This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.
The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain’s global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.
Optogenetic 기능적 자기 공명 영상 (ofMRI)의 전체에 걸쳐 세포 유형 특정한 기능적 신경 회로의 맵핑 및 역학을 가능 optogenetic 자극 1-11,38의 정밀도 높은 필드의 fMRI의 공간 분해능을 겸비한 신규 한 기술이다 뇌. 특정 세포 유형은 빛에 민감한 횡단 막 전도 채널,라는 opsins의 도입에 의해 자극의 대상이 될 때까지 Optogenetics가 있습니다. 신경 회로의 특정 요소는 유 전적으로 그대로 뇌 1-15에서 활동 밀리 초 – 시간 척도 변조를 가능하게,이 채널을 표현하기 위해 수정됩니다. 자기 공명은 신경 활성의 간접적 인 측정을 제공 혈중 산소 수준 의존 (BOLD) 신호 16-18의 측정을 통해 특정 신경 회로의 optogenetic 자극 뇌 전체 동적 응답을 결정하는 비 침습적 방법을 제공한다.
상대적으로 높은 공간 해상도로 전체 뇌의 뷰를 제공 할 수 있기 때문에, 이들 두 기술의 조합, optogenetic 기능적 자기 공명 영상 (ofMRI)를 지칭 같은 전기 생리학 같은 자극시 기록 뇌 활동의 다른 방법에 비해 유리하다. 이것은 침습 기록 전극 1-11 주입 없이도 자극 부위로부터 먼 거리에서 대상의 자극에 반응하여 신경 세포 활성도의 감지를 가능하게한다. ofMRI 전극 근처에서 다른 세포 유형을 채용함으로써 각 인구 (19)의 인과 영향을 혼동 할 수의 fMRI 동안 전기 자극을 수행하는 전통적인 방법보다 유리하다. 또한, 상기 전극은 전기 자극을 위해 사용되며 발전 전류는 MR 촬상 20 동안에 아티팩트를 생성 할 수있다. 사실, ofMRI 특정 modulati에서 글로벌 두뇌 활동에 영향을 관찰 할 수 있습니다이러한 형질 전환 동물에서의 LOX-Cre 호텔 시스템 또는 촉진제의 사용과 같은 진보 된 유전자 타겟팅 기술의 사용을 통해 세포 유형의 다양한에서. 전체 뇌 모니터링 조합 광 제어는 특정 세포 유형을 자극하기 위해 억제 ChR2 NpHR 모두의 사용을 통해 ofMRI 가능하다. ofMRI에서 사용할 수있는 optogenetic 툴킷은 또한 신속하게 이식 섬유에 대한 요구 사항을 부정 할 수 안정화 단계 기능 opsins (SSFOs) 또는 적색 편이 opsins의 증가 빛이 감도 또는 개선 된 반응 속도와 opsins의 도입으로 시간이 지남에 따라 개선 영상 21시 비 침습적 자극을 가능하게 광학,. 이러한 가능성은 전기 자극과 함께 사용할 수 없습니다.
그러나, 뇌에서 광 전달 티슈 가열로 인한 신호 아티팩트는 완화 시간의 온도에 의한 변형 pseu을 생성하는 것으로 나타났다 (22),보고 된정품 인증을한다. ofMRI을 수행하는 연구자들은 따라서 이러한 잠재적 혼란을 알고 있어야합니다. 적절한 설정 및 제어로, 문제가 해결 될 수 있습니다. 또한, 자기 공명의 혈역학 적 반응을 측정하는 상대적으로 낮은 시간 해상도는이 기술의 특정 응용 프로그램에 대한 제한 요인이 될 수있다.
이 프로토콜은 제 깊은 생체의 뇌에 빛의 특정 파장의 전달을 가능하게하는 광섬유 임플란트의 구성을 설명한다. 프로토콜은 정위 수술을 이용하여 정확한 뇌 영역에 옵신 코딩하는 바이러스 벡터의 전달을 설명한다. 프로토콜 옆에 동시 빛 자극하는 동안 전체 뇌 기능 자기 공명 영상의 프로세스에 대해 설명합니다. 마지막으로, 프로토콜은 수집 된 데이터의 기본 데이터 분석을 설명합니다.
참고로, 여기에 설명 된 optogenetics은 빛 전달을위한 만성 이식을 필요로한다. 그러나, 광섬유 임플란트가 안정되어 바이오호환, 세로 스캔 달 23, 24의 기간 동안 신경 회로의 조사를 허용한다.
요약하면, 정확한 자극 및 ofMRI의 전체 뇌 모니터링 능력은 뇌의 connectomics의 연구를위한 강력한 도구를 ofMRI 만드는 중요한 요인이다. 또한, 그것은 상이한 동물 모델과 결합 된 신경 질환 (25)의기구에 신규 한 통찰력을 제공 할 수있다. 실제로 ofMRI 발작 (8)와 연관된 고유 한 해마 하위 영역의 네트워크 활동을 명료하게하기 위해 사용되었다. 따라서, 시스템 수준의 신경 과학의 질문에 대답에 관심이 실험실 중요성이 기술을 찾을 수 있습니다.
촬영시 피사체의 모션 데이터가 손상 될 수있는 이슈의 중요한 소스입니다. 적절한 마취 적절한 수준을 유지하는 것 같은 아티팩트를 최소화 할 수있는 촬상 크래들 동물을 고정. 여기, 우리는 이소 플루 란되지만, 메데 토미 또는 케타민과 자일 라진과 같은 대체 마취제를 사용, 또한 고려되어야한다. 그러나, 마취제의 레벨 선택은 BOLD 응답 (28)을 포함하여, 뇌의 많은 매개 변수에 영향을 미칠 수있다. 이소 플루 란은 신경 흥분 (29)의 변화를 일으킬 수 있습니다. 다른 마취제는 GABA 시냅스 억제 (30)에 영향을 줄 수 있습니다. ofMRI가 신경 세포 활성도에 영향을 미칠 수있는 능력을 부여 수행 할 때 즉, 마취의 선택은 중요하다. 마취의 부재 ofMRI 가능하지만 동물 길들여 경우 감소 될 수있는, 동물에서 증가 된 운동으로 도전 될 수있다 이러한 웨이크 ofMRI 연구는 이전에 수행되어왔다차 뇌 9,10에 마취의 혼란 효과를 피할 것이다. 후 처리 동작 보정 알고리즘이 크게 움직임의 영향을 완화하기 위해 사용될 수있다. 이들 방법 중 일부는 보정하에 사각형 선정 기준 화상의 함수 및 이미지의 합을 최소화하는 이러한 프로토콜에 사용되는 역 가우스 뉴튼 알고리즘을 포함하여 존재한다. 이 처리 기간 (27)을 감소시키기 위해 GPU 병렬 플랫폼 설계를 사용하여 신속하고 강력한 모션 보정이 가능하기 때문에이 알고리즘이 유용하다.
이 프로토콜의 데이터 재구성 들어, MATLAB 환경에서 사용자 작성된 소프트웨어는 나선형 시료 격자 이미지로 31-33 k- 스페이스에 재구성 이차원 리딩 재건을 위해 사용되었다. 시계열 데이터는 자극하기에 앞서 수집 된베이스 라인 기간에 각 복셀 상대의 BOLD 신호의 비율 변조를 계산함으로써 생성 하였다. 그 시간 시리즈 복셀은 SYN했다활성화 복셀로 정의 된 0.35 이상의 코 히어 런스 값 optogenetic 자극 블록 chronized; 이 코 히어 런스 값은 이하 10-9 P 값 (8)에 대응한다. 푸리에 변환의 크기가 모든 주파수 성분 8,27의 제곱합으로 나누어 반복 자극 사이클의 주파수 변환으로 코 히어 런스 값을 계산 하였다. Familywise 에러는 다중 비교를 위해 본 페로 니 보정을 사용하여 제어 될 수있다. 분석의 다른 방법은 같은 일반 선형 모델 (GLMS)와 같은 파라 메트릭 통계 테스트를 포함하여, 사용할 수 있습니다. 일관성 방법은 종래의 일반적인 선형 모델에 비해 적은 HRF에 대한 사전 지식을 필요로한다. ofMRI를 사용하여 데이터를 탐색 할 때 때문에, 유리하다. 그러나, 간섭 방법은 오직 간격 interstimulus 고정되고 다른 이벤트와 RELA ofMRI 데이터에서 사용되지 않을 경우에 관련된 설계 블록 디자인 데이터 사용 또는 선택 될 수있다테드는 디자인 또는 혼합 디자인. 이어서, 동적 인과 모델링 (DCM)을 통해 식별 ofMRI 뇌 영역 사이의 상호 작용을 분석하는데 사용될 수있다. DCM은 자기 공명 (34) 동안 실험 입력에 대한 시스템 응답에서 기능적 연결성 분석을 위해 개발 된 베이지안 통계 기법이다.
ofMRI에 대한 추가 기술적 인 문제는 여기에서 논의된다. 임플란트가 손상되거나 연구에서 영향을받는 동물의 제거로 이어지는 떨어질 수 있습니다. 재 이식 수술로 인해 동물 복지 문제에 대한 원래의 이식 수술로 인해 동일한 투자 수익 (ROI)을 대상으로하는 추가 불확실성에 권장되지 않습니다. 때문에 각 동물 대상에 투자 된 시간과 리소스의 상당한 양의 재료의 강도를 고려 ofMRI 연구에 사용하기위한 적절한 치과 용 시멘트를 선택하는 중요한 관심사이다. 이식 수술은 IMPLAN의 수명을 극대화하는 중요한 요소이다t 동물 될 수 있습니다. 예를 들어, 두개골 연구 동안 동물의 전위 개월 긴 막대 위에 안정성을 확보 할 수있는 세라믹 페룰 임플란트 주위 시멘트 적당량을 치과 용 시멘트를 도포하고 배치하기 전에 건조 것을 보장한다. 또한, 다른 케이지 디자인 탐구 종종 케이지에 돌출 와이어 음식을 들고 탑 물 케이지를 방지하고, 주입 손상을 동물을위한 기회를 제공하기 위해 로컬 동물 보호 시설로 설명 될 수있다. 중요한 것은, 치과 용 시멘트는 이미징 및 다른 시멘트는 동물 실험에 사용하기 전에 스캐너에서 팬텀 및 이미징에 응용 프로그램을 테스트 할 수에 영향 유물을 줄이기 위해 신중하게 선택해야합니다. 다양한 치과 용 시멘트로 시행 착오는이 프로토콜에서 사용되는 시멘트는 비교적 적은 아티팩트를주는 것으로 나타났다. ofMRI을 수행하는 또 다른 기술적 과제는 extr 주어진 의도 된 ROI에서 광섬유 위치의 정확성이다뇌 (35)에 핵 사이에 존재할 수 emely 작은 거리. 이식 수술을 마친 후, T2 강조 해부 검사는 뇌 아틀라스에 중첩하여 정확한 위치를 결정하는데 사용될 수있다. 외과 의사 이러한 수술을 수행하는 연습의 기술은 정확한 위치 속도를 향상시킬 수 있습니다. 의도 된 ROI의 특이성 및 옵신 발현 동물을 관류 뇌 고정, 면역 또는 시각화 옵신로 태그 된 리포터 단백질의 내인성 형광을 사용하여 연구의 결론에서 확인할 수있다. 이러한 리포터 단백질은 옵신 원하는 신경 세포 형태 1,8,15,25 표현되도록 다른 단백질 colocalized 수있다. 앞서 언급 한 바와 같이 빛 전달 (22)에 의한 조직 가열 ofMRI을 수행 할 때, 이슈가 발생할 수 있습니다. 조직 가열 거짓 BOLD 신호의 결과로, 휴식 시간의 변경이 발생합니다. 그 교류를 보장하기 위해ofMRI 동안 빛 자극에 의한 tivation이 이슈로 인해 아니라, 옵신 음성 제어하는 (예 AAV-CaMKIIa – EYFP)를 제어 형광 벡터 주입 식염수 주입 동물이나 동물 중 하나가 ofMRI를 받아야 수행해야합니다. 또한, 좋은 광 투과 효율 만 잘 구성된 광섬유 임플란트는 높은 레이저 파워를 사용할 필요성을 제거하기 위해 사용되어야한다. ofMRI 연구 인해 조직 가열되는 거짓 활성화에 수행 된이 문제가 1,6-8,10,11되지 않았습니다.
표현 뉴런에 필요한 optogenetic 유전자를 도입하는 벡터의 선택에 관해서는, AAVs은 인간의 질병을 일으키는 것으로 알려져 있으므로 편리한 옵션이며, 이러한 에이전트 (BSL-1)를 사용하는 데 필요한 낮은 바이오 안전성 수준을 제공하지 않습니다. 또한, 벡터 코어의 군중은 재고 및 여러 혈청 형과 다양한 optogenetic 유전자와 함께 패키지 AAVs을 수행한다. AAV의 혈청 형은 b를 선택해야합니다최적의 발현 수준 (36, 37)를 위해 의도 된 세포 집단을 대상 ased. 렌티 바이러스는 사용하지만, 더 높은 수준의 바이오 필요할 수있다. optogenetic 유전자의 충분한 발현을 위해 필요한 시간은 사용되는 특정 AAV와 특정 실험 패러다임에서, 사용 된 특정 동물 모델에 따라 가변적이다. 이 프로토콜에서, 11 주 이전에 스프 라그 돌리 쥐를 사용하고 optogenetic 연구는 바이러스 주사 후 4 주에서 6 주를 시작합니다. 트랜스 제닉 마우스는 또한 optogenetic 연구에 사용될 수있다. opsins 충분히 발현에 필요한 시간의 특정 량을 결정하기 위해 파일럿 실험을 수행 할 필요가있다. 자극 패러다임은 사용되는 특정 옵신에 따라 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜에서 AAV5 – CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP를 사용하고, 자극 패러다임은 / 40 초 오프 20 초입니다. SSFO는 AC로 빛의 짧은 펄스를 필요 때문에 SSFO를 사용하는 경우, 자극 패러다임 달라질tivated 다음 다른 파장에서 빛의 짧은 펄스가 종료 될 수 있습니다.
ofMRI는 동물이 마취 경우에도, 시각적 자극 유래 교란 뇌 신호 방지 optogenetic 자극 동안 광섬유 패치 케이블 페룰 임플란트 계면에서 빛의 누설을 방지한다 수행 추가적인 중요한 관심사. 흑색 전기 테이프 콘 페룰로부터의 광을 차단하고, 동물의 눈을 커버하기 위해 사용될 수있다. 중요한 것은 환자의 호기 CO 2 및 신체 온도를 포함한 생리 값 적절히 촬상 기간에 걸쳐 유지되어야한다. 37 ℃에서 4 % 체온 – 호기 CO 2 (3) 사이에 유지되어야한다. 또한 shimming 서열은 종래 ofMRI 크게 스캔 얻어진 BOLD 데이터의 품질을 결정 시작하기 자장 가능한 불균일성을 감소시킨다. 이러한 요소의 제어신뢰성 ofMRI 데이터 생성에 중요하다. 이 프로토콜에서, DPSS 레이저는 optogenetic 자극 용 광원으로서 사용된다. 레이저 광의가 간섭 성이므로, 충분한 전력을 용이하게 광섬유를 통해 공급 될 수있다. 광섬유에 결합 된 LED 광원은 상용 공급 업체에서 사용할 수 있지만, 광 투과율의 감소 힘의 단점이있다. 레이저 광원은, 각각의 특정 광섬유 패치 케이블 정렬이 필요하지하지만 연습, 배향 분 초 내에 달성 될 수있다.
ofMRI 미래 애플리케이션은 이미징 동안 비 침습적 자극을 사용하는 적색 편이 opsins 같은 차세대 opsins의 사용을 포함한다. 또한, MRI 호환 EEG 또는 광섬유 임플란트와 함께 유사한 기록 전극의 주입 MRI의 높은 공간 해상도 데이터 외에 높은 시간 해상도 데이터의 포착을 허용 할 수있다. ofMRI와 electrophysiological 기록 뇌의 기능적 연결성에 광범위한 정보를 제공 할 수있다. 요약하면, 유전자 또는 해부학 신원 의해 정의 특정 세포 집단의 자극에 응답하여 전체 뇌를 모니터링 ofMRI의 힘 ofMRI에게 신경계 질환의 연구 및 건강한 뇌의 connectomics의 사용에 중요한 도구를 만든다.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported through funding from the NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), Okawa Foundation Research Grant Award, NIH Director’s New Innovator Award (1DP2OD007265), the NSF CAREER Award (1056008), and the Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. would like to thank Karl Deisseroth for providing the DNA plasmids used for the optogenetic experiments. The authors would also like to thank Andrew Weitz and Mankin Choy for editing the manuscript and all the Lee Lab members for their assistance with the ofMRI experiments.
7 Tesla scanner | Agilent Technologies | Discovery MR901 System | |
Sprague Dawley rats | Charles River | Crl:SD | 11 weeks old |
fiber cleaver | Fujikura | CT-05 | |
multimode optical fiber | Thor Labs | AFS105/125Y | |
fiber stripper | Thor Labs | T08S13 | |
ceramic split sleeve | Precision Fiber Products | SM-CS1140S | |
epoxy glue | Thor Labs | G14250 | |
cotton-tipped applicators | Stoelting Co. | 50975 | |
multimode ceramic zirconia ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2002 | |
FC/PC multimode connector | Thor Labs | 30128C3 | |
fiber optic polishing disk | Precision Fiber Products | M1-80754 | |
aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm | Thor Labs | LFG03P | |
aluminum oxide lapping sheet, 1 µm | Thor Labs | LFG1P | |
aluminum oxide lapping sheet, 3 µm | Thor Labs | LFG3P | |
binocular biological microscope 40X-1000X | Amscope | B100 | |
laser safety glasses | Kentek | KXL-62W01 | |
473 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0473 | |
594 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0594 | |
Allen hex wrench set | 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser | ||
power meter, Si Sensor, 400-1100 nm | Thor Labs | PM121D | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | |
isoflurane vaporizer with induction chamber | VetEquip | 901806 | |
NanoFil 100uL syringe | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | |
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
function generator | A.M.P.I. | Master-8 | |
small animal stereotax | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Model 683 small animal ventilator | Harvard Apparatus | 550000 | |
Type 340 capnograph | Harvard Apparatus | 733809 | |
dental drill (rotary micromotor kit) | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
ophthalmic ointment (Artificial Tears) | Rugby | 00536-6550-91 | |
instrument sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | glass bead sterilizer |
antibiotic powder | Pfizer | NEO-PREDEF | neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride |
buprenorphine painkiller | Hospira | NDC:0409-2012 | schedule III controlled substance , 0.3 mg/mL stock |