unis varient considérablement, de 1,2 150,000-1,500,000, avec incidence particulièrement élevée chez les femmes et les minorités 3. Bien que l'étiologie de la SLE a été difficile à discerner, il est pensé pour résulter de l'interaction de divers facteurs génétiques et environnementaux, qui culminent dans l'auto-immunité systémique.
De nombreux modèles animaux ont été utilisés pour étudier les facteurs menant à l'apparition et la progression de la maladie. Des modèles de souris classiques de SLE comprennent des souches de souris génétiquement prédisposées, y compris le modèle NZB x NZW F1 et ses dérivés NZM, la souche / lpr MLR, et la souche BXSB / Yaa et systèmes inductibles, tels que le pristane et la maladie chronique du greffon contre l'hôte (cGVHD) 4 modèles. Les premiers rapports de la production d'auto-anticorps dans des modèles de GVHD utilisés souches de souris différentes souches ou de hamster pour parent dans les transferts de F1 5 – 8; méthodes les plus courantes utilisées pour étudier la maladie lupique comprennent actuellement les DBA / 2 → parent (C57BL / 6 x DBA / 2) F1, et le modèle de transfert de bm12 décrit ici. Chaque modèle a ses propres mises en garde, mais ils partagent en général un ensemble commun de caractéristiques qui sont en corrélation avec des caractéristiques cliniques de la maladie humaine. Les paramètres les plus souvent rapportés chez les souris modèles comprennent une splénomégalie, lymphadénopathie, la néphrite, la production ANA, et au niveau cellulaire, l'expansion des cellules T folliculaires auxiliaires (TFH), germinales cellules centre (GC) de B et les cellules plasmatiques.
Le modèle BM12 inductible est réalisé par le transfert adoptif de lymphocytes à partir de IA BM12 B6 (C) – H2 – Ab1 BM12 / KhEgJ (BM12) chez la souris, une souche identical de souris C57BL / 6 à l'exception de 3 substitutions d'acides aminés sur le CMH de classe II, en IA b / 6 (B6) des souris C57BL. Alloactivation des donateurs cellules T CD4 par bénéficiaire APC conduit à cGVHD avec des symptômes ressemblant étroitement SLE. Plus précisément, ils comprennent l'expansion de Tfh donateurs dérivés, l'expansion des cellules B GC bénéficiaires dérivés et les cellules plasmatiques, et la production d'Anas y compris les anti-ADN double brin, anti-ADNsb, anti-chromatine, et des anticorps anti-RBC 9. Au fil du temps, les souris receveuses développent glomérulonéphrite associée à des dépôts d'IgG dans le glomérulaire, interstitielle, et les régions vasculaires des reins 10. Nous avons récemment montré que, comme dans la maladie humaine, il y a également un rôle critique pour les IFN de type I dans 11 ce modèle. Notamment, les critères de définition des SLE humaine incluent le développement de la néphrite compatible avec SLE en présence d'anticorps anti-ADN anticorps 12, qui sont tous deux traits saillants de ce modèle de souris.
Il n'y a en soisieurs avantages du modèle de bm12 sur les modèles spontanés. Modèles classiques qui développent des signes SLE spontanément reposent sur soit des souches de souris hybrides, des souches de souris consanguines pas sur le fond de B6, ou grande loci génétiques sur le fond de B6, qui font traversant au coup de grâce ou de souris autrement génétiquement modifié difficile et fastidieux. Avec le modèle inductible de bm12, des souris génétiquement modifiées peuvent servir soit donneur ou du receveur, qui permet une identification plus rapide du compartiment cellulaire dans lequel des gènes particuliers peuvent être importants pour la maladie. En outre, le développement de la maladie dans le modèle de bm12 est beaucoup plus rapide, ne nécessitant que deux semaines jusqu'à l'apparition d'Anas, contre plusieurs mois pour les modèles les plus spontanées. En outre, à la différence des modèles spontanés qui développent la maladie à différents points dans le temps, le début et la progression de la maladie dans le modèle d'→ B6 BM12 est fortement synchronisés. Cela permet la génération de cohortes de taille appropriée qui peut Be utilisé pour les stratégies d'intervention ou thérapeutiques à tout stade de développement de la maladie.
Ce qui suit est un protocole détaillé pour initier SLE auto-immunité par le transfert adoptif de lymphocytes BM12 dans souris C57BL / 6, ou des variantes génétiques sur le fond de B6. En outre, nous décrivons un protocole de coloration par cytométrie de flux pour dénombrer Tfh, GC cellules B, les cellules plasmatiques et les types de cellules associées à la maladie humaine. Fait important, ces protocoles peuvent également être utilisés pour caractériser la plupart des maladies dans les modèles murins de lupus et identifier Tfh, les cellules B GC et les cellules plasmatiques dans d'autres modèles de maladie.
Le modèle inductible de BM12 est un moyen relativement simple et efficace pour étudier les processus cellulaires et moléculaires de SLE. L'activation chronique des cellules T CD4 par transfert adoptif dirigés contre les antigènes du soi conduit à l'accumulation de Tfh, GC cellules B, les cellules plasmatiques et qui peut être mesurée par cytométrie en flux, comme décrit ici. Les futures études utilisant ce modèle peut rapidement et facilement interroger le rôle des gènes candidats et de nouvelles t…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by the Lupus Research Institute, NCI grant CA138617, NIDDK grant DK090978, Charlotte Schmidlapp Award (to E.M.J.), and the Albert J. Ryan Fellowship (to J.K.). We are grateful for the support and instrumentation provided by the Research Flow Cytometry Core in the Division of Rheumatology at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, supported in part by NIH AR-47363, NIH DK78392 and NIH DK90971.
B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ | The Jackson Laboratory | 001162 | CD45.1+ BoyJ mouse strain |
B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ | The Jackson Laboratory | 001162 | Bm12 mouse strain |
FastDigest PsuI | Life Technologies | FD1554 | Restriction digest enzyme for genotyping |
1X RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
IMDM | GE Healthcare | SH30228.01 | |
Plasma Separation Tube (PST) | BD | 365974 | Blood collection tube with Dipotassium EDTA |
Serum Separation Tube (SST) | BD | 365967 | Blood collection tube with Clot activator / SST Gel |
Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | High density cell separation solution |
Lympholyte-M | Cedarlane | CL5030 | High density cell separation solution |
GL-7-biotin | eBioscience | 13-5902-82 | |
Streptavidin-BUV395 | BD | 564176 | |
CD138-BV421 | BioLegend | 142508 | |
CD4-BV510 | BioLegend | 100559 | |
TCRβ-BV605 | BD | 562840 | |
CD45.1-BV711 | BioLegend | 110739 | |
CD45.2-FITC | BioLegend | 109806 | |
PD-1-PE | BioLegend | 135206 | |
CD19-PerCP | BioLegend | 115532 | |
Fas-PE-Cy7 | BD | 557653 | |
CXCR5-APC | BioLegend | 145506 | |
Fixable Viability Dye ef780 | eBioscience | 65-0865-18 | |
CD4-BV421 | BioLegend | 100443 | |
1.2 ml FACS tube inserts, racked | USA Scientific | 1412-1400 | |
BD Falcon™ Round-Bottom Tubes | BD | 352017 |