The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.
During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.
Xenopus laevis egg ekstrakt er en kraftig og mye brukt verktøy for å studere kompliserte cellulære hendelser i enkelhet i en celle-fri analysen. Siden sin første beskrivelsen av Lohka & Masui en de har vært mye brukt til å studere mitotiske prosesser som kromatin kondens 2, spindelenheten 3, kjernekraft konvolutt sammenbrudd 4, men også nucleocytoplasmic transport 5 eller DNA replikasjon 6. De hendelser som finner sted i slutten av mitose, nødvendige for reformasjon av den interphasic kjernen som kjernekraft konvolutt reformasjon og kjernefysisk pore kompleks sammensetting er mye mindre forstått i forhold til de tidlige mitotiske hendelser, men kan være like studert ved hjelp Xenopus egg ekstrakt 7. Vi har nylig etablert et assay basert på Xenopus egg ekstrakt for å studere kromatin decondensation ved slutten av mitose 8, en under-prosess undersøkt som venter its detaljert karakterisering.
I metazoans er kromatin høyt kondensert ved mitotisk oppføring for å utføre trofast segregering av det genetiske materialet. For å sikre at kromatin er tilgjengelig for genekspresjon og DNA-replikasjon under interfase, må det være de-komprimeres i enden av mitose. I virveldyr, er kromatin opptil femti ganger mer komprimert i løpet av mitose i forhold til inter 9, i motsetning til gjær hvor den mitotiske komprimeringen er vanligvis langt lavere, for eksempel bare to ganger i S. cerevisiae 10. Virveldyr kromatin decondensation har vært mest studert i sammenheng med sperm DNA omorganisering etter egg befruktning. En molekylære mekanismen, der nucleoplasmin, en rikelig eggcelle protein, utveksler sperm spesifikke protaminer til histoner H2A og H2B lagret i egget. Denne prosessen ble også belyst ved hjelp Xenopus egg ekstrakt 11, 12. Med uttrykketav nucleoplasmin er begrenset til oocytter 13 og mitotisk kromatin ikke inneholder disse sperm spesifikke protaminer. Derfor kromatin decondensation på slutten av mitose er nucleoplasmin uavhengig 8.
For in vitro decondensation reaksjon ansetter vi ekstrakt generert fra aktiverte X. laevis egg og kromatin klynger isolert fra synkroniserte HeLa celler. Behandling av egg med en kalsiumionofor ligner kalsium slipper inn i eggcelle generert av sperm oppføring under befruktning. Kalsium bølge utløser cellesyklusen gjenopptakelse og egget, arrestert i den andre metafase av meiose, utvikler seg til den første inter 14. Derfor egg ekstrakter fremstilt skjema aktivert egg representerer mitotisk exit / inter staten og er kompetente til å fremkalle hendelser spesifikke for mitotisk exit som kromatin decondensation, kjernekraft konvolutt og pore kompleks reformasjon. For isolering av mitotisk chromatin klynger vi brukte en litt modifisert versjon av protokollen publisert av Gasser og Laemmli 15, hvor kromosom klynger blir frigjort ved lysis fra HeLa-celler synkronisert i mitose, og isoleres i polyamin inneholdende buffere graderte sentrifugeringer.
Xenopus laevis egg ekstrakter er et svært nyttig verktøy for å gjengi cellulære prosesser in vitro, og dette systemet ble brukt i karakterisering av cellesyklus og celledeling hendelser 2, 3,5,6,17. På grunn av store lagre av kjernekomponentene deponeres i egget under oogenesen, egg ekstrakter er en utmerket kilde til cellulære komponenter. Sammenlignet med andre fremgangsmåter som RNAi i mammalske vev cellelinjer eller genetisk manipulasjon, det gir flere fordeler: Det cel…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av den tyske Research Foundation og ERC (AN377 / 3-2 og 309528 CHROMDECON til WA) og en PhD Fellowship of the Boehringer Ingelheim Fonds til AKS Figur 1 & 2 er gjengitt fra Developmental Cell 31 (3), Magalska et al., RuvB lignende ATPaser funksjon i kromatin decondensation på slutten av mitose, 305-318, 2014, med tillatelse fra Elsevier.
spermine tetrahydrochloride | Fluka analytical | 85610-25G | |
spermidine trihydrochloride | Sigma | S2501-5G | |
high-purity digitonin | Millipore | 300410-1GM | toxic |
PMSF | Applichem | A0999,0100 | toxic |
thymidine | Calbiochem | 6060 | |
nocodazole | Calbiochem | 487928 | toxic |
37 % formaldehyde solution | Roth | 7398-1 | toxic |
trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | toxic |
1,4-dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.2 | |
AEBSF hydrochloride | Applichem | A1421,0001 | |
pepstatin | Roth | 2936.1/2/3 | |
leupeptin | Roth | CN334 | |
aprotinin | Roth | A162.3 | |
Percoll (colloidal silica particles solution) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
glutamine | Gibco | 25030-024 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
75 cm² tissue culture flasks | Greiner Bio-one | 658175 | |
heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
Homogenizer (40 mL tissue grinder) | Wheaton | 357546 | |
Neubauer chamber | Assistent | 441/1 | |
Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml) | Nalgene | 3118-0050 | |
100 µm cell strainer, nylon | BD Falcon | 352360 | |
cytochalasin B | Applichem | A7657,0010 | toxic |
cycloheximide | Roth | 8682.3 | toxic |
L-cystein | Merck | 1,028,381,000 | |
hCG available as Ovogest | MSD | 1431593 | |
PMSG available as Intergonan | MSD | 1431015 | |
A23187 (mixed calcium-magnesium-salt) | Enzo | ALX-450-002-M010 | toxic |
syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") | Braun | 4665120 | |
ATP | Serva | 10920.03 | |
GTP, 2 Na x 3 H20 | Roth | K056.1/2/3/4 | |
creatine phosphat disodium salt | Calbiochem | 2380 | |
creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
DMAP | Sigma | D2629-1G | |
DAPI | Roche | 10236276001 | |
PFA | Sigma | P-6148 | toxic |
centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.) | Beckman Coulter | 343775 | |
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 1000 µL) | Biozym | 729065 | |
50 % glutaraldehyde solution, grade I | Sigma alderich | G7651-10 mL | toxic |
0.1 % (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920-100 mL | |
flat-bottom tubes (6 mL, 16.0/55 mm) | Greiner Bio-one | 145211 | |
Vectashield mounting medium | Vector laboratories | H1000 | |
tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.) | Beckman Coulter | 343778 | |
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µL) | Biozym | 729055 | |
12 mm coverslips | Thermo Scientific | 0784 #1 |