This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.
The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain’s global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.
علم البصريات الوراثي التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (ofMRI) هو أسلوب الرواية التي تجمع بين دقة مكانية عالية الميداني الرنين المغناطيسي الوظيفي مع دقة التحفيز علم البصريات الوراثي 1-11،38، مما يتيح نوع محدد خلية رسم خرائط الدوائر العصبية الوظيفية وديناميتها في كل أنحاء الدماغ. علم البصريات الوراثي يسمح لأنواع معينة من الخلايا لتكون هدفا للالتحفيز عن طريق إدخال قنوات تصرف العابرة للغشاء، ودعا opsins حساسة للضوء. يتم تعديل عناصر محددة من الدوائر العصبية وراثيا للتعبير عن هذه القنوات، مما يتيح تعديل ميلي ثانية واحدة، الجدول الزمني للنشاط في الدماغ سليمة 15/01. يوفر الرنين المغناطيسي الوظيفي طريقة غير الغازية لتحديد الاستجابة الديناميكية العالمية في الدماغ لتحفيز علم البصريات الوراثي من الدوائر العصبية المحددة من خلال قياس (BOLD) إشارة يتوقف الدم الأكسجين على المستوى-16-18، التي تنص على القياس غير المباشر لنشاط الخلايا العصبية.
الجمع بين هذه التقنيات اثنين، ويطلق عليه علم البصريات الوراثي التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (ofMRI)، هو مفيد خلال وسائل أخرى للنشاط الدماغ تسجيل خلال التحفيز مثل الكهربية لأنها يمكن أن توفر إطلالة على الدماغ بأكمله في قرار مكانية عالية نسبيا. هذا يمكن من اكتشاف نشاط الخلايا العصبية في استجابة لتحفيز المستهدفة على مسافات بعيدة من موقع التحفيز دون الحاجة لزرع أقطاب تسجيل الغازية 1-11. ofMRI هو مفيد أكثر من طريقة أكثر تقليدية من أداء التحفيز الكهربائي خلال الرنين المغناطيسي الوظيفي، والتي يمكن توظيف أنواع مختلفة من الخلايا بالقرب من القطب وبالتالي الخلط بين التأثير السببي للكل السكان 19. وبالإضافة إلى ذلك، الأقطاب الكهربائية المستخدمة في التحفيز الكهربائي والتيار ولدت يمكن أن تنتج القطع الأثرية خلال التصوير بالرنين المغناطيسي (20). في الواقع، ofMRI تمكن من مراقبة تأثير على نشاط الدماغ العالمي من modulati محددعلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا من خلال استخدام تقنيات الاستهداف الجيني متقدمة مثل نظام لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن في الحيوانات المعدلة وراثيا أو استخدام المروجين. التحكم البصري اندماجي مع مراقبة كامل الدماغ ممكنة مع ofMRI من خلال استخدام كل NpHR لمنع وChR2 لإثارة أنواع معينة من الخلايا. مجموعة أدوات علم البصريات الوراثي المتاحة للاستخدام في ofMRI كما تتحسن بسرعة مع مرور الوقت مع إدخال opsins مع زيادة الحساسية الخفيفة أو تحسين حركية، من استقرت opsins وظيفة خطوة (SSFOs) أو من opsins الحمراء تحولت قد ينفي الحاجة إلى الألياف المزروع والبصريات، وتمكين التحفيز غير الغازية أثناء التصوير 21. هذه الاحتمالات غير متوفرة مع التحفيز الكهربائي.
ومع ذلك، فقد تم الإبلاغ عن القطع الأثرية إشارة الناتجة عن تسخين الأنسجة بسبب تسليم خفيفة في الدماغ 22، حيث تبين أن التعديل الناجم عن درجة حرارة مرات الاسترخاء لإنتاج pseuالقيام التنشيط. ولذلك ينبغي على الباحثين أداء ofMRI على بينة من هذا نخلط المحتملين. مع الإعداد السليم والضوابط، ويمكن معالجة هذه المسألة. بالإضافة إلى ذلك، منخفضة نسبيا القرار الزماني لقياس استجابة الدورة الدموية في الرنين المغناطيسي الوظيفي قد يكون عاملا مقيدا لتطبيقات معينة من هذه التقنية.
هذا البروتوكول يصف أولا بناء يزرع الألياف البصرية التي تتيح تسليم موجات محددة من الضوء في عمق الدماغ في الجسم الحي. ثم يصف بروتوكول تسليم ناقلات فيروسية ترميز أوبسين الى منطقة في الدماغ دقة باستخدام جراحة المجسم. التالي بروتوكول يصف عملية التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي كامل الدماغ خلال التحفيز خفيفة في وقت واحد. وأخيرا، يحدد بروتوكول تحليل البيانات الأساسية من البيانات التي يحصل عليها.
من المذكرة، وعلم البصريات الوراثي هو موضح هنا يتطلب زرع المزمن للتسليم الضوء. ومع ذلك، فإن عملية زرع الألياف البصرية مستقرة والحيويةمتوافقة، والسماح للمسح الضوئي الطولي والتحقيق في الدوائر العصبية على مدى أشهر 23،24.
وباختصار، فإن التحفيز دقيق وكامل الدماغ مراقبة قدرة ofMRI عوامل حاسمة في اتخاذ ofMRI أداة قوية لدراسة connectomics من الدماغ. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تقدم نظرة جديدة في آليات الأمراض العصبية 25 عندما يقترن مع نماذج حيوانية مختلفة. في الواقع، وقد استخدم ofMRI لإلقاء الضوء على نشاط الشبكة من المناطق الفرعية الحصين متميزة المرتبطة المضبوطات 8. ولذلك، فإن المختبرات المهتمة في الإجابة على أسئلة علم الأعصاب على مستوى النظم تجد هذه التقنية من أهمية.
الحركة في هذا الموضوع أثناء التصوير هي مصدر كبير من القطع الأثرية التي يمكن أن تؤدي إلى تلف البيانات. تأمين بشكل مناسب الحيوان على مهد التصوير يمكن التقليل من هذه القطع الأثرية كما سيتم الحفاظ على مستويات التخدير المناسبة. هنا، كنا الأيزوفلورين لكن التخدير بديلة، مثل medetomidine أو الكيتامين وزيلازين، ينبغي النظر أيضا. ومع ذلك، يمكن للمستويات واختيار من مخدر يؤثر على العديد من المعلمات في الدماغ، بما في ذلك الاستجابة BOLD 28. الأيزوفلورين يمكن أن تسبب تغيرات في استثارة الخلايا العصبية 29. يمكن التخدير أخرى أيضا تؤثر على GABA تثبيط متشابك 30. وهكذا، واختيار من التخدير هو المهم عند تنفيذ ofMRI نظرا قدرتها على قد يؤثر على نشاط الخلايا العصبية. ofMRI في غياب التخدير من الممكن ولكن يمكن أن يكون تحديا مع زيادة حركة من الحيوان، والتي يمكن أن تخفض إذا كان الحيوان الذي تعود. وقد سبق إجراء مثل هذه الدراسات ofMRI مستيقظا لالثانية أن تجنب الخلط ما بين أثر التخدير على الدماغ 9،10. معالجة ما بعد خوارزميات تصحيح الحركة يمكن استخدامها للتخفيف كثيرا من آثار الحركة. العديد من هذه الطرق موجودة، بما في ذلك معكوس جاوس-نيوتن الخوارزمية المستخدمة في هذا البروتوكول، الذي يقلل من مجموع دالة التكاليف الساحات الصورة المرجعية وصورة تحت التصحيح. الخوارزمية هي مفيدة لأنه يمكن تصحيح الحركة سريع وقوي، وذلك باستخدام الجرافيك تصميم منصة موازية لتقليل أوقات معالجة 27.
لإعادة الإعمار البيانات في هذا البروتوكول، واستخدام برامج مكتوبة مخصصة في بيئة MATLAB لإعادة الإعمار gridding ثنائي الأبعاد، حيث يتم بناؤها عينات دوامة في ك الفضاء إلى صور الشبكية 31-33. تم إنشاء بيانات السلاسل الزمنية عن طريق حساب تعديل في المئة من إشارة جريئة من كل فوكسل نسبة إلى فترة الأساس التي تم جمعها قبل التحفيز. تم SYN Voxels الذي السلاسل الزمنيةchronized إلى كتل من التحفيز علم البصريات الوراثي مع قيمة التماسك من 0.35 أو أكثر تم تعريفها بأنها voxels المنشط؛ هذه القيمة التماسك يناظر أقل من 10 -9 قيمة P 8. تم حساب قيم التماسك كما أن حجم تحويل فورييه في وتيرة دورات التحفيز المتكرر مقسوما على الساحات مبلغ من بين جميع مكونات تردد 8،27. يمكن التحكم خطأ Familywise باستخدام تصحيح بونفيروني للمقارنات متعددة. طرق بديلة للتحليل يمكن استخدامها، بما في ذلك الاختبارات الإحصائية المعلمية مثل النموذج الخطي العام (GLMs). وتتطلب هذه الطريقة تماسك المعرفة أقل مسبقة من قوة حقوق الإنسان بالمقارنة مع النموذج الخطي العام التقليدي. لذلك، فإنه من المفيد عند استكشاف البيانات باستخدام ofMRI. ومع ذلك، فإن طريقة الترابط يمكن فقط استخدام البيانات مع تصاميم كتلة أو اختيار التصاميم ذات الصلة بالحدث مع ثابت interstimulus الفاصل، ولا يجوز استخدامها في البيانات ofMRI مع غيرها من الحدث RELAتيد التصاميم أو تصاميم مختلطة. وفي وقت لاحق، والنمذجة السببية الحيوي (DCM) يمكن استخدامها لتحليل التفاعلات بين مناطق الدماغ التي تم تحديدها من خلال ofMRI. • قرار مجلس الوزراء هو تقنية إحصائية النظرية الافتراضية المتقدمة لتحليل الربط الوظيفي من استجابات النظام على المدخلات التجريبية خلال الرنين المغناطيسي الوظيفي (34).
وتناقش مشاكل فنية إضافية لofMRI هنا. يزرع يمكن أن تتلف أو تسقط، مما يؤدي إلى إزالة حيوان مصاب من الدراسة. لا ينصح جراحات إعادة زرع نظرا لعدم اليقين استهداف نفس العائد على الاستثمار كما في جراحة زرع الأصلية وبسبب قضايا الرفق بالحيوان. بسبب قدرا كبيرا من الوقت والموارد المستثمرة في كل موضوع الحيوان، النظر في قوة المادة هو مصدر قلق كبير عند اختيار الاسمنت الأسنان مناسبة للاستخدام في الدراسات ofMRI. جراحة زرع عاملا هاما في زيادة طول العمر للimplanر وتخضع الحيوانات. على سبيل المثال، وضمان أن الجمجمة جافة قبل تطبيق الاسمنت الأسنان ووضع كمية كافية من الاسمنت حول زرع الطويق السيراميك يمكن ضمان الاستقرار على مدى زمني طويل أشهر المحتملة للحيوان أثناء الدراسة. بالإضافة إلى ذلك، تصاميم قفص بديلة يمكن استكشاف ومناقشة مع مرفق الرعاية للحيوانات المحلية لتجنب أقفاص مع قمم سلك عقد الغذاء والماء التي غالبا ما تبرز في قفص وتوفير فرص للحيوان إلى تلف الزرع. الأهم من ذلك، يجب اختيار الاسمنت الأسنان بعناية للحد من الأعمال الفنية التي تؤثر على التصوير والأسمنت البديلة يمكن اختبارها من قبل التطبيق على شبحا والتصوير في الماسحة الضوئية قبل استخدامها في التجارب على الحيوانات. وقد أظهرت التجربة والخطأ مع مختلف والأسمنت الأسنان التي الاسمنت المستخدمة في هذا البروتوكول يعطي عدد قليل نسبيا من الأعمال الفنية. التحدي التقني آخر في أداء ofMRI هو دقة وضع الألياف البصرية في العائد على الاستثمار المنشود، نظرا لEXTRمسافات صغيرة emely التي يمكن أن توجد بين نوى في الدماغ 35. بعد الانتهاء من العمليات الجراحية زرع والمسح الضوئي التشريحية T2 المرجحة يمكن استخدامها لتحديد موضع الصحيح عن طريق تغطية على أطلس الدماغ. مهارة الجراح وممارسة إجراء هذه العمليات يمكن أن تحسن معدلات التوظيف الصحيح. خصوصية والتعبير عن أوبسين في العائد على الاستثمار المقصود يمكن التحقق في ختام الدراسة التي perfusing الحيوان وتحديد الدماغ، وذلك باستخدام المناعية أو مضان الذاتية مراسل البروتين الموسومة إلى أوبسين التصور. ويمكن أيضا أن هذه البروتينات مراسل أن colocalized مع بروتينات أخرى للتأكد من أن يتم التعبير عن أوبسين في أنواع الخلايا العصبية المطلوب 1،8،15،25. كما ذكرنا سابقا، يمكن أن تنشأ عند تنفيذ الأعمال الفنية ofMRI بسبب التدفئة الأنسجة من تسليم الخفيف 22. يؤدي تسخين الأنسجة تعديل اوقات الاسترخاء، مما أدى في إشارة جريئة كاذبة. للتأكد من أن ميلانيحصر تفعيل الناتجة عن التحفيز خفيفة خلال ofMRI لا يعود إلى هذه الأداة، يجب أن يتم تنفيذ الضوابط أوبسين السلبي الذي إما المالحة حقن الحيوانات أو الحيوانات المحقونة مع ناقلات السيطرة fluorophore (مثل AAV-CaMKIIa-EYFP) تخضع ofMRI. بالإضافة إلى ذلك، الألياف فقط شيدت بشكل جيد يزرع البصرية جيدة مع كفاءة انتقال الخفيفة ينبغي أن تستخدم لإزالة الحاجة إلى استخدام الصلاحيات ليزر عالية. وقد أجريت دراسات ofMRI الذي تفعيل كاذبة بسبب التدفئة الأنسجة لم تكن مسألة 1،6-8،10،11.
فيما يتعلق باختيار متجه لإدخال الجينات علم البصريات الوراثي المطلوبة في الخلايا العصبية للتعبير، ليست معروفة AAVS أن تسبب المرض لدى البشر، وبالتالي فهي خيار مناسب، نظرا لمستوى السلامة الأحيائية أقل المطلوبة لاستخدام هذه العوامل (BSL-1). وبالإضافة إلى ذلك، العديد من النوى ناقلات تحمل AAVS حزم مع الجينات المختلفة علم البصريات الوراثي في الأسهم ومع الأنماط المصلية متعددة. يجب اختيار النمط المصلي من AAV بASED على الهدف سكان الخلية تهدف إلى ضمان مستويات التعبير الأمثل 36،37. ويمكن أيضا أن تستخدم Lentiviruses ولكنها تتطلب مستوى أعلى للسلامة الأحيائية. الفترة الزمنية اللازمة ليكفي للتعبير عن الجينات علم البصريات الوراثي متغيرة اعتمادا على نموذج حيواني المحددة المستخدمة، على AAV معين المستخدمة وعلى النموذج التجريبي محددة. في هذا البروتوكول، وتستخدم الفئران سبراغ داولي في 11 أسابيع من العمر ودراسات علم البصريات الوراثي يبدأ أربعة إلى ستة أسابيع بعد الحقن بالفيروس. ويمكن أيضا أن الفئران المعدلة وراثيا يمكن استخدامها في دراسات علم البصريات الوراثي. فمن الضروري لأداء التجارب الرائدة لتحديد كمية محددة من الوقت اللازم للتعبير كاف من opsins. نماذج التحفيز يمكن أن تختلف تبعا لأوبسين المحددة المستخدمة. في هذا البروتوكول، يتم استخدام AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP ونموذج التحفيز هو 20 ثانية على / 40 ثانية قبالة. إذا باستخدام SSFO، فإن نموذج التحفيز تختلف لأن SSFO يتطلب سوى نبضة قصيرة من الضوء ليكون ميلانtivated ثم نبضة قصيرة من الضوء في الطول الموجي آخر سيتم إنهاؤها.
لقلق بالغ إضافي عند تنفيذ ofMRI يمنع تسرب الضوء من واجهة زرع الطويق مع كابل الألياف البصرية التصحيح خلال التحفيز علم البصريات الوراثي للحيلولة دون إشارة الدماغ التباس القادمة من التحفيز البصري، حتى عندما يتم تخدير الحيوان. مخاريط من الشريط الكهربائي الأسود يمكن أن تستخدم لمنع الضوء من الحلقات ولتغطية أعين الحيوان. الأهم من ذلك، القيم الفسيولوجية بما في ذلك الزفير CO 2 ودرجة حرارة الجسم للموضوع يجب أن يبقي بشكل صحيح طوال فترة التصوير. يجب أن تبقى الزفير CO 2 بين 3-4٪ ودرجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تسلسل الملئ للحد قدر ممكن التجانس في الحقل المغناطيسي للأرض قبل البدء ofMRI بمسح كثيرا يحدد نوعية البيانات BOLD الناتجة عن ذلك. السيطرة على هذه العواملأمر بالغ الأهمية في إنتاج البيانات ofMRI موثوقة. في هذا البروتوكول، وتستخدم أشعة الليزر DPSS كمصدر للضوء لتحفيز علم البصريات الوراثي. بسبب ضوء الليزر هو متماسك، أكثر من ما يكفي من القوة يمكن توفيره بسهولة من خلال الألياف البصرية. هي مصادر الضوء LED بالإضافة إلى الألياف البصرية المتاحة من الباعة التجارية، ولكن لديها عيب السلطة انخفض من انتقال الضوء. مصدر ضوء الليزر لا تتطلب محاذاة إلى كل كابلات الألياف البصرية التصحيح معين، ولكن مع الممارسة، والمحاذاة ويمكن تحقيق ذلك في غضون ثوان إلى دقائق.
وتشمل التطبيقات المستقبلية من ofMRI استخدام opsins الجيل القادم مثل opsins الحمراء تحولت إلى تمكين التحفيز غير الغازية أثناء التصوير. بالإضافة إلى ذلك، يمكن غرس التصوير بالرنين المغناطيسي متوافق مع التخطيط الدماغي أو أقطاب تسجيل مماثلة مع زرع الألياف البصرية تسمح للحصول على بيانات عالية الدقة الزمنية بالإضافة إلى البيانات المكانية قرار عالية من التصوير بالرنين المغناطيسي. ofMRI مع electrophysiolتسجيل ogical يمكن أن توفر معلومات مستفيضة عن الربط الوظيفي للدماغ. وباختصار، فإن قوة ofMRI لمراقبة الدماغ بأكمله في الاستجابة لتحفيز السكان خلية معينة تحددها هوية جينية أو تشريحية يجعل ofMRI أداة حاسمة لاستخدامها في دراسة الأمراض العصبية ومن connectomics من الدماغ بصحة جيدة.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported through funding from the NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), Okawa Foundation Research Grant Award, NIH Director’s New Innovator Award (1DP2OD007265), the NSF CAREER Award (1056008), and the Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. would like to thank Karl Deisseroth for providing the DNA plasmids used for the optogenetic experiments. The authors would also like to thank Andrew Weitz and Mankin Choy for editing the manuscript and all the Lee Lab members for their assistance with the ofMRI experiments.
7 Tesla scanner | Agilent Technologies | Discovery MR901 System | |
Sprague Dawley rats | Charles River | Crl:SD | 11 weeks old |
fiber cleaver | Fujikura | CT-05 | |
multimode optical fiber | Thor Labs | AFS105/125Y | |
fiber stripper | Thor Labs | T08S13 | |
ceramic split sleeve | Precision Fiber Products | SM-CS1140S | |
epoxy glue | Thor Labs | G14250 | |
cotton-tipped applicators | Stoelting Co. | 50975 | |
multimode ceramic zirconia ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2002 | |
FC/PC multimode connector | Thor Labs | 30128C3 | |
fiber optic polishing disk | Precision Fiber Products | M1-80754 | |
aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm | Thor Labs | LFG03P | |
aluminum oxide lapping sheet, 1 µm | Thor Labs | LFG1P | |
aluminum oxide lapping sheet, 3 µm | Thor Labs | LFG3P | |
binocular biological microscope 40X-1000X | Amscope | B100 | |
laser safety glasses | Kentek | KXL-62W01 | |
473 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0473 | |
594 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0594 | |
Allen hex wrench set | 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser | ||
power meter, Si Sensor, 400-1100 nm | Thor Labs | PM121D | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | |
isoflurane vaporizer with induction chamber | VetEquip | 901806 | |
NanoFil 100uL syringe | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | |
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
function generator | A.M.P.I. | Master-8 | |
small animal stereotax | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Model 683 small animal ventilator | Harvard Apparatus | 550000 | |
Type 340 capnograph | Harvard Apparatus | 733809 | |
dental drill (rotary micromotor kit) | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
ophthalmic ointment (Artificial Tears) | Rugby | 00536-6550-91 | |
instrument sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | glass bead sterilizer |
antibiotic powder | Pfizer | NEO-PREDEF | neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride |
buprenorphine painkiller | Hospira | NDC:0409-2012 | schedule III controlled substance , 0.3 mg/mL stock |