This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.
The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain’s global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.
Optogenetic funksjonell magnetisk resonans imaging (ofMRI) er en ny teknikk som kombinerer romlig oppløsning på high-feltet fMRI med presisjonen i optogenetic stimulering 1-11,38, slik at celletype-spesifikke kartlegging av funksjonelle nevrale kretser og deres dynamikk over hele hjerne. Optogenetics gjør det mulig for spesifikke celletyper å være målrettet for stimulering ved innføring av lysfølsomme trans-membrankonduktans kanaler, kalt opsins. Spesifikke elementer av nevrale kretser er genmodifisert til å uttrykke disse kanalene, slik at millisekund-tidsskala modulering av aktiviteten i intakt hjernen 1-15. fmri gir en ikke-invasiv metode for å bestemme hjernens globale dynamiske respons på optogenetic stimulering av spesifikke nevrale kretser gjennom måling av blod-oksygen-nivå-avhengige (BOLD) signal 16-18, som gir et indirekte mål på neuronal aktivitet.
Kombinasjonen av disse to teknikkene, betegnes optogenetic funksjonell magnetisk resonans imaging (ofMRI), er en fordel i forhold til andre metoder for opptak hjernens aktivitet under stimulering som elektro fordi det kan gi en visning av hele hjernen ved relativt høy romlig oppløsning. Dette gjør det mulig for påvisning av neuronal aktivitet i respons til målrettet stimulering på store avstander fra stedet av stimulering uten behov for implantering av invasive opptak elektroder 1-11. ofMRI er fordelaktig fremfor de mer tradisjonelle metode for å utføre elektrisk stimulering i løpet av fmri, som kan rekruttere ulike celletyper i nærheten av elektroden og således forvirre den kausale påvirkning av hver populasjon 19. I tillegg til elektrodene som brukes for elektrisk stimulering, og den genererte strøm kan produsere gjenstander i løpet av 20 MR. Faktisk muliggjør ofMRI observasjon av påvirkning på global hjerneaktivitet fra den spesifikke modulatipå en av mange forskjellige celletyper ved bruk av avanserte genetisk målrettingsteknikker som Cre-Lox system i transgene dyr eller bruk av aktivatorer. Kombinatorisk optisk kontroll med hel hjerne-overvåking er mulig med ofMRI gjennom bruk av både NpHR for å hemme og ChR2 å eksitere spesifikke celletyper. Den optogenetic verktøysettet er tilgjengelig for bruk i ofMRI er også raskt bedre over tid med innføring av opsins med øket lys-sensitivitet eller forbedret kinetikk, av stabiliserte trinn funksjons opsins (SSFOs) eller av røde forskjøvet opsins som kan oppheve kravet til implanterte fiber optikk, slik at ikke-invasiv stimulering under avbildning 21. Disse mulighetene er ikke tilgjengelig med elektrisk stimulering.
Imidlertid har signal artefakter som følge av vev oppvarming på grunn av lys levering i hjernen blitt rapportert 22, hvor temperatur-indusert modifikasjon av relaksasjonstider har vist seg å produsere pseugjøre aktivering. Forskere utfører ofMRI bør derfor være klar over dette potensialet forvirre. Med riktig oppsett og kontroller, kan problemet løses. I tillegg kan forholdsvis lav tidsoppløsning for måling av hemodynamiske responsen i fmri være en begrensende faktor for visse anvendelser av denne teknikk.
Denne protokollen beskriver første konstruksjonen av de fiberoptiske implantater som muliggjør levering av bestemte bølgelengder av lys dypt inn i hjernen in vivo. Den protokollen beskriver da levering av opsin-kodende viral vektor til en nøyaktig hjerneregion ved bruk av stereotaktisk kirurgi. Neste protokollen beskriver prosessen med hel-hjerne funksjonell MRI under samtidig stimulering lys. Til slutt, skisserer protokollen grunnleggende dataanalyse av de innsamlede data.
Av notatet, optogenetics beskrevet her krever en kronisk implantat for lys levering. Men de fiberoptiske implantater er stabil og bio-kompatibel, noe som åpner for langsgående skanning og undersøkelse av nevrale kretser over en periode på flere måneder 23,24.
I sammendraget, nøyaktig stimulering og hel-hjerne overvåking evne ofMRI er avgjørende faktorene i å gjøre ofMRI et kraftig verktøy for studiet av connectomics av hjernen. I tillegg kan det tilveiebringe en ny innsikt i mekanismen for nevrologiske sykdommer 25 når kombinert med forskjellige dyremodeller. Faktisk ofMRI har blitt brukt for å belyse nettverk aktivitet av distinkte hippocampus-underregioner i forbindelse med beslag 8. Derfor vil laboratorier som er interessert i å svare systemer-nivå nevro spørsmål finner denne teknikken av betydning.
Bevegelse av faget i løpet av bildediagnostikk er en betydelig kilde til gjenstand som kan føre til ødelagte data. Passende sikre dyret på bilde holderen kan minimere slike gjenstander som vil opprettholde passende anestesi nivåer. Her brukte vi isofluran men alternative bedøvelsesmidler, som for eksempel medetomidin eller ketamin og xylazin, bør også vurderes. Imidlertid kan nivåene og valg av anestesi påvirke mange parametere i hjernen, inkludert BOLD respons 28. Isofluran kan føre til endringer i nevronale eksitabilitet 29. Andre bedøvelsesmidler kan også påvirke GABA synaptic hemming 30. Således er valget av anestesi viktig når det utføres ofMRI gitt sin evne til å påvirke neuronal aktivitet. ofMRI i fravær av bedøvelse er mulig, men kan være utfordrende med økt bevegelse fra dyr, som kan reduseres hvis dyret er tilvent; slike våken ofMRI studier har tidligere blitt utført ennd ville unngå konfunderende effekt av anestesi på hjernen 9,10. Post-prosessering motion korreksjon algoritmer kan brukes til å sterkt redusere effekten av bevegelse. Flere av disse fremgangsmåter eksisterer, inkludert den inverse Gauss-Newton-algoritmen anvendt i denne protokollen, som minimaliserer summen av kvadratene kostnadsfunksjonen av referansebildet, og bildet i henhold til korreksjon. Algoritmen er nyttig fordi den gjør det mulig hurtig og robust bevegelse korreksjon, ved hjelp av en GPU parallell plattform design for å redusere behandlingstiden 27.
For data rekonstruksjon i denne protokollen, var tilpasset skrevet programvare i et MATLAB miljø som brukes til todimensjonale slipe rekonstruksjon, der spiral prøvene er rekonstruert i k-space inn rutenett bilder 31-33. Seriedata Tid ble generert ved å beregne den prosentvise modulasjon av BOLD-signalet for hver voksel i forhold til grunnlinjen periode oppsamlet før stimulering. Lydelementer som tidsserier ble SYNchronized til blokker av optogenetic stimulering med en sammenheng verdi på 0,35 eller høyere ble definert som aktiverte voxels; denne sammenheng verdien tilsvarer mindre enn 10 -9 P-verdi 8. Koherens-verdier ble beregnet som størrelsen av Fourier-transformasjonen ved frekvensen av gjentatte stimuleringssykluser dividert med den sum-av-kvadrater av alle frekvenskomponenter 8,27. Familywise feilen kan styres med Bonferroni korreksjon for multiple sammenligninger. Alternative metoder for analyse kan anvendes, inklusive parametriske statistiske tester slik som de generelle lineære modeller (GLMs). Sammenhengen metoden krever mindre forkunnskaper i HRF sammenlignet med konvensjonelle generell lineær modell. Derfor er det en fordel når du utforsker data ved hjelp ofMRI. Imidlertid kan den sammenheng metoden kun brukes for data med blokk design eller hendelsesrelaterte design med en fast interstimulus intervall, og kan ikke brukes i ofMRI data med andre arrangement-related design eller blandede design. Deretter kan dynamisk kausal modellering (DCM) brukes til å analysere interaksjoner mellom hjerneregioner som er identifisert gjennom ofMRI. DCM er en Bayesiansk statistisk teknikk utviklet for analyse av funksjonell tilkobling fra system svar på eksperimentelle innganger under fMRI 34.
Ytterligere tekniske bekymringer for ofMRI er diskutert her. Implantater kan bli skadet eller falle av, noe som fører til fjerning av den aktuelle dyret fra studien. Re-implantasjon surgeries er ikke anbefalt på grunn av den ekstra usikkerheten rettet mot samme avkastning som i den opprinnelige implantasjon kirurgi og på grunn av dyrevelferd. På grunn av den betydelig mengde av tid og ressurser investert i hvert dyr gjenstand, hensyn til styrken av materialet er en betydelig bekymring når man velger en passende dentalsement for anvendelse i ofMRI studier. Implantasjon kirurgi er en kritisk faktor i å maksimere levetiden på implant og dyr gjenstand. For eksempel, slik at skallen er tørr før påføring av dental sement og plassere en tilstrekkelig mengde sement rundt keramisk hylse implantat kan sikre stabilitet over potensialet måneder lange tidslinjen av dyret i løpet av studien. I tillegg kan alternative bur design bli undersøkt og diskutert med den lokale dyr omsorg anlegget for å unngå bur med netting topper som holder mat og vann som ofte stikker inn i buret og gi muligheter for dyret å skade implantatet. Viktigere, må dental sement velges nøye for å redusere artefakter som påvirker bildebehandling og alternative sement kan testes ved søknad på en fantom og bildebehandling i en scanner før bruk i dyreforsøk. Prøving og feiling med ulike tann sementer har vist at den sement som brukes i denne protokollen gir relativt få gjenstander. En annen teknisk utfordring i å utføre ofMRI er nøyaktigheten av fiberoptisk plassering på den tiltenkte avkastning, gitt extrEmely små avstander som kan eksistere mellom kjerner i hjernen 35. Etter fullført implantasjon operasjoner, kan T2-vektet anatomiske skanner brukes til å bestemme riktig plassering av overliggende på en hjerne atlas. Ferdigheten av kirurgen og praksis utføre disse operasjonene kan forbedre riktig plassering priser. Spesifisitet og ekspresjon av opsin ved den beregnede ROI kan verifiseres ved avslutningen av undersøkelsen ved perfusert dyret og fiksering av hjerne, ved hjelp av immunohistokjemi eller den endogene fluorescensen til en reporter-protein merket til den opsin for visualisering. Disse rapportør proteinene kan også bli colocalized med andre proteiner for å sikre at opsin er uttrykt i de ønskede neurale celletyper 1,8,15,25. Som nevnt tidligere, kan det oppstå gjenstander ved utførelse ofMRI skyldes vev oppvarming fra lys levering 22. Vevet oppvarming fører til endring av avslapnings ganger, noe som resulterer i falske BOLD signal. For å sikre at acrings følge av lys stimulering i løpet av ofMRI er ikke på grunn av denne gjenstand, bør opsin-negative kontroller utføres i hvilken av enten saltvann injiserte dyr eller dyr injisert med kontroll fluoroforen vektorer (slik som AAV-CaMKIIa-EYFP) gjennomgår ofMRI. I tillegg bør bare godt konstruert fiberoptiske implantater med god lystransmisjon virkningsgrad anvendes for å fjerne behovet for å bruke høye laser krefter. ofMRI utført studier der falsk aktivering på grunn av vev oppvarming har ikke vært et problem 1,6-8,10,11.
Når det gjelder valg av vektor for å innføre de nødvendige optogenetic gener i nerveceller til uttrykk, er AAVs ikke kjent for å forårsake sykdom hos mennesker, og er derfor et praktisk alternativ, gitt lavere biosikkerhetsnivå kreves for å bruke disse legemidlene (BSL-1). I tillegg er en rekke vektor kjerner bære AAVs pakket med ulike optogenetic gener i lager og med flere serotyper. Den serotype av AAV må velges bdessuten økt på den tiltenkte cellepopulasjon mål å sikre optimale uttrykk nivåer 36,37. Lentiviruses kan også brukes men krever et høyere biosikkerhetsnivå. Tidsperioden som er nødvendig for tilstrekkelig ekspresjon av gener optogenetic er variabel, avhengig av den spesifikke dyremodell som brukes, av det spesielle AAV som brukes og av den spesifikke eksperimentelle paradigmet. I denne protokollen, Sprague Dawley rotter ved 11 uker gammel brukt og optogenetic studier begynner fire til seks uker etter virus injeksjon. Transgene mus kan også brukes i optogenetic studier. Det er nødvendig å utføre piloteksperimenter for å bestemme den spesifikke mengden av tid som kreves for tilstrekkelig ekspresjon av opsins. Stimulerings paradigmer kan variere avhengig av den spesifikke opsin anvendes. I denne protokollen, er AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP brukt og stimulering paradigmet er 20 sek på / 40 sek av. Ved hjelp av en SSFO, vil stimulering paradigmet variere fordi den SSFO krever bare en kort lyspuls for å være activated og deretter en kort puls av lys ved en annen bølgelengde som skal avsluttes.
En ytterligere viktig problem ved utføring av ofMRI hindrer lekkasje lyse fra hylsen implantat grensesnitt med den fiberoptiske patch-kabelen under optogenetic stimulering for å forhindre en forvirrende hjerne signal som stammer fra visuell stimulering, selv når dyret er bedøvet. Kjegler av svart elektrisk tape kan benyttes for å blokkere lyset fra hylsene og for å dekke øynene til dyret. Viktigere, må fysiologiske verdier inkludert ekspiratorisk CO 2 og kroppstemperaturen til individet være godt vedlikeholdt gjennom hele varigheten av bildebehandling. Ekspiratorisk CO 2 bør holdes mellom med 3 – 4%, og kroppstemperaturen på 37 ° C. I tillegg til de mellomlegg sekvensene redusere så mye som mulig inhomogeniteter i magnetfeltet før start ofMRI avsøker i stor grad bestemmer kvaliteten av de resulterende BOLD-data. Kontroll av disse faktoreneer avgjørende i å produsere pålitelige ofMRI data. I denne protokollen, DPSS lasere brukes som lyskilde for optogenetic stimulering. Fordi laserlys er sammenhengende, kan mer enn nok kraft være lett tilføres gjennom fiberoptikk. LED lyskilder som er koblet til optiske fibre er tilgjengelige fra kommersielle leverandører, men har den ulempe at de reduserte kraft av lystransmisjon. Laserlyskilden krever justering for hver enkelt fiberoptisk patch-kabel, men med praksis, kan justeringen utføres i løpet av sekunder til minutter.
Fremtidige anvendelser av ofMRI inkluderer bruk av neste-generasjons opsins som røde-skiftet opsins å aktivere non-invasiv stimulering under bildebehandling. I tillegg kan implantasjon av MRI-kompatible EEG eller lignende opptakselektroder sammen med den fiberoptiske implantatet tillater anskaffelse av høy temporal oppløsning data i tillegg til de høye romlige oppløsning data for MRI. ofMRI med electrophysiological opptak kan gi omfattende informasjon om den funksjonelle tilkobling av hjernen. I sammendrag, kraften av ofMRI å overvåke hele hjernen i respons til stimulering av spesifikke cellepopulasjoner som er definert ved genetisk eller anatomisk identitet gjør ofMRI en kritisk verktøy til bruk i studiet av nevrologiske sykdommer og av connectomics av den friske hjernen.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported through funding from the NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), Okawa Foundation Research Grant Award, NIH Director’s New Innovator Award (1DP2OD007265), the NSF CAREER Award (1056008), and the Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. would like to thank Karl Deisseroth for providing the DNA plasmids used for the optogenetic experiments. The authors would also like to thank Andrew Weitz and Mankin Choy for editing the manuscript and all the Lee Lab members for their assistance with the ofMRI experiments.
7 Tesla scanner | Agilent Technologies | Discovery MR901 System | |
Sprague Dawley rats | Charles River | Crl:SD | 11 weeks old |
fiber cleaver | Fujikura | CT-05 | |
multimode optical fiber | Thor Labs | AFS105/125Y | |
fiber stripper | Thor Labs | T08S13 | |
ceramic split sleeve | Precision Fiber Products | SM-CS1140S | |
epoxy glue | Thor Labs | G14250 | |
cotton-tipped applicators | Stoelting Co. | 50975 | |
multimode ceramic zirconia ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2002 | |
FC/PC multimode connector | Thor Labs | 30128C3 | |
fiber optic polishing disk | Precision Fiber Products | M1-80754 | |
aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm | Thor Labs | LFG03P | |
aluminum oxide lapping sheet, 1 µm | Thor Labs | LFG1P | |
aluminum oxide lapping sheet, 3 µm | Thor Labs | LFG3P | |
binocular biological microscope 40X-1000X | Amscope | B100 | |
laser safety glasses | Kentek | KXL-62W01 | |
473 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0473 | |
594 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0594 | |
Allen hex wrench set | 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser | ||
power meter, Si Sensor, 400-1100 nm | Thor Labs | PM121D | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | |
isoflurane vaporizer with induction chamber | VetEquip | 901806 | |
NanoFil 100uL syringe | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | |
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
function generator | A.M.P.I. | Master-8 | |
small animal stereotax | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Model 683 small animal ventilator | Harvard Apparatus | 550000 | |
Type 340 capnograph | Harvard Apparatus | 733809 | |
dental drill (rotary micromotor kit) | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
ophthalmic ointment (Artificial Tears) | Rugby | 00536-6550-91 | |
instrument sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | glass bead sterilizer |
antibiotic powder | Pfizer | NEO-PREDEF | neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride |
buprenorphine painkiller | Hospira | NDC:0409-2012 | schedule III controlled substance , 0.3 mg/mL stock |