Fysisk Isolering av endospores fra miljøprøver ved Målrettet Lysis av vegetative celler
Summary
A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.
Abstract
Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.
Introduction
Målet med dette arbeidet er å tilveiebringe en protokoll for separering av bakterielle endospores fra vegetative bakterieceller i miljøprøver. Dannelsen av bakterielle endospores er en overlevelsesstrategi, vanligvis utløst av sult, som finnes i en rekke bakterielle grupper som hører til rekken firmicutes 1. Endosporer dannende bakterier er godt studert, hovedsakelig fordi en rekke stammer er patogener og dermed av medisinsk betydning (f.eks, Bacillus anthracis eller Clostridium difficile). Miljø stammer av endosporer dannende bakterier har blitt isolert fra nesten alle miljø (jord, vann, sediment, luft, is, menneskelige tarmen, dyr gut, og mer) 1-3. Derfor firmicutes er det nest vanligste phylum i kultursamlinger 4.
På grunn av sine hardføre ytre cortex og beskyttende kjerneproteiner, kan endospores overleve ekstreme miljøforhold som strekker seg from uttørking til høy stråling, ekstreme temperaturer og skadelige kjemikalier 5. Denne bemerkelsesverdige motstand gjør det til en utfordring å trekke ut DNA fra endospores 6-8. Dette forklarer trolig hvorfor de har blitt oversett i miljøsekvense studier 9,10. Andre metoder, slik som målretting av endosporer i miljøprøver ved fluorescerende antistoffer 11, kvantifisering av dipikolinsyre (DPA) i jord og sedimenter 13 12, strømningscytometri 14 eller pasteuriseringen og etterfølgende dyrking 15,16 har blitt brukt for å hente eller kvantifisere i endospores miljøprøver. I de siste årene har optimalisert DNA-ekstraksjon metoder samt spesifikke molekylære primere målrette endosporer spesifikke gensekvenser er utviklet 10,17-20. Dette har bidratt til å avsløre mer biologisk mangfold blant denne gruppen av bakterier 21 og har også ført til applikasjoner innen industri og medisin for påvisning av endosporesFor eksempel i melk pulver 19.
Protokollen som presenteres her er basert på forskjellen i motstand mot skadelige fysiske og kjemiske forhold (for eksempel varme og vaskemidler) av bakterielle endospores forhold til vegetative celler. For å ødelegge vegetative celler i en prøve, vi fortløpende anvende varme, lysozym og lave konsentrasjoner av vaskemidler. Tiden og styrken av disse behandlinger har blitt optimalisert for ikke å ødelegge sporer, men for å lysere alle vegetative celler. Noen celler i et miljø celle basseng er mer motstandsdyktig enn andre, slik at for å øke sannsynligheten for å ødelegge alle vegetative celler, kan vi bruke tre forskjellige behandlinger. Fordelen og nye ved denne fremgangsmåte er at endospores etter behandlingen er fortsatt intakt og kan brukes for videre nedstrøms analyser. Disse omfatter DNA-ekstraksjon, kvantitativ PCR (qPCR) og fragment eller metagenomic sekvensering (spesielt rettet mot gruppen av endosporer, og dermed redusere diversity, mens økende dekning). De endospores kan også brukes til nedstrøms dyrking eller kvantifisering av fluorescens mikroskopi, flowcytometri, eller deteksjon av DPA. Et viktig trekk ved denne metoden er at ved å sammenligne en ubehandlet prøve med en behandlet prøve, kan man utlede den mengde og mangfoldet av endosporer i en miljøprøve i tillegg til den komponent som svarer til vegetative celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Motstanden i endosporer til eksterne fysiske og kjemiske aggressive faktorer (for eksempel temperatur eller vaskemidler) ble brukt til å utvikle en metode for å skille bakterielle endospores fra vegetative celler i miljøprøver. Dette er den første fremgangsmåte omfattende å isolere endospores fra miljøprøver i en ikke-destruktiv måte. Tidligere metoder for å kvantifisere, oppdage eller analysere endospores i prøvene var basert på måling av spesifikke fullmakter for endospores som dipikolinsyre ell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne erkjenner den sveitsiske National Science Foundation for Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 og nr 151948, og Fundation Pierre Mercier pour la Science.
Materials
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich | |
References
- Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
- Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
- Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America’s Largest Hot Spring. Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).
- Hugenholtz, P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol. 3 (2), (2002).
- Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes). Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).
- Delmont, T. O., et al. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).
- Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. . Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , (2004).
- Kuske, C. R., et al. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).
- von Mering, C., et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments. Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes. Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).
- Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis. J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).
- Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence. Int J Microbiol. , 435281 (2011).
- Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid. Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).
- Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus. J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).
- de Rezende, J. R., et al. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).
- Hubert, C., et al. Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature. Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).
- Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).
- Brill, J. A., Wiegel, J. Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method. J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).
- Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder. Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).
- Bueche, M., et al. Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A. Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).
- Nicholson, W. L., Law, J. F. Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168. J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).
