This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.
The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain’s global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.
Optogenetische functionele magnetische resonantie imaging (ofMRI) is een nieuwe techniek die de ruimtelijke resolutie van high-field fMRI met de precisie van optogenetic stimulatie 1-11,38 combineert, waardoor celtype-specifieke kaart brengen van functionele neurale circuits en hun dynamiek in het hele hersenen. Optogenetics maakt specifieke celtypen te worden gericht op stimulatie door de introductie van lichtgevoelige transmembraan conductantie kanalen genoemd opsins. Specifieke elementen van neurale circuits zijn genetisch gemodificeerd om deze kanalen te drukken, waardoor milliseconde-tijdschaal modulatie van de activiteit in de hersenen intact 1-15. fMRI geeft een niet-invasieve werkwijze voor het bepalen globale dynamische reactie van de hersenen om optogenetic stimulatie van specifieke neurale circuits door middel van meting van de bloed-zuurstof-niveau-afhankelijke (BOLD) signaal 16-18, die een indirecte meting van neuronale activiteit verschaft.
De combinatie van deze twee technieken, genoemd optogenetic functionele magnetische resonantie imaging (ofMRI), is voordelig ten opzichte van andere methoden voor het registreren hersenactiviteit tijdens stimulatie zoals elektrofysiologie, omdat het zicht op de hele hersenen bij relatief hoge ruimtelijke resolutie kan leveren. Dit maakt de detectie van neuronale activiteit in reactie op stimulatie gericht op grote afstand van de plaats van stimulatie zonder dat invasieve implantatie van registrerende elektroden 1-11. ofMRI is voordelig ten opzichte van de traditionele methode van het uitvoeren van elektrische stimulatie gedurende fMRI, te rekruteren verschillende celtypes de elektroden en daarmee verwarren de causale invloed van elke populatie 19. Bovendien zijn de elektroden voor elektrische stimulatie en de opgewekte stroom kan artefacten produceren tijdens MRI 20. Inderdaad, ofMRI maakt de observatie van de invloed op de mondiale hersenactiviteit van de specifieke modulatieen van een grote verscheidenheid aan celtypen door middel van geavanceerde genetische targeting technieken zoals het Cre-Lox-systeem in transgene dieren of het gebruik van promotoren. Combinatorische optische controle met hele-brain monitoring mogelijk ofMRI door het gebruik van zowel NpHR remmen en ChR2 specifieke celtypen te wekken. De optogenetic toolkit beschikbaar voor gebruik in ofMRI is aan snelle verbetering in de tijd met de introductie van opsins met verhoogde lichtgevoeligheid of verbeterde kinetiek van gestabiliseerde stapfunctie opsins (SSFOs) of rood-verschoven opsins dat de vereiste geïmplanteerde vezel kan teniet optica, waardoor niet-invasieve beeldvorming tijdens stimulatie 21. Deze mogelijkheden zijn niet beschikbaar bij elektrische stimulatie.
Echter signaalartefacten gevolg van verwarming van weefsel door licht levering in de hersenen gerapporteerd 22, waarbij temperatuur geïnduceerde modificatie van relaxatietijden is aangetoond dat pseu producerendo activering. Onderzoekers uitvoeren ofMRI moet daarom bewust te zijn van dit potentieel verwarren. Met de juiste setup en controles, kan het probleem worden aangepakt. Bovendien kunnen betrekkelijk lage tijdsresolutie het meten van de hemodynamische respons in fMRI een beperkende factor voor bepaalde toepassingen van deze techniek.
Dit protocol worden eerst de constructie van de optische implantaten die levering van specifieke golflengten van licht mogelijk diep in de hersenen in vivo. Het protocol beschrijft dan de levering van de opsin codeert virale vector een nauwkeurige hersengebied middels stereotactische chirurgie. Vervolgens wordt het protocol beschrijft het proces van de hersenen als geheel functionele MRI bij gelijktijdig licht stimulatie. Ten slotte is het protocol schetst elementaire data-analyse van de verkregen gegevens.
Van de nota, de hier beschreven optogenetics vereisen een chronische implantaat voor lichte levering. De glasvezel implantaten stabiel en biocompatibel, waardoor longitudinale scannen en het onderzoek van neurale circuits gedurende een periode van maanden 23,24.
Kortom, de precieze stimulatie en hele hersenen monitoring mogelijkheden van ofMRI cruciale factoren maken ofMRI een krachtig hulpmiddel voor de studie van de connectomics van de hersenen. Bovendien kan het nieuwe inzicht in de mechanismen van neurologische aandoeningen 25 wanneer gekoppeld aan verschillende diermodellen verschaffen. Inderdaad, ofMRI gebruikt om de netwerkactiviteit afzonderlijke hippocampale subregio's geassocieerd met convulsies 8 helderen. Daarom zal laboratoria geïnteresseerd zijn in het beantwoorden van systemen-level neurowetenschap vragen deze techniek van belang te vinden.
Beweging van het subject tijdens de beeldvorming is een belangrijke bron van artefacten die kunnen leiden tot beschadiging van gegevens. Adequaat beveiligen van het dier op de imaging cradle kan een dergelijke artefacten te minimaliseren zal het handhaven van de juiste verdoving niveaus. Hier gebruikten we isofluraan maar alternatieve anesthetica, zoals medetomidine of ketamine en xylazine, moeten worden overwogen. Echter, de niveaus en de keuze van anesthesie vele parameters beïnvloeden de hersenen, waaronder de BOLD respons 28. Isofluraan kan veranderingen in neuronale prikkelbaarheid 29 veroorzaken. Andere anesthetica kan ook invloed hebben op GABA synaptische remming 30. Zo is de keuze van anesthesie is belangrijk bij het uitvoeren ofMRI gezien zijn vermogen om neuronale activiteit beïnvloeden. ofMRI in de afwezigheid van anesthesie is mogelijk, maar kan een uitdaging met verhoogde beweging van het dier, dat kan worden verlaagd als het dier gewend; zoals wakker ofMRI studies zijn eerder voerde eennd zou de verstorende invloed van verdoving op de hersenen 9,10 vermijden. Naverwerking motion correctie algoritmes kunnen worden gebruikt om de effecten van beweging sterk verminderen. Een aantal van deze methoden bestaan, met inbegrip van de inverse Gauss-Newton algoritme gebruikt in dit protocol, dat de som van de kwadraten kosten functie van het referentiegebied en het beeld minimaliseert onder correctie. Het algoritme is nuttig omdat het zorgt voor een snelle en krachtige beweging correctie, met behulp van een GPU parallel platform ontwerp tot de verwerking tijden 27 te verminderen.
Voor de wederopbouw van gegevens in dit protocol, werd op maat geschreven software in een MATLAB-omgeving gebruikt voor twee-dimensionale netten in de wederopbouw, waar de spiraal monsters in k-ruimte worden omgebouwd tot gerasterde beelden 31-33. Tijdreeksgegevens werden gegenereerd door het berekenen van het percentage modulatie van het BOLD signaal van elk voxel ten opzichte van de basislijn periode voorafgaand aan stimulatie verzameld. Voxels waarvan tijdreeksen werden synchroniseerd met blokken optogenetic stimulatie met een coherentie waarde van 0,35 of meer werd gedefinieerd als geactiveerde voxels; deze samenhang komt overeen met minder dan 10 -9 P waarde 8. Samenhang waarden werden berekend als de grootte van de Fourier transformatie van de herhalingsfrequentie van de stimulatie cycli gedeeld door de som van kwadraten van alle frequentiecomponenten 8,27. Familywise fout kan worden geregeld met de Bonferroni-correctie voor meerdere vergelijkingen. Andere analysemethoden kunnen worden gebruikt, waaronder parametrische statistische tests zoals de algemene lineaire modellen (GLMS). De samenhang methode vereist minder voorkennis van de HRF vergelijking met de conventionele algemene lineaire model. Daarom is het voordelig bij het verkennen van gegevens met behulp ofMRI. Echter, de samenhang methode alleen gebruikt worden voor gegevens blokontwerpen of geselecteerde evenementgerelateerde ontwerpen met een vast interval interstimulus en kunnen niet worden gebruikt ofMRI gegevens met andere event-related ontwerpt of gemengde ontwerpen. Vervolgens kan dynamische causale modellering (DCM) worden gebruikt om de interacties tussen hersengebieden geïdentificeerd door middel van ofMRI analyseren. DCM is een Bayesian statistische techniek ontwikkeld voor de analyse van functionele connectiviteit van het systeem reacties op experimentele inputs tijdens fMRI 34.
Aanvullende technische problemen voor ofMRI komen hier aan bod. Implantaten kunnen worden beschadigd of vallen, waardoor het verwijderen van het zieke dier uit de studie. Re-implantatie operaties worden niet aanbevolen als gevolg van de extra onzekerheid van zich te richten op dezelfde ROI als in het oorspronkelijke implantatie chirurgie en als gevolg van dierenwelzijn. Vanwege de aanzienlijke hoeveelheid tijd en middelen die in elk dierlijk subject, onderzoek van de sterkte van het materiaal is een belangrijke zorg bij het kiezen van een geschikte tandheelkundig cement voor gebruik in ofMRI studies. De implantatie chirurgie is een kritische factor bij het maximaliseren van de levensduur van de Implant en dierlijke patiënt. Bijvoorbeeld, ervoor te zorgen dat de schedel droog is voor het aanbrengen van de tandheelkundige cement en het plaatsen van een voldoende hoeveelheid cement rond de keramische ring implantaat kan zorgen voor stabiliteit over de mogelijke maanden durende tijdlijn van het dier tijdens de studie. Daarnaast kunnen alternatieve ontwerpen kooi worden onderzocht en met de lokale dier zorginstelling besproken kooien met draad toppen die het voedsel en water dat vaak steken in de kooi te voorkomen en bieden mogelijkheden voor het dier om het implantaat beschadigen. Belangrijk is dat de tandheelkundige cement zorgvuldig worden gekozen om artefacten die invloed beeldvorming en andere cementen kan worden getest door toepassing op een fantoom en beeldvorming in een scanner voor gebruik bij dierproeven verminderen. Trial and error met diverse tandheelkundige cement heeft aangetoond dat de cement gebruikt in dit protocol geeft relatief weinig artefacten. Een ander technisch probleem bij het uitvoeren ofMRI is de nauwkeurigheid van vezeloptische plaatsing op de beoogde ROI, gezien de extremely kleine afstanden die kunnen bestaan tussen kernen in de hersenen 35. Na de implantatie operaties kunnen T2-gewogen anatomische scans worden gebruikt om correcte plaatsing bepalen bedekken op een hersenatlas. De vaardigheid van de chirurg en de praktijk uitvoeren van deze operaties kunnen verbeteren juiste plaatsingspercentages. De specificiteit en expressie van het opsin bij de beoogde ROI kan aan het einde van de studie worden geverifieerd door perfuseren het dier en de vaststelling van de hersenen, met behulp van immunohistochemie of de endogene fluorescentie van een reporter-eiwit tag aan de opsin voor visualisatie. Deze reporter eiwitten kunnen ook worden colocalized met andere eiwitten zodat de opsin wordt uitgedrukt in de gewenste neurale celtypes 1,8,15,25. Zoals eerder vermeld, kunnen artefacten ontstaan bij het uitvoeren ofMRI door verwarming van weefsel tegen licht aflevering 22. Het weefsel verwarmen veroorzaakt modificatie van relaxatietijden, waardoor valse BOLD signaal. Om ervoor te zorgen dat acactivatie gevolg van lichte stimulatie tijdens ofMRI niet door deze artefact zou opsin-negatieve controles worden uitgevoerd waarbij ofwel zoutoplossing geïnjecteerde dieren of dieren geïnjecteerd met controle fluorofoor vectoren (zoals AAV-CaMKIIa-EYFP) ondergaan ofMRI. Daarnaast moet alleen goed gevormde glasvezel implantaten met goede lichttransmissie efficiëntie worden om de noodzaak hoge laservermogens gebruiken verwijderen. ofMRI studies zijn uitgevoerd waarbij valse activering als gevolg van weefsel verwarming is niet een probleem 1,6-8,10,11 geweest.
Wat de keuze van vector de vereiste optogenetic genen in neuronen voor expressie, zijn AAV niet bekend dat zij ziekten bij mensen veroorzaken en dus een handige optie, aangezien het lagere bioveiligheidsniveau moeten deze middelen (BSL-1) gebruikt. Daarnaast is een groot aantal kernen vector dragen AAV verpakt samen met optogenetic genen in voorraad en met meerdere serotypen. Het serotype van AAV worden gekozen based op de beoogde celpopulatie optimale expressieniveaus 36,37 waarborgen. Lentivirussen kunnen ook worden gebruikt, maar vereisen een hogere bioveiligheidsniveau. De tijd die nodig is voor voldoende expressie van de genen optogenetic hangt mede af van de specifieke gebruikte diermodel, de specifieke gebruikte AAV en de specifieke experimentele paradigma. In dit protocol wordt Sprague Dawley ratten van 11 weken oud gebruikt en optogenetic studies beginnen 4-6 weken na injectie virus. Transgene muizen kunnen ook worden gebruikt in optogenetic studies. Er moeten proefprojecten uitvoeren om de specifieke hoeveelheid tijd die voldoende expressie van het opsins bepalen. Stimulatie paradigma kan variëren afhankelijk van de specifieke gebruikte opsin. In dit protocol wordt AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP gebruikt en de stimulatie paradigma 20 seconden aan / 40 sec uit. Bij gebruik van een SSFO, zal de stimulatie paradigma variëren omdat de SSFO vereist slechts een korte lichtpuls om ac te zijnveerd en vervolgens een korte lichtpuls in andere golflengte worden beëindigd.
Een bijkomend cruciaal punt van zorg bij het uitvoeren van ofMRI wordt voorkomen dat het licht lekkage uit het beentje implantaat interface met glasvezel patchkabel tijdens optogenetic stimulatie om een verwarrende hersenen signaal afkomstig van visuele stimulatie te voorkomen, zelfs wanneer het dier is verdoofd. Kegels zwarte elektrische tape kan worden gebruikt om het licht van de ferrules blokkeren en de ogen van het dier in kwestie. Belangrijk is dat fysiologische waarden waaronder uitgeademde CO2 en de lichaamstemperatuur van de patiënt goed worden gehandhaafd gedurende de duur van de beeldvorming. Expiratoire CO 2 worden bewaard tussen 3-4% en de lichaamstemperatuur op 37 ° C. Bovendien, de vulplaten sequenties inhomogeniteit zoveel mogelijk te beperken in het magnetisch veld voor het starten ofMRI scant sterk bepalend voor de kwaliteit van de verkregen data BOLD. Controle van deze factorenis van cruciaal belang in het produceren van betrouwbare ofMRI data. In dit protocol worden DPSS lasers gebruikt als lichtbron voor optogenetic stimulatie. Omdat laserlicht coherent, kan meer dan genoeg vermogen gemakkelijk worden geleverd via de glasvezel. LED lichtbronnen gekoppeld met glasvezel zijn verkrijgbaar bij commerciële leveranciers, maar hebben het nadeel van verminderde kracht van lichttransmissie. De laser lichtbron vereist aanpassing aan elke specifieke fiber optic patch-kabel, maar met de praktijk, kan de uitlijning worden bereikt binnen enkele seconden tot minuten.
Toekomstige toepassingen van ofMRI omvatten het gebruik van de volgende generatie opsins zoals rood-verschoven opsins voor niet-invasieve beeldvorming stimulatie tijdens schakelen. Bovendien kan de implantatie van MRI-compatibele EEG of soortgelijke registrerende elektroden met de vezeloptische implantaat oog op het verkrijgen van gegevens met hoge resolutie temporele naast de hoge ruimtelijke resolutie gegevens van MRI. ofMRI met electrophysiological opname kan uitgebreide informatie over de functionele connectiviteit van de hersenen te bieden. Samengevat, de kracht van ofMRI de gehele hersenen bewaken in reactie op het stimuleren van specifieke celpopulaties gedefinieerd door genetische of anatomische identiteit maakt ofMRI een essentieel instrument voor gebruik in de studie van neurologische aandoeningen en de connectomics van de gezonde hersenen.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported through funding from the NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), Okawa Foundation Research Grant Award, NIH Director’s New Innovator Award (1DP2OD007265), the NSF CAREER Award (1056008), and the Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. would like to thank Karl Deisseroth for providing the DNA plasmids used for the optogenetic experiments. The authors would also like to thank Andrew Weitz and Mankin Choy for editing the manuscript and all the Lee Lab members for their assistance with the ofMRI experiments.
7 Tesla scanner | Agilent Technologies | Discovery MR901 System | |
Sprague Dawley rats | Charles River | Crl:SD | 11 weeks old |
fiber cleaver | Fujikura | CT-05 | |
multimode optical fiber | Thor Labs | AFS105/125Y | |
fiber stripper | Thor Labs | T08S13 | |
ceramic split sleeve | Precision Fiber Products | SM-CS1140S | |
epoxy glue | Thor Labs | G14250 | |
cotton-tipped applicators | Stoelting Co. | 50975 | |
multimode ceramic zirconia ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2002 | |
FC/PC multimode connector | Thor Labs | 30128C3 | |
fiber optic polishing disk | Precision Fiber Products | M1-80754 | |
aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm | Thor Labs | LFG03P | |
aluminum oxide lapping sheet, 1 µm | Thor Labs | LFG1P | |
aluminum oxide lapping sheet, 3 µm | Thor Labs | LFG3P | |
binocular biological microscope 40X-1000X | Amscope | B100 | |
laser safety glasses | Kentek | KXL-62W01 | |
473 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0473 | |
594 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0594 | |
Allen hex wrench set | 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser | ||
power meter, Si Sensor, 400-1100 nm | Thor Labs | PM121D | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | |
isoflurane vaporizer with induction chamber | VetEquip | 901806 | |
NanoFil 100uL syringe | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | |
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
function generator | A.M.P.I. | Master-8 | |
small animal stereotax | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Model 683 small animal ventilator | Harvard Apparatus | 550000 | |
Type 340 capnograph | Harvard Apparatus | 733809 | |
dental drill (rotary micromotor kit) | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
ophthalmic ointment (Artificial Tears) | Rugby | 00536-6550-91 | |
instrument sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | glass bead sterilizer |
antibiotic powder | Pfizer | NEO-PREDEF | neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride |
buprenorphine painkiller | Hospira | NDC:0409-2012 | schedule III controlled substance , 0.3 mg/mL stock |