This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.
The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain’s global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.
Optogenetic funktionell magnetisk resonanstomografi (ofMRI) är en ny teknik som kombinerar den rumsliga upplösningen i hög fält fMRI med precision optogenetic stimulering 1-11,38, möjliggör celltyp-specifik kartläggning av funktionella nervbanor och deras dynamik i hela hjärna. Optogenetik möjliggör specifika celltyper som riktas för stimulering av införandet av ljuskänsliga transmembran konduktans kanaler, som kallas opsins. Specifika delar av neurala kretsar är genetiskt modifierade för att uttrycka dessa kanaler, vilket möjliggör millisekund-tidsplan modulering av aktivitet i den intakta hjärnan 1-15. fMRI tillhandahåller en icke-invasiv metod för att bestämma hjärnans globala dynamiska svar på optogenetic stimulering av specifika nervbanor genom mätning av signal blod-syre-nivåberoende (FET) 16 till 18, som ger en indirekt mätning av neuronal aktivitet.
Kombinationen av dessa två tekniker, benämnda optogenetic funktionell magnetisk resonanstomografi (ofMRI), är fördelaktig jämfört med andra metoder för att registrera hjärnans aktivitet under stimulering, såsom elektrofysiologi eftersom det kan ge en bild av hela hjärnan vid relativt hög rumslig upplösning. Detta möjliggör detektion av neuronal aktivitet som svar på riktad stimulering på stora avstånd från platsen för stimuleringen utan behov för implantation av invasiva registreringselektroderna 1-11. ofMRI är fördelaktig jämfört med mer traditionella metoden att utföra elektrisk stimulering under fMRI, som kan rekrytera olika celltyper nära elektroden och sålunda förvirra den kausala påverkan av varje population 19. Dessutom elektrod används för elektrisk stimulering och den genererade strömmen kan producera artefakter under MR-avbildning 20. I själva verket, ofMRI möjliggör observation av påverkan på den globala hjärnaktivitet från den specifika modulatipå av en stor mångfald av celltyper genom användning av avancerade genetiska inriktningstekniker såsom Cre-Lox-systemet i transgena djur eller användning av promotorer. Kombinato optisk styrning med hela hjärnan övervakning är möjlig med ofMRI genom användning av både NpHR att inhibera och ChR2 att excitera specifika celltyper. Den optogenetic verktyg tillgängliga för användning i ofMRI också snabbt förbättras över tiden med införandet av opsins med ökad ljuskänslighet eller förbättrade kinetiken av stabiliserade steg funktions opsins (SSFOs) eller av röda skiftade opsins som kan förneka behovet av implanterad fiber optik, vilket möjliggör icke-invasiv stimulering under avbildning 21. Dessa möjligheter är inte tillgängliga med elektrisk stimulering.
Emellertid har signalartefakter som resulterar från vävnadsuppvärmning på grund av ljus leverans i hjärnan har rapporterats 22, där temperaturframkallad modifiering av relaxationstider har visat sig producera pseudo aktivering. Forskare utför ofMRI bör därför vara medvetna om denna potential FÖRVÄXLA. Med rätt inställning och kontroll, kan problemet lösas. Dessutom kan relativt låg tidsupplösning för att mäta den hemodynamiska svaret i fMRI vara en begränsande faktor för vissa tillämpningar av denna teknik.
Detta protokoll först beskriver konstruktionen av de fiberoptiska implantat som möjliggör leverans av specifika våglängder av ljus djupt in i hjärnan in vivo. Protokollet beskriver sedan leveransen av opsin-kodande viral vektor till en exakt hjärna region med stereotaktisk kirurgi. Nästa protokollet beskriver processen för hela hjärnan funktionell MRI under samtidig lätt stimulering. Slutligen beskriver protokollet grundläggande dataanalys av de förvärvade data.
Notera den optogenetik beskrivs här kräver en kronisk implantat för ljus leverans. Emellertid de fiberoptiska implantat är stabila och bio-kompatibla, vilket möjliggör longitudinell skanning och undersökning av neurala kretsar under en period på några månader 23,24.
Sammanfattningsvis den exakta stimulering och hela hjärnan övervakning förmåga ofMRI är avgörande faktorerna för att göra ofMRI ett kraftfullt verktyg för att studera de connectomics av hjärnan. Dessutom kan det tillhandahålla nya insikt i de mekanismer av neurologiska sjukdomar 25 när den kombineras med ett flertal djurmodeller. I själva verket har ofMRI använts för att belysa nätverksaktivitet distinkta hippocampus regioner i samband med kramper 8. Därför kommer laboratorier som är intresserade av att svara på systemnivå neurovetenskap frågor hitta denna teknik av betydelse.
Rörelse av ämnet under avbildning är en betydande källa till artefakt som kan leda till att data skadas. Lämpligt säkra djuret på bild vaggan kan minimera sådana artefakter som kommer upprätthålla lämpliga anestesinivåer. Här har vi använt isofluran men alternativa anestetika, såsom medetomidin eller ketamin och xylazin, bör också övervägas. Däremot kan nivåerna och val av anestesi påverka många parametrar i hjärnan, inklusive BOLD svaret 28. Isofluran kan orsaka förändringar i neuronal retbarhet 29. Andra anestetika kan också påverka GABA synaptiska hämning 30. Således är valet av anestesi viktigt när som utför ofMRI med tanke på dess förmåga att påverka nervaktivitet. ofMRI i frånvaro av anestesi är möjligt, men kan vara utmanande med ökad rörelse från djuret, som kan reduceras om djuret är vana; sådana vaken ofMRI studier har tidigare utförts ennd skulle undvika feltolkning på grund av anestesi på hjärnan 9,10. Efterbehandling rörelse korrektionsalgoritmer kan användas för att i hög grad mildra effekterna av rörelse. Flera av dessa metoder finns, inklusive den inversa Gauss-Newton-algoritmen som används i detta protokoll, vilket minimerar summan av kvadraterna kostnadsfunktionen för referensbilden och bilden under korrigering. Algoritmen är användbart eftersom det möjliggör snabb och robust rörelse korrigering, med hjälp av en GPU parallell plattform design för att minska handläggningstiderna 27.
För återuppbyggnad data i detta protokoll, var specialskriven mjukvara i en MATLAB miljö som används för tvådimensionell gridding rekonstruktion, där spiral prover rekonstrueras i k-space i inrutade bilder 31-33. tidsseriedata genererades genom att beräkna procent modulering av BOLD signal för varje voxel i förhållande till referensperioden samlas före stimulering. Voxlar vars tidsserierna synchronized block med optogenetic stimulering med samstämmighet värde på 0,35 eller högre definierades som aktiverade voxlar; denna samstämmighet värde motsvarar en mindre än 10 -9 P-värde 8. Koherens-värden beräknades som storleken av fouriertransformen vid frekvensen av upprepade stimuleringscykler dividerat med summan-av-kvadraterna av alla frekvenskomponenter 8,27. Familywise felet kan styras med Bonferroni korrigering för multipla jämförelser. Alternativa analysmetoder kan användas, inklusive parametriska statistiska tester såsom allmänna linjära modeller (GLMS). Samstämmigheten metod kräver mindre förkunskaper om HRF jämfört med den konventionella allmänna linjära modellen. Därför är det fördelaktigt när utforska data med ofMRI. Däremot kan samstämmigheten metoden endast användas för data med blockera mönster eller valda händelserelaterade mönster med en fast interstimulus intervall och kan inte användas i ofMRI data med andra händelse relaTed designar eller blandade mönster. Därefter kan dynamisk orsaks modellering (DCM) användas för att analysera interaktioner mellan områden i hjärnan som identifierats genom ofMRI. DCM är en Bayesiansk statistisk teknik som utvecklats för analys av funktionell anslutning via systemsvar till experimentella ingångar under fMRI 34.
Ytterligare tekniska problem för ofMRI diskuteras här. Implantat kan skadas eller falla bort, vilket leder till avlägsnande av den drabbade djuret från studien. Re-implantation operationer rekommenderas inte på grund av den ytterligare osäkerhet att rikta samma ROI som i den ursprungliga implantationskirurgi och på grund av djurskyddsfrågor. På grund av den betydande mängd tid och resurser investeras i varje djurindivid, är hänsyn till materialets hållfasthet en betydande oro när man väljer en lämplig dentalcement för användning i ofMRI studier. Implantationen kirurgi är en kritisk faktor för att maximera livslängden av den implant och djurpatient. Till exempel, se till att skallen är torr innan dentalcement och placera en tillräcklig mängd cement runt den keramiska hylsan implantatet kan garantera stabilitet över potentiella månader långa tidslinjen för djuret under studien. Dessutom kan alternativa bur mönster undersökas och diskuteras med den lokala djurvård möjlighet att undvika burar med tråd toppar håller mat och vatten som ofta sträcker sig in i buren och ge möjligheter för djuret att skada implantatet. Viktigt, måste dentalcement väljas med omsorg för att minska artefakter som påverkar imaging och alternativa cement kan testas genom applicering på en fantom och bildbehandling i en scanner före användning i djurförsök. Trial and error med olika tandcement har visat att cement som används i detta protokoll ger relativt få artefakter. En annan teknisk utmaning i att utföra ofMRI är noggrannheten av den fiberoptiska placering vid den avsedda ROI, med tanke på extremely små avstånd som kan finnas mellan kärnor i hjärnan 35. Efter avslutad implantation operationer kan T2-viktade anatomiska skannar användas för att bestämma korrekt placering genom att lägga på en hjärna atlas. Skicklighet kirurgen och praxis att utföra dessa operationer kan förbättra korrekt placering priser. kan verifieras specificiteten och uttryck av opsin vid den avsedda ROI vid slutet av studien genom perfusion djuret och fastställande av hjärnan med hjälp av immunohistokemi eller endogena fluorescens av en reporter-protein taggade till opsin för visualisering. Dessa rapportörproteiner kan även samlokaliserades med andra proteiner för att säkerställa att opsin uttrycks i de önskade neurala celltyper 1,8,15,25. Som tidigare nämnts, kan artefakter uppstå när du utför ofMRI på grund av uppvärmning av vävnad från ljus leverans 22. Vävnads uppvärmning orsakar modifiering av relaxationstider, vilket resulterar i falsk BOLD signal. Att se till att activation till följd av ljus stimulering under ofMRI är inte på grund av denna artefakt, bör opsin-negativa kontroller utföras i vilken antingen saltlösning injicerade djur eller djur som injicerats med kontroll fluorofor vektorer (såsom AAV-CaMKIIa-EYFP) genomgå ofMRI. Dessutom bör endast väl konstruerat fiberoptiska implantat med god ljustransmission verkningsgrad användas för att ta bort behovet av att använda höga lasereffekter. ofMRI studier har genomförts där falsk aktivering på grund av uppvärmning av vävnad har inte varit ett problem 1,6-8,10,11.
När det gäller valet av vektor för att införa de nödvändiga optogenetic gener i neuroner för expression, är AAV inte kända för att orsaka sjukdom hos människor och är därför ett bekvämt alternativ, med tanke på den lägre skyddsnivå som krävs för att använda dessa medel (BSL-1). Dessutom har en mängd vektorkärnor bär AAV förpackade med olika optogenetic gener i lager och med flera serotyper. Serotyp AAV måste väljas bvisar därmed den avsedda cellpopulationen mål att säkerställa optimala expressionsnivåer 36,37. Lentivirus kan också användas, men kräver en högre skyddsnivå. Den tidsperiod som krävs för tillräcklig expression av de optogenetic gener är variabel beroende på den specifika djurmodell som används, på den speciella AAV som används och på den specifika experimentella paradigm. I detta protokoll är Sprague Dawley råttor vid 11 veckor gamla användas och optogenetic studier börjar fyra till sex veckor efter virusinjektion. Transgena möss kan även användas i optogenetic studier. Det är nödvändigt att utföra pilotförsök för att bestämma den specifika tid som krävs för tillräcklig expression av opsins. Stimulering paradigm kan variera beroende på den specifika opsin används. I detta protokoll är AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP används och stimulans paradigm är 20 sekunder på / 40 sek av. Om du använder en SSFO kommer stimulerings paradigm variera eftersom SSFO kräver endast en kort ljuspuls att vara acveras och sedan en kort puls av ljus vid en annan våglängd, som skall avslutas.
En ytterligare kritisk oro när du utför ofMRI hindrar ljusläckage från hylsan implantat gränssnitt med fiberoptiska patch-kabel under optogenetic stimulering för att förhindra en confounding hjärna signal som härrör från visuell stimulans, även när djuret bedövas. Koner av svart eltejp kan användas för att blockera ljuset från hylsorna och för att täcka ögonen på djuret. Viktigt, måste fysiologiska värden inklusive utandnings CO2 och kroppstemperatur av ämnet underhållas under hela bild. Expiratorisk CO 2 bör hållas mellan 3-4% och kroppstemperaturen vid 37 ° C. Dessutom, för att kompensations sekvenserna minska så mycket inhomogenitet som möjligt i det magnetiska fältet före start ofMRI skannar kraftigt avgör kvaliteten på de resulterande BOLD data. Kontroll av dessa faktorerär avgörande för att producera tillförlitliga ofMRI uppgifter. I detta protokoll är DPSS lasrar används som ljuskälla för optogenetic stimulering. Eftersom laserljus är sammanhängande, kan mer än tillräckligt med kraft lätt levereras via fiberoptik. LED-ljuskällor som är kopplade till fiberoptik är tillgängliga från kommersiella leverantörer, men har nackdelen av att minskade kraften i ljustransmission. Laserljuskällan kräver anpassning till varje enskild fiberoptisk patchkablage, men med övning kan anpassning ske inom några sekunder till minuter.
Framtida tillämpningar av ofMRI inkluderar användningen av nästa generations opsins såsom röda skiftade opsins för att möjliggöra icke-invasiv stimulering under avbildning. Dessutom kan implantation av MR-kompatibel EEG eller liknande inspelningselektroder tillsammans med den fiberoptiska implantatet möjliggöra förvärv av hög tidsupplösning uppgifter utöver de hög rumslig upplösning data för MRI. ofMRI med electrophysiological inspelning kan ge omfattande information om den funktionella anslutning av hjärnan. Sammanfattningsvis, makt ofMRI att övervaka hela hjärnan som svar på stimulering av specifika cellpopulationer definieras av genetiska eller anatomiska identitet gör ofMRI ett kritiskt verktyg att använda i studiet av neurologiska sjukdomar och de connectomics av frisk hjärna.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported through funding from the NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), Okawa Foundation Research Grant Award, NIH Director’s New Innovator Award (1DP2OD007265), the NSF CAREER Award (1056008), and the Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. would like to thank Karl Deisseroth for providing the DNA plasmids used for the optogenetic experiments. The authors would also like to thank Andrew Weitz and Mankin Choy for editing the manuscript and all the Lee Lab members for their assistance with the ofMRI experiments.
7 Tesla scanner | Agilent Technologies | Discovery MR901 System | |
Sprague Dawley rats | Charles River | Crl:SD | 11 weeks old |
fiber cleaver | Fujikura | CT-05 | |
multimode optical fiber | Thor Labs | AFS105/125Y | |
fiber stripper | Thor Labs | T08S13 | |
ceramic split sleeve | Precision Fiber Products | SM-CS1140S | |
epoxy glue | Thor Labs | G14250 | |
cotton-tipped applicators | Stoelting Co. | 50975 | |
multimode ceramic zirconia ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2002 | |
FC/PC multimode connector | Thor Labs | 30128C3 | |
fiber optic polishing disk | Precision Fiber Products | M1-80754 | |
aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm | Thor Labs | LFG03P | |
aluminum oxide lapping sheet, 1 µm | Thor Labs | LFG1P | |
aluminum oxide lapping sheet, 3 µm | Thor Labs | LFG3P | |
binocular biological microscope 40X-1000X | Amscope | B100 | |
laser safety glasses | Kentek | KXL-62W01 | |
473 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0473 | |
594 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0594 | |
Allen hex wrench set | 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser | ||
power meter, Si Sensor, 400-1100 nm | Thor Labs | PM121D | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | |
isoflurane vaporizer with induction chamber | VetEquip | 901806 | |
NanoFil 100uL syringe | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | |
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
function generator | A.M.P.I. | Master-8 | |
small animal stereotax | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Model 683 small animal ventilator | Harvard Apparatus | 550000 | |
Type 340 capnograph | Harvard Apparatus | 733809 | |
dental drill (rotary micromotor kit) | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
ophthalmic ointment (Artificial Tears) | Rugby | 00536-6550-91 | |
instrument sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | glass bead sterilizer |
antibiotic powder | Pfizer | NEO-PREDEF | neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride |
buprenorphine painkiller | Hospira | NDC:0409-2012 | schedule III controlled substance , 0.3 mg/mL stock |