This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.
The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain’s global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.
Optogenetic funktionel magnetisk resonans (ofMRI) er en ny teknik, der kombinerer den rumlige opløsning af høj felt fMRI med præcision optogenetic stimulering 1-11,38, så celletype-specifik kortlægning af funktionelle neurale kredsløb og deres dynamik i hele hjerne. Optogenetics muliggør specifikke celletyper, der skal målrettes til stimulering af indførelsen af lysfølsomme trans-membrankonduktans kanaler, kaldet opsiner. Specifikke elementer af neurale kredsløb er genetisk modificeret til at udtrykke disse kanaler, så millisekund-tidsskala modulation af aktivitet i den intakte hjerne 1-15. fMRI tilvejebringer en ikke-invasiv fremgangsmåde til bestemmelse af hjernens globale dynamiske respons på optogenetic stimulering af specifikke neurale kredsløb gennem måling af blod-ilt-niveau-afhængig (fed) signal 16-18, hvilket giver en indirekte måling af neuronal aktivitet.
Kombinationen af disse to teknikker, betegnet optogenetic funktionel magnetisk resonans (ofMRI), er fordelagtig i forhold til andre metoder til optagelse hjernens aktivitet under stimulering såsom elektrofysiologi fordi det kan tilvejebringe en visning af hele hjernen ved relativt høj rumlig opløsning. Dette muliggør påvisning af neuronal aktivitet som respons på målrettet stimulation ved store afstande fra stedet for stimulering uden behov for implantering af invasive registreringselektroder 1-11. ofMRI er fordelagtig i forhold den mere traditionelle fremgangsmåde til udførelse af elektrisk stimulering under fMRI, som kan rekruttere forskellige celletyper nær elektroden og dermed forvirre den kausale indflydelse hver population 19. Desuden elektroderne anvendes til elektrisk stimulering og den genererede strøm kan producere artefakter under MR-billeddannelse 20. Faktisk ofMRI muliggør observation af indflydelse på den globale hjerne aktivitet fra den specifikke modulatipå af en bred række celletyper gennem brug af avancerede genetiske targeting teknikker såsom Cre-Lox-system i transgene dyr eller anvendelse af promotorer. Kombinatorisk optisk kontrol med hel-hjerne overvågning er mulig med ofMRI gennem brug af både NpHR at inhibere og CHR2 at excitere specifikke celletyper. Den optogenetic værktøjskasse til rådighed til brug i ofMRI også hurtigt bedre over tid med indførelsen af opsiner med øget lysfølsomhed eller forbedrede kinetik, af stabiliserede trinfunktions opsiner (SSFOs) eller af rød-skiftet opsiner som kan ophæve kravet om implanterede fiber optik, der gør det muligt ikke-invasiv stimulation under billedbehandling 21. Disse muligheder er ikke tilgængelige med elektrisk stimulering.
Imidlertid har signalartefakter følge af opvarmning af væv på grund af lys levering i hjernen blevet rapporteret 22, hvor temperaturen induceret ændring af relaksationstider er blevet vist at producere pseugøre aktivering. Forskere udfører ofMRI bør derfor være opmærksomme på denne potentielle forvirre. Med den rette opsætning og kontrol, kan problemet løses. Yderligere kan relativt lav tidsmæssig opløsning til måling af hæmodynamiske respons i fMRI være en begrænsende faktor for visse anvendelser af denne teknik.
Denne protokol beskrives først opbygningen af de fiberoptiske implantater, der muliggør levering af specifikke lysbølgelængder dybt ind i hjernen in vivo. Protokollen beskriver derefter leveringen af opsin-kodende viral vektor til en præcis hjerne region under anvendelse stereotaktisk kirurgi. Næste protokollen beskriver processen med hel-hjerne funktionel MRI ved samtidig lys stimulation. Endelig protokollen skitserer grundlæggende data analyse af de indsamlede data.
Af note, der er beskrevet her optogenetics kræver en kronisk implantat til lys levering. Men de fiberoptiske implantater er stabile og bio-kompatible, der giver mulighed for langsgående scanning og undersøgelse af neural kredsløb over en periode på måneder 23,24.
Sammenfattende den præcise stimulering og hel-hjerne overvågning evne ofMRI er afgørende faktorer ved fremstilling ofMRI et effektivt redskab til studiet af connectomics af hjernen. Desuden kan det tilvejebringe nye indsigt i mekanismerne i neurologiske sygdomme 25 når kombineret med forskellige dyremodeller. Faktisk har ofMRI blevet brugt til at belyse netværksaktivitet af distinkte hippocampus subregioner forbundet med anfald 8. Derfor vil laboratorier interesseret i at besvare systemer niveau neurovidenskab spørgsmål finder denne teknik af betydning.
Bevægelse af emnet under billedbehandling er en væsentlig kilde til artefakt, som kan føre til ødelæggelse af data. Passende sikre dyret på imaging vugge kan minimere sådanne artefakter som vil opretholde passende anæstesi niveauer. Her brugte vi isofluran men alternative bedøvelsesmidler, såsom medetomidin eller ketamin og xylazin, bør også overvejes. Niveauerne og valg af bedøvelse, kan imidlertid påvirke mange parametre i hjernen, herunder BOLD respons 28. Isofluran kan forårsage ændringer i neuronexcitabilitet 29. Andre bedøvelsesmidler kan også påvirke GABA synaptisk hæmning 30. Således er valget af anæstesi er vigtig, når der udføres ofMRI givet sin evne til at påvirke neuronal aktivitet. ofMRI i mangel af anæstesi er muligt, men kan være udfordrende med øget bevægelse fra dyret, som kan reduceres, hvis dyret er habituated; er tidligere blevet udført sådanne vågen ofMRI undersøgelser ennd ville undgå forvirrende virkninger af anæstesi på hjernen 9,10. Efterbehandling motion korrektionsalgoritmer kan anvendes til i høj grad at afbøde virkningerne af bevægelse. Flere af disse metoder findes, herunder den inverse Gauss-Newton-algoritme beskæftiget i denne protokol, der minimerer summen af kvadrater omkostningerne funktion af henvisningen billede og billede under korrektion. Algoritmen er nyttigt, fordi det giver mulighed for hurtig og robust bevægelse korrektion, ved hjælp af en GPU parallel platform designet til at reducere sagsbehandlingstider 27.
For genopbygning data i denne protokol, blev skik skrevet software i en MATLAB miljø bruges til to-dimensionelle gridding rekonstruktion, hvor spiral prøver rekonstrueret i k-rummet til gitter billeder 31-33. Tidsseriedata blev genereret ved at beregne procent modulation af BOLD signal af hver voxel i forhold til baseline periode indsamlet før stimulation. Voxels hvis tidsserier blev SYNchronized til blokke af optogenetic stimulation med en sammenhæng værdi på 0,35 eller større blev defineret som aktiverede voxels; denne sammenhæng værdi svarer til en mindre end 10 -9 P-værdi 8. Sammenhæng værdier blev beregnet som størrelsen af Fouriertransformation på hyppigheden af gentagne stimuleringscykler divideret med summen-af-kvadrater af alle frekvenskomponenter højst 8,27. Familywise fejl kan kontrolleres ved hjælp af Bonferroni korrektion for multiple sammenligninger. kan anvendes andre analysemetoder, herunder parametriske statistiske tests såsom de generelle lineære modeller (GLMs). Sammenhængen metode kræver mindre forudgående kendskab til det HRF sammenlignet med den konventionelle generelle lineære model. Derfor er det fordelagtigt, når udforske data ved hjælp ofMRI. Dog kan sammenhængen metode kun bruges til data med blok designs eller udvalgte event-relaterede designs med en fast interstimulus interval og må ikke anvendes i ofMRI data med andre event-relaTed konstruerer eller blandede designs. Efterfølgende kan dynamisk kausal modellering (DCM) bruges til at analysere interaktioner mellem hjerneområder er identificeret gennem ofMRI. DCM er et Bayesian statistisk teknik udviklet til analyse af funktionel konnektivitet fra systemets reaktioner på eksperimentelle indgange under fMRI 34.
Supplerende tekniske bekymringer for ofMRI diskuteres her. Implantater kan blive beskadiget eller falde, hvilket fører til fjernelse af det syge dyr fra undersøgelsen. Re-implantation operationer anbefales ikke på grund af den yderligere usikkerhed målrette samme ROI som i den oprindelige implantation kirurgi og på grund af dyrevelfærd. På grund af den betydelige mængde af tid og ressourcer investeres i hver forsøgsdyr, overvejelse af styrken af materialet er en væsentlig bekymring, når du vælger en passende dental cement til brug i ofMRI undersøgelser. Den implantering er en kritisk faktor i at maksimere levetiden af implant og forsøgsdyr. For eksempel sikrer, at kraniet er tør før påføring af dentalcement og placere en tilstrækkelig mængde af cement omkring keramikring implantatet kan sikre stabilitet over potentielle måneder lange tidslinje for dyret under undersøgelsen. Derudover kan alternative bur designs udforskes og diskuteres med lokale dyr pleje facilitet til at undgå bure med wire toppe holder mad og vand, der ofte stikker ind i buret og give muligheder for dyret at beskadige implantatet. Vigtigt er, skal dentalcement vælges omhyggeligt for at reducere artefakter, der påvirker billeddannelse og alternative cementer kan testes ved påføring på et fantom og billeddannelse i en scanner før anvendelse i dyreforsøg. Trial and error med forskellige dental cementer har vist, at cement, der anvendes i denne protokol giver relativt få artefakter. En anden teknisk udfordring i at udføre ofMRI er nøjagtigheden af fiberoptiske placering på den påtænkte ROI, givet UdvindingEmely små afstande, der kan eksistere mellem kerner i hjernen 35. Efter at have afsluttet implantation operationer, kan T2-vægtede anatomiske scanninger anvendes til at bestemme korrekt placering ved overlejring på en hjerne atlas. Den dygtighed af kirurgen og praksis at udføre disse operationer kan forbedre korrekte placering satser. Specificiteten og udtryk for opsin på den påtænkte ROI kan verificeres ved afslutningen af den undersøgelse, som perfusion dyret og fastsættelse af hjernen, ved hjælp af immunhistokemi eller endogene fluorescens af en reporter-protein mærket til opsin til visualisering. Disse reporter-proteiner kan også colocalized med andre proteiner for at sikre, at opsin udtrykkes i de ønskede neurale celletyper 1,8,15,25. Som tidligere nævnt kan artefakter opstå ved udførelse ofMRI grundet opvarmning af væv fra lys levering 22. Vævet opvarmning forårsager ændring af afslapning gange, hvilket resulterer i falsk BOLD signal. For at sikre at activationen følge af lys stimulering under ofMRI skyldes ikke denne artefakt, bør udføres opsin-negative kontroller, hvor enten saltvand injicerede dyr eller dyr injiceret med kontrol fluoroforen vektorer (såsom AAV-CamKIIa-EYFP) undergår ofMRI. Derudover bør kun velopbygget fiberoptiske implantater med god lystransmission effektivitet anvendes til at fjerne behovet for at anvende høje lasereffekter. ofMRI undersøgelser er blevet udført, hvor falsk aktivering på grund af opvarmning af væv har ikke været et problem 1,6-8,10,11.
Med hensyn til valget af vektor til at indføre de nødvendige optogenetic gener i neuroner til ekspression, er AAV'er ikke kendt for at forårsage sygdom hos mennesker og er derfor en bekvem løsning, fordi det lavere biosikkerhed niveau, der kræves for at bruge disse midler (BSL-1). Desuden et væld af vektor kerner bære AAV'er pakket med forskellige optogenetic gener i lager og med flere serotyper. Serotype AAV skal vælges based af den tilsigtede cellepopulation mål at sikre optimale ekspressionsniveauer 36,37. Lentivira kan også anvendes, men kræver en højere biosikkerhed niveau. Tidsrummet er nødvendig for tilstrækkelig udtryk for optogenetic gener er variabel afhængig af den specifikke dyremodel anvendt, af den særlige AAV anvendes, og af den specifikke eksperimentelle paradigme. I denne protokol, er Sprague Dawley rotter 11 uger gammel brugt og optogenetic undersøgelser begynder fire til seks uger efter virus injektion. Transgene mus kan også anvendes i optogenetic undersøgelser. Det er nødvendigt at udføre pilotforsøg for at bestemme den specifikke mængde tid, der kræves for tilstrækkelig udtryk for opsiner. Stimulation paradigmer kan variere afhængigt af den specifikke opsin anvendes. I denne protokol, er AAV5-CamKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP anvendt og stimulering paradigme er 20 sek på / 40 sek fra. Hvis der anvendes en SSFO vil stimulation paradigme variere fordi SSFO kræver kun en kort puls af lys at være acveret og derefter en kort puls af lys ved en anden bølgelængde skal afsluttes.
En ekstra kritisk bekymring, når du udfører ofMRI forhindrer lys lækage fra ferrule implantat grænseflade med det fiberoptiske patch kabel under optogenetic stimulation for at forhindre en confounding hjerne signal stammer fra visuel stimulation, selv når dyret er bedøvet. Kogler af sort elektrisk tape kan anvendes til at blokere lyset fra ferulerne og dække øjnene af dyret. Vigtigt er det, skal fysiologiske værdier, herunder eksspiratorisk CO2 og kropstemperaturen af emnet være ordentligt vedligeholdt gennem hele det billeddannende. Eksspiratorisk CO 2 bør holdes mellem 3 – 4% og legemstemperatur ved 37 ° C. Desuden de lagdannelse sekvenser mindskes mest inhomogenitet som muligt i det magnetiske felt før start ofMRI scanner spænder bestemmer kvaliteten af de resulterende BOLD data. Kontrol af disse faktorerer kritisk i at producere pålidelige ofMRI data. I denne protokol, der DPSS lasere bruges som lyskilde til optogenetic stimulation. Fordi laserlys er sammenhængende, mere end nok strøm let kan tilføres gennem fiberoptiske. LED-lyskilder koblet til fiberoptik er tilgængelige fra kommercielle leverandører, men har den ulempe, nedsat effekt af lystransmission. Laseren lyskilde kræver tilpasning til hver enkelt fiberoptiske patch kabel, men med praksis, kan tilpasningen ske inden for sekunder til minutter.
Fremtidige anvendelser af ofMRI indbefatter anvendelsen af næste generation opsiner såsom rødforskudt opsiner at muliggøre ikke-invasiv stimulation under billedbehandling. Derudover kunne implantation af MR-kompatible EEG eller lignende optagelse elektroder sammen med fiberoptiske implantat give mulighed for erhvervelse af høje data tidsmæssige opløsning ud over de højopløselige data fra MRI rumlige. ofMRI med electrophysiological optagelse kunne give omfattende oplysninger om den funktionelle konnektivitet af hjernen. Sammenfattende magt ofMRI at overvåge hele hjernen som reaktion på stimulering af specifikke cellepopulationer defineret af genetiske eller anatomisk identitet gør ofMRI et kritisk værktøj til brug i studiet af neurologiske sygdomme og af connectomics af sund hjerne.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported through funding from the NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), Okawa Foundation Research Grant Award, NIH Director’s New Innovator Award (1DP2OD007265), the NSF CAREER Award (1056008), and the Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. would like to thank Karl Deisseroth for providing the DNA plasmids used for the optogenetic experiments. The authors would also like to thank Andrew Weitz and Mankin Choy for editing the manuscript and all the Lee Lab members for their assistance with the ofMRI experiments.
7 Tesla scanner | Agilent Technologies | Discovery MR901 System | |
Sprague Dawley rats | Charles River | Crl:SD | 11 weeks old |
fiber cleaver | Fujikura | CT-05 | |
multimode optical fiber | Thor Labs | AFS105/125Y | |
fiber stripper | Thor Labs | T08S13 | |
ceramic split sleeve | Precision Fiber Products | SM-CS1140S | |
epoxy glue | Thor Labs | G14250 | |
cotton-tipped applicators | Stoelting Co. | 50975 | |
multimode ceramic zirconia ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2002 | |
FC/PC multimode connector | Thor Labs | 30128C3 | |
fiber optic polishing disk | Precision Fiber Products | M1-80754 | |
aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm | Thor Labs | LFG03P | |
aluminum oxide lapping sheet, 1 µm | Thor Labs | LFG1P | |
aluminum oxide lapping sheet, 3 µm | Thor Labs | LFG3P | |
binocular biological microscope 40X-1000X | Amscope | B100 | |
laser safety glasses | Kentek | KXL-62W01 | |
473 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0473 | |
594 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0594 | |
Allen hex wrench set | 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser | ||
power meter, Si Sensor, 400-1100 nm | Thor Labs | PM121D | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | |
isoflurane vaporizer with induction chamber | VetEquip | 901806 | |
NanoFil 100uL syringe | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | |
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
function generator | A.M.P.I. | Master-8 | |
small animal stereotax | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Model 683 small animal ventilator | Harvard Apparatus | 550000 | |
Type 340 capnograph | Harvard Apparatus | 733809 | |
dental drill (rotary micromotor kit) | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
ophthalmic ointment (Artificial Tears) | Rugby | 00536-6550-91 | |
instrument sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | glass bead sterilizer |
antibiotic powder | Pfizer | NEO-PREDEF | neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride |
buprenorphine painkiller | Hospira | NDC:0409-2012 | schedule III controlled substance , 0.3 mg/mL stock |