The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.
During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.
Xenopus laevis ägg extrakt är en effektiv och allmänt tillämpad verktyg för att studera komplicerade cellulära händelser i enkelheten hos en cellfri analys. Sedan sin första beskrivning av Lohka & Masui ett de har i stor utsträckning använts för att studera mitotiska processer såsom kromatinkondensation 2, spindelaggregatet 3, kärnhöljet uppdelning 4, men också nucleocytoplasmic transporter 5 eller DNA-replikation 6. De händelser som äger rum i slutet av mitos, som är nödvändiga för reformeringen av interphasic kärnan såsom kärnhöljet reformation och nukleär por komplex montering är mycket mindre förstod jämfört med de tidiga mitotiska händelser, men kan på liknande sätt studeras med hjälp av Xenopus äggextrakt 7. Vi har nyligen etablerat en analys baserad på Xenopus äggextrakt att studera kromatin decondensation vid slutet av mitos 8, ett undersökte processen som väntar its detaljundersökningarna.
I metazoans är kromatin starkt kondenseras vid mitotisk inträde för att utföra troget segregering av det genetiska materialet. För att säkerställa att kromatinet är åtkomlig för genexpression och DNA-replikation under interfas, måste det vara de-komprimeras i slutet av mitos. I ryggradsdjur är kromatin upp till femtio-faldigt mer kompakterad under mitos jämfört med interfas 9, till skillnad från jäst där mitotiska kompakte är vanligtvis mycket lägre, t ex endast två gånger i S. cerevisiae 10. Ryggradsdjur kromatin decondensation har främst studerats i samband med sperma DNA omorganisation efter ägg befruktning. En molekylär mekanism, där nucleoplasmin, en riklig äggcell protein, utbyter spermier specifika protaminer till histoner H2A och H2B lagrade i ägget. Denna process också belysas med hjälp av Xenopus äggextrakt 11, 12. Uttrycketav nucleoplasmin är begränsad till ägg 13 och mitotisk kromatin inte innehåller dessa spermier specifika protaminer. Därför kromatin decondensation i slutet av mitos är nucleoplasmin oberoende 8.
För in vitro decondensation reaktion sysselsätter vi utdrag genereras från aktiverade X. laevis ägg och kromatin kluster isolerade från synkroniserade HeLa-celler. Behandling av ägg med en kalciumjonofor härmar kalcium utsläpp i äggcellen som genereras av spermier inträde under befruktningen. Kalcium vågen utlöser cellcykeln återupptas och ägget, greps i andra meta av meios, går vidare till den första interfas 14. Därför ägg extrakt framställda bildar aktiverade ägg representerar den mitotiska exit / interfas tillstånd och är kompetenta att inducera händelser som är specifika för mitotiskt exit som kromatin decondensation, kärnhöljet och pore komplexa reformation. För isolering av mitotisk chromatin kluster vi använde en något modifierad version av protokollet publiceras av Gasser & Laemmli 15, där kromosomkluster frigörs genom lys från HeLa-celler synkroniserade i mitos och isolerad i polyamin innehållande buffertar med lutning centrifuge.
Xenopus laevis ägg extrakt är ett mycket användbart verktyg för att återge cellulära processer in vitro, och detta system framgångsrikt använts i karakterisering av cellcykeln och celldelning händelser 2, 3,5,6,17. På grund av stora förråd av nukleära komponenter sekvestrerade i ägget under oogenes, ägg extrakt är en utmärkt källa till cellkomponenter. Jämfört med andra metoder som RNAi på däggdjursvävnadscellinjer eller genmanipulation, erbjuder flera förd…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av det tyska Research Foundation och ERC (AN377 / 3-2 och 309.528 CHROMDECON till WA) och en doktorsexamen Sagan om Boehringer Ingelheim Fonds till AKS Figur 1 & 2 är omtryckt från Developmental Cell 31 (3), Magalska et al., RuvB liknande ATPaser funktion i kromatin decondensation i slutet av mitos, 305-318, 2014, med tillstånd från Elsevier.
spermine tetrahydrochloride | Fluka analytical | 85610-25G | |
spermidine trihydrochloride | Sigma | S2501-5G | |
high-purity digitonin | Millipore | 300410-1GM | toxic |
PMSF | Applichem | A0999,0100 | toxic |
thymidine | Calbiochem | 6060 | |
nocodazole | Calbiochem | 487928 | toxic |
37 % formaldehyde solution | Roth | 7398-1 | toxic |
trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | toxic |
1,4-dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.2 | |
AEBSF hydrochloride | Applichem | A1421,0001 | |
pepstatin | Roth | 2936.1/2/3 | |
leupeptin | Roth | CN334 | |
aprotinin | Roth | A162.3 | |
Percoll (colloidal silica particles solution) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
glutamine | Gibco | 25030-024 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
75 cm² tissue culture flasks | Greiner Bio-one | 658175 | |
heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
Homogenizer (40 mL tissue grinder) | Wheaton | 357546 | |
Neubauer chamber | Assistent | 441/1 | |
Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml) | Nalgene | 3118-0050 | |
100 µm cell strainer, nylon | BD Falcon | 352360 | |
cytochalasin B | Applichem | A7657,0010 | toxic |
cycloheximide | Roth | 8682.3 | toxic |
L-cystein | Merck | 1,028,381,000 | |
hCG available as Ovogest | MSD | 1431593 | |
PMSG available as Intergonan | MSD | 1431015 | |
A23187 (mixed calcium-magnesium-salt) | Enzo | ALX-450-002-M010 | toxic |
syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") | Braun | 4665120 | |
ATP | Serva | 10920.03 | |
GTP, 2 Na x 3 H20 | Roth | K056.1/2/3/4 | |
creatine phosphat disodium salt | Calbiochem | 2380 | |
creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
DMAP | Sigma | D2629-1G | |
DAPI | Roche | 10236276001 | |
PFA | Sigma | P-6148 | toxic |
centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.) | Beckman Coulter | 343775 | |
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 1000 µL) | Biozym | 729065 | |
50 % glutaraldehyde solution, grade I | Sigma alderich | G7651-10 mL | toxic |
0.1 % (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920-100 mL | |
flat-bottom tubes (6 mL, 16.0/55 mm) | Greiner Bio-one | 145211 | |
Vectashield mounting medium | Vector laboratories | H1000 | |
tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.) | Beckman Coulter | 343778 | |
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µL) | Biozym | 729055 | |
12 mm coverslips | Thermo Scientific | 0784 #1 |