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Neuroscience

Parkinsonian दिमाग से घुलनशील और अघुलनशील अल्फा-synuclein की अनुक्रमिक निष्कर्षण

Published: January 5, 2016 doi: 10.3791/53415
Automatic Translation
1
1Reta Lila Weston Institute of Neurological Studies, UCL Institute of Neurology

Abstract

अल्फा-synuclein (α-SYN) प्रोटीन बहुतायत से मुख्य रूप से न्यूरॉन्स के भीतर व्यक्त की, और अलग अलग रूपों की संख्या में मौजूद है - मोनोमर्स, tetramers, oligomers और तंतुओं। बीमारी के दौरान, α-syn प्रोटीन अधिक अघुलनशील बना देती हैं कि oligomers और उच्च आणविक भार समुच्चय के रूप में करने के लिए गठनात्मक परिवर्तन आए। असामान्य रूप से एकत्रित α-syn पार्किंसंस रोग (पीडी), Lewy निकायों (DLB) और विभिन्न सिस्टम शोष (एमएसए) के साथ मनोभ्रंश का नयूरोपथोलोगिकल सुविधा है। बायोकेमिकल लक्षण वर्णन और बढ़ती डिटर्जेंट शक्ति और उच्च गति ultracentrifugation के साथ अघुलनशील α-syn का उपयोग कर बफ़र्स के विश्लेषण के रोग प्रगति के साथ जुड़े α-syn विकृति विज्ञान के विकास का निर्धारण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल पोस्टमार्टम मानव मस्तिष्क के ऊतकों से तेजी से अघुलनशील / एकत्रित α-syn के अलगाव का वर्णन है। इस पद्धति सामान्य और असामान्य α की पढ़ाई करने के लिए संशोधनों के साथ अनुकूलित किया जा सकताअलग α-syn म्यूटेशन को शरण देने ट्रांसजेनिक पशु मॉडल में और साथ ही उनके संबंधित विकृतियों से संबंधित प्रोटीन की न्यायपालिका तंतुमय जमा विशेषता है कि अन्य neurodegenerative रोगों में -syn जीव विज्ञान।

Introduction

कई neurodegenerative रोगों के बीच आम कुंजी रोग सुविधाओं में से एक एक प्रोटीन / रोग विशिष्ट तरीके से एक में होता है कि असामान्य प्रोटीन समुच्चय के गठन की है। इस प्रकार, अल्जाइमर रोग (ई) में न्यूरॉन्स के भीतर विशेषता extraneuronal amyloid बीटा सजीले टुकड़े और एकत्रित hyperphosphorylated ताऊ जमा कर रहे हैं; Lewy निकायों intraneuronal समावेशन जो कर रहे हैं (एलबीएस), में और भी Lewy neurites (LNS) Lewy निकायों (DLBs) 2-4 के साथ पीडी, पीडी पागलपन और मनोभ्रंश में बुलाया dystrophic न्यूरोनल प्रक्रियाओं के भीतर एकत्रित α-syn जमा। असामान्य α-syn जमा भी एमएसए 5 में glial साइटोप्लास्मिक समावेशन की बानगी घावों में देखा जाता है। हंटिंग्टन रोग में, वहाँ विशेषता पाली-क्यू जमा कर रहे हैं, और असामान्य राल डीएनए प्रोटीन-43 और सारकोमा प्रोटीन (FUS) में जुड़े हुए frontotemporal मनोभ्रंश में जमा कर रहे हैं बंधन। महत्वपूर्ण बात है पीडी के लिए, α-syn जीन म्यूटेशन Cau पाया गया हैपीडी 6-11 प्रमुख एसई ऑटोसोमल। इसके अतिरिक्त, α-syn जीन तीन प्रतीया 12 और दोहराव 13 भी इस प्रकार पीडी के pathomechanisms के लिए बढ़ा α-syn अभिव्यक्ति जोड़ने पारिवारिक पीडी का कारण बनता है। विशेष रूप से, छिटपुट और पारिवारिक दोनों पीडी मामलों α-syn विकृति 14 की असामान्य जमा बंदरगाह। पीडी के लिए वर्तमान में उपलब्ध उपचार उपशामक ही कर रहे हैं और रोकने या निष्ठुर रोग प्रगति में देरी पर कोई प्रभाव नहीं है।

α-syn बहुतायत से मानव मस्तिष्क में व्यक्त की और कुल मस्तिष्क प्रोटीन के बारे में 1% बनाता है। यह न्यूरॉन्स के भीतर अधिक विशेष रूप से मौजूद है, लेकिन glial कोशिकाओं के भीतर कम मात्रा में यद्यपि मौजूद कर सकते हैं। एक विवादास्पद बिंदु एक यादृच्छिक मोनोमर 15 के रूप में या एक जोड़ टेट्रामर 16 के रूप में मौजूद कर सकते हैं जो α-syn के देशी संरचना है। बीमारी के दौरान, α-syn यह misfolded पाने के लिए अनुमति देता है कि इसकी रचना में परिवर्तन और इस प्रक्रिया में रोग pathoge का कारण माना जाता हैNesis। Α-syn और रोग के pathophysiological पहलुओं की जांच के कई वर्षों के बावजूद, रोग तंत्र का सही कारण 14 मायावी बने हुए हैं।

Parkinsonian दिमाग का पोस्टमार्टम विश्लेषण का उपयोग अध्ययन इस प्रकार अब तक α-syn छिटपुट पीडी में और भी दोनों LRRK2 जीन 17-22 में परिवर्तन के साथ जुड़े पीडी के सामान्य और असामान्य जीव विज्ञान के बारे में महत्वपूर्ण सुराग प्रदान की है। इधर, डिग्री बदलती करने के α-syn समुच्चय बंदरगाह कि मानव पोस्टमार्टम पीडी मस्तिष्क के ऊतकों से तेजी से अघुलनशील α-syn जमा करने के लिए एक जैव रासायनिक निष्कर्षण प्रोटोकॉल (देखें योजना चित्रा 1 में प्रस्तुत) वर्णित किया गया है। इस तकनीक को भी अन्य neurodegenerative रोगों 23,24 से कुल प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए बफर रचनाओं में संशोधनों के साथ और भी ट्रांसजेनिक पशु मस्तिष्क के ऊतकों 25-27 से अनुकूलित किया जा सकता है। रूपांतरों के लिए मुख्य विचार solubi में मतभेद रहे हैंlity और जिनमें से कुछ संबंधित प्रोटीन की कुल मात्रा में मुख्य रूप से परमाणु होते हैं और FUS 28 के लिए दिखाया गया है इष्टतम निकासी के लिए उच्च नमक बफ़र्स पड़ सकता है।

Protocol

पोस्टमार्टम के मस्तिष्क के ऊतकों मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के लिए रानी स्क्वायर ब्रेन बैंक को दान कर दिया था, यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन, नैतिकता की दृष्टि से मंजूरी दे दी प्रोटोकॉल का उपयोग करने और तंत्रिका विज्ञान के संस्थान मानव ऊतक प्राधिकारी द्वारा जारी लाइसेंस के तहत शोध के लिए संग्रहीत (एचटीए) ब्रिटेन (सं। 12198)। इस प्रोटोकॉल (तालिका 1) के लिए इस्तेमाल मामलों की सूची देखें।

बफ़र की 1. तैयारी

  1. 1X टीबीएस (Tris बफर खारा) बफर तैयार:
    1. 500 मिमी Tris एचसीएल पीएच 7.4 और 1500 मिमी NaCl के साथ शेयर समाधान के रूप में 10X टीबीएस तैयार करें।
      1. बाहर 60.5 छ Tris सीएल पीएच 7.6 और उच्च शुद्धता पानी की 800 मिलीलीटर में सोडियम क्लोराइड की 87.6 ग्राम वजन। 1 एम एचसीएल के साथ पीएच को समायोजित और 1 एल के लिए अंतिम स्टॉक की मात्रा बनाने
    2. आसुत जल में शेयर 10 गुना गिराए 1X टीबीएस के अंतिम एकाग्रता तैयार करें।
    3. जोड़ें प्रोटीज अवरोधकों (पीआई), (50 मिलीलीटर बफर प्रति एक गोली) और फॉसफोरस रोक फॉस्फेट अवरोध करनेवाला गोलियाँ (1 गोली बफर के 10 मिलीलीटर प्रति) के लिएप्रोटिएजों और फास्फेटेजों की गैर विशिष्ट एंजाइमी कार्यों के प्रभाव निराकृत।
      नोट: यहाँ हम निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया जा सकता रॉश से गोलियों लेकिन समान रूप से अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अवरोधकों अवरोध करनेवाला एंजाइम का इस्तेमाल किया है।
  2. (7.4 पीएच) 1X टीबीएस के लिए / सोडियम वी dodecyl सल्फेट (एसडीएस) डब्ल्यू बफर 5% जोड़कर टीबीएस एसडीएस बफर तैयार करें। एसडीएस solubilize के लिए एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग करते हुए लगातार सरगर्मी के साथ 60 डिग्री सेल्सियस का हल हीट।
  3. 8 एम / 1X टीबीएस एसडीएस बफर करने के लिए वी डब्ल्यू (7.4 पीएच) के अंतिम एकाग्रता के लिए यूरिया जोड़कर टीबीएस एसडीएस यूरिया बफर तैयार करें। यूरिया भंग करने के लिए एक चुंबकीय दोषी पर लगातार सरगर्मी के साथ 60 डिग्री सेल्सियस का हल हीट।

2. नमूना homogenization और विभेदक ultracentrifugation

नोट: काम के निम्न भाग एचटीए ब्रिटेन के नियमों के अनुसार मानव मस्तिष्क के ऊतकों की हैंडलिंग शामिल है। स्थानीय मानक संचालन प्रक्रियाओं सभी ती पर पीछा कर रहे हैंएमईएस। मस्तिष्क के नमूने नकारात्मक दबाव में बनाए रखा एक microcabinet में homogenized जमे हुए मस्तिष्क ब्लॉक और ऊतक सामग्री से विच्छेदित कर रहे हैं। डिस्पोजेबल गाउन दस्ताने, चेहरे मास्क, अधिक जूता संरक्षक और सुरक्षा चश्मे प्रक्रिया के दौरान पहने जाते हैं। मानव ऊतक अपशिष्ट सुरक्षित निपटान के लिए 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर autoclaving के बाद खारिज कर दिया है। तेजधार (छुरी ब्लेड) रोकथाम और सुरक्षित निपटान के लिए एक उपयुक्त तेजधार कंटेनर में निपटारा कर रहे हैं।

  1. (बेसल गैन्ग्लिया क्षेत्र से वजन में लगभग 0.5 ग्राम) जमे हुए मानव ऊतक का एक हिस्सा ले और तेजी से एक छोटा सा पेट्री डिश और एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर बर्फ पर छोटे टुकड़ों (लगभग 1 मिमी 2) में कीमा। प्रत्येक नमूने के लिए एक अलग पेट्री डिश और स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग करें। एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में कीमा बनाया हुआ ऊतक लीजिए और ट्यूब के लिए ठंडा 1XTBS बफर के 10 खंडों को जोड़ने।
  2. 10 सेकंड के लिए 20,000 rpm पर एक यांत्रिक homogenizer का उपयोग नमूने homogenize। 2 मिनट के लिए बर्फ पर शांत। इस कदम के तीन बार दोहराएँएस।
    नोट: homogenizing, जबकि नमूनों को गरम नहीं कर रहे हैं कि यह इसलिए किया जाता है।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1000 XG पर centrifugation द्वारा स्पष्ट करें। गैर homogenized सामग्री की गोली त्यागें।
  4. सतह पर तैरनेवाला (कच्चा homogenate) ले लो, (ट्यूब के आकार रोटर आकार पर निर्भर करता है) अपकेंद्रित्र ट्यूब polycarbonate और ध्यान से संतुलित करने के लिए जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 100,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
  5. इस टीबीएस में घुलनशील अंश है के रूप में सतह पर तैरनेवाला को बनाये रखें।
  6. धो 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 100,000 XG पर 1X टीबीएस बफर और सेंट्रीफ्यूज हर बार की पाँच खंडों में दो बार गोली। Supernatants त्यागें।
    1. आरटी पर 1X टीबीएस एसडीएस के लगभग 5 खंडों में 20 KHz पर 10 सेकंड के लिए गोली sonicating द्वारा अंतिम गोली Resuspend।
      नोट: एसडीएस युक्त बफर नमूने के अलावा एसडीएस वर्षा से बचने के लिए 10 डिग्री सेल्सियस पर लाया जाना चाहिए पहले।
    2. 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 100,000 XG पर ultracentrifuge।
  7. इस वें के रूप में सतह पर तैरनेवाला को बनाये रखेंई घुलनशील अंश एसडीएस।
    1. धो आरटी पर 1X टीबीएस एसडीएस बफर के दो बार में 5 संस्करणों गोली। अपकेंद्रित्र 25 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 100,000 XG पर हर बार।
    2. पूरा solubilization प्राप्त करने के लिए 10 सेकंड के लिए 20 किलोहर्ट्ज पर सेट एक sonicator का उपयोग 1X टीबीएस एसडीएस यूरिया बफर के 50 μl में अंतिम गोली solubilize; इस यूरिया घुलनशील अंश कहा जाता है।
  8. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक प्रोटीन परख किट का उपयोग कर कुल प्रोटीन सामग्री के लिए प्रत्येक अंश परख। प्रोटीन परख अभिकर्मकों के साथ अनुकूलता की अनुमति देने के लिए 1x टीबीएस बफर के साथ 1: टीबीएस एसडीएस यूरिया नमूने 1 पतला। -80 डिग्री सेल्सियस पर छोटे aliquots (20 μl) में रुक नमूने फ्रीज पिघलना चक्र को कम करने के लिए।
    नोट: नमूने के लिए 10% ग्लिसरॉल जोड़ना -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए सिफारिश की है।

नमूने और विश्लेषण परिणाम 3. immunoblotting

  1. 10-अच्छी तरह से 4-12% बीआईएस Tris polyacrylamide जेल पर टीबीएस, टीबीएस एसडीएस और टीबीएस एसडीएस यूरिया के अर्क से चलाने के लिए नमूनेमानक तकनीक का उपयोग बफर चलाने के रूप में MOPS साथ। देखें Gallagher और चक्रवर्ती (2008) एक विस्तृत पश्चिमी धब्बा प्रोटोकॉल के लिए 29।
  2. टीबीएस और एसडीएस और यूरिया भागों के लिए एक आणविक वजन मार्कर के साथ साथ प्रत्येक लेन पर लोड प्रत्येक नमूने से प्रोटीन की 10 ग्राम।
  3. 1 घंटे के लिए या लोडिंग बफर से नीले रंग की डाई जेल के नीचे तक पहुँच गया है, जब तक 200 वी पर जेल चला।
  4. Electrophoretically नायलॉन झिल्ली 28 पर जैल से प्रोटीन स्थानांतरण, 20% मेथनॉल युक्त स्थानांतरण बफर में पहले 100% मेथनॉल में और उसके बाद पूर्व गीला। प्रोटीन पक्ष और आणविक वजन आकार मार्कर के उन्मुखीकरण का निर्धारण करने के लिए धब्बा पर एक पहचान निशान प्रदान करें।
    1. गीले फिल्टर पेपर के साथ झिल्ली के साथ जेल सैंडविच। झिल्ली का सही स्थान जेल और एनोड के बीच झिल्ली के साथ महत्वपूर्ण है। 40 वी में 2 घंटे के लिए स्थानान्तरण प्रदर्शन
    2. 1X पीबीएस के बीच (1X पीबीएस-टी) बफर मेकअप: 200 मिलीलीटर में पीबीएस के 1 गोली भंगपानी 0.01 एम फॉस्फेट बफर, 0.0027 एम पोटेशियम क्लोराइड और 0.137 एम सोडियम क्लोराइड, पीएच 7.4 उपज के लिए।
    3. 70 rpm पर झटकों के साथ 30 मिनट के लिए 1X पीबीएस-टी में 5% BSA समाधान में झिल्ली ब्लॉक। यह झिल्ली को प्राथमिक एंटीबॉडी के बंधन गैर विशिष्ट रोकता है।
  5. (1X पीबीएस-टी के साथ washes की एक श्रृंखला के बाद (4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन) 750 कमजोर पड़ने: 1 पर; α-syn प्राथमिक एंटीबॉडी सिन-1 (माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी बी.डी. बायोसाइंसेज) के 6 मिलीलीटर के साथ प्रोटीन धब्बा जांच 3 एक्स 5 मिनट के लिए हर बार), 28।
  6. 1 पर माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित उचित एचआरपी साथ धब्बा सेते: 2,000 कमजोर पड़ने 30 मिनट के लिए। 1X पीबीएस-टी के साथ washes की एक श्रृंखला (3 एक्स 5 मिनट हर बार) निष्पादित करें।
    1. एक अंधेरे कमरे में 15 सेकंड के लिए बढ़ाया chemiluminescence समाधान में दाग को विसर्जित कर दिया। एक प्रकाश प्रूफ कैसेट में प्रोटीन पक्ष के साथ दाग के खिलाफ एक फिल्म चिपटना और जगह autoradiography फिल्मों के साथ कवर दाग उचित संकेतों (उचित आकार बैंड) पर कब्जा करने के लिए।
    2. एक स्वचालित डेवलपर में autoradiography फिल्मों का विकास करना।
      नोट: Blots भी एक स्वचालित डेवलपर मशीन उपलब्ध नहीं है, इस मामले में एक वाणिज्यिक स्रोत से डेवलपर और फिक्सर का उपयोग कर मैन्युअल विकसित किया जा सकता है।
  7. पश्चिमी धब्बा के 6 मिलीलीटर निरंतर α-syn एंटीबॉडी संकेत के दाग पट्टी करने के झटकों के साथ 10 मिनट के लिए बफर अलग करना साथ पश्चिमी धब्बा सेते हैं। 8,000 कमजोर पड़ने: 1 में बीटा actin प्राथमिक एंटीबॉडी (माउस मोनोक्लोनल) का उपयोग कर 3.6.2 के माध्यम से कदम 3.43 पालन करें।
  8. स्कैन और quantitation प्रयोजनों के लिए एनआईएच ImageJ (एक मुफ्त डाउनलोड सॉफ्टवेयर) का उपयोग कर एक झगड़ा छवि और उपाय घनत्व में अंतिम छवि परिवर्तित।
    नोट: सॉफ्टवेयर ब्याज के रिश्तेदार क्षेत्र (उचित आकार बैंड) के घनत्व के पढ़ने की अनुमति देता है और डेटा या तो पर मनमाना इकाइयों के रूप में या α-syn घनत्व / β-actin (एक घर कीपिंग जीन) के अनुपात के रूप में व्यक्त किया जा सकता एक हाउस कीपिंग जीन (यूरिया घुलनशील नमूने के मामले में) के रूप में मान्य नहीं है जब अपने आप ही।

Representative Results

टीबीएस, एसडीएस और चित्र 1 में दिखाया प्रोटोकॉल के बाद बेसल गैन्ग्लिया से निकाले यूरिया घुलनशील प्रोटीन जैल पर चलाने के लिए और α-syn सिन-1 माउस मोनोक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ immunoblotted थे। टीबीएस घुलनशील अंशों की जांच की पीडी और नियंत्रण मामलों में मोनोमेरिक α-syn (~ 14 केडीए प्रजाति) (2A चित्रा) की उपस्थिति का प्रदर्शन किया। एसडीएस घुलनशील अंशों भी कम जोखिम धब्बा (चित्रा -2) में दिखाया के रूप में अध्ययन मामले के सभी तीन उपप्रकार में प्रचुर मात्रा में मोनोमेरिक α-syn दिखाया। पीडी मामलों में भी oligomers (चित्रा -2) होने की संभावना है, जो उच्च जोखिम धब्बा पर देखा के रूप में उच्च आणविक भार (मेगावाट) α-syn प्रजातियों, पता चला है। पीडी मामलों से यूरिया घुलनशील अंशों α-syn मोनोमर्स, oligomers और मामलों पर नियंत्रण की तुलना में एकत्रित प्रजातियों का ऊंचा मात्रा में पता चला है। neocortical अज्ञातहेतुक पीडी मामलों aggreg की उच्च मात्रा का प्रदर्शन लिम्बिक मामलों अघुलनशील α-syn के मध्यवर्ती स्तर दिखा whilst के पैदा, प्रजातियों α-syn। दोनों अज्ञातहेतुक पीडी मामलों से एसडीएस और यूरिया अंशों चर 12 केडीए में छोटा α-syn उत्पादों के स्तर और 6 केडीए 20 वर्णित के रूप में प्रदर्शित करता है। इसके विपरीत, नियंत्रण मामलों किसी भी अघुलनशील या एकत्रित α-syn (चित्रा 2 ई) नहीं दिखा था। अर्द्ध मात्रात्मक घनत्व उपायों neocortical और लिम्बिक पीडी मामलों में एकत्रित α-syn की अघुलनशील प्रकृति (चित्रा 2 बी, 2 डी, 2 एफ) का प्रदर्शन α-syn immunohistochemistry का उपयोग categoriesd रूप पौंड भार की मात्रा को दर्शाते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. अघुलनशील α -syn निष्कर्षण प्रक्रिया के योजनाबद्ध आरेख।rget = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. पीडी से α -syn स्तरों के प्रतिनिधि immunoblots और मानव ऊतक नियंत्रित करते हैं। टीबीएस, एसडीएस और यूरिया घुलनशील अंशों बेसल ganglia (नियंत्रण) अज्ञातहेतुक पीडी मामलों की और neurologically सामान्य (पीडी मामलों में α-syn विकृति बंदरगाहों कि एक क्षेत्र) से दिमाग पश्चिमी immunoblot का उपयोग कर α-syn की उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया गया। प्रोटीन की 10 ग्राम प्रत्येक लेन पर लोड किया गया था। टीबीएस भिन्न (ए) में, मुख्य रूप से α-syn मोनोमर्स सभी मामलों में मौजूद हैं। एसडीएस भिन्न (ग) में, α-syn के कुछ oligomers मुख्य रूप से पीडी के ऊतकों में मोनोमर्स के साथ-साथ देखा जाता है। यूरिया भिन्न (सी), मोनोमर्स, oligomers और एकत्रित α-syn में अस्थायित्व पीडी मामलों reflectin में व्यक्त कर रहे हैंजी उनके संबंधित पौंड भार। neurologically सामान्य नियंत्रण के नमूने मोनोमेरिक α-syn की ही छोटी मात्रा की उपस्थिति दिखाने के लिए। उच्च पौंड भार के साथ कुछ मामलों में देखा जाता है α-syn के संभावित गिरावट उत्पादों कृपया ध्यान दें। ठोस तीर सिर α-syn की मोनोमेरिक प्रपत्र प्रतिनिधित्व करता है। * संभवतः पहले 20,26 के रूप में वर्णित α-syn की एक सी टर्मिनली छोटा रूप प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मामला लिंग मौत साल की आयु पोस्टमार्टम में देरी (घंटे) ऊतक के पीएच
Neocortical 1 एम 82 40 6.3
Neocortical 2 एफ 75 35.3 6.4
लिम्बिक 1 एम 81 28.5 6.2
लिम्बिक 2 एफ 79 36.5 6.2
नियंत्रण 1 एम 80 38 6.1
नियंत्रण 2 एफ 83 32.5 6.3

इस्तेमाल किया मामलों की तालिका 1. लिमिटेड जनसांख्यिकी

Discussion

यह लेख denaturing जेल चल रहा शर्तों का उपयोग रोगग्रस्त दिमाग से निकासी और मोनोमेरिक, oligomeric का अंतर है घुलनशीलता संपत्तियों की परीक्षा और एकत्रित α-syn के लिए एक जैव रासायनिक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है एकत्रित α-syn 17, 18, ​​20, 21 अपने मूल रूप में सामान्य रूप से घुलनशील है लेकिन रोग प्रगति के साथ या आनुवंशिक परिवर्तन के साथ amyloidogenic या बढ़ा एकत्रीकरण गुण हासिल है कि एक प्रोटीन। बहरहाल, कुछ समूहों (8% या 10% के बजाय 5%) 21,22, 30। एसडीएस α-syn की झिल्ली बाध्य रूपों में शामिल कर सकते हैं कि oligomers एक anionic डिटर्जेंट और solubilises है उनकी buffers में एसडीएस सांद्रता में मामूली बदलाव का इस्तेमाल किया है α-syn, यूरिया, जबकि एक chaotropic अभिकर्मक α-syn 20 की अघुलनशील एकत्रित और fibrillar या amyloidogenic रूपों denatures। इस संबंध में Paleologou एट अल 31 से एक व्यवस्थित अध्ययन स्थिरता की जांच कीα-syn oligomers और यूरिया की अलग सांद्रता के साथ तंतुओं के (6.5-8 मीटर) या एसडीएस (0.25-2%) और सूचना दी कि यूरिया की उच्च सांद्रता के साथ एसडीएस सांद्रता में स्थिर नहीं बल्कि oligomers। Α-syn oligomers और तंतुओं के लिए विशिष्ट उनकी फिला -1 एंटीबॉडी, गैर denaturing शर्तों के तहत 6.5 एम यूरिया सांद्रता में तंतुओं के उच्च सांद्रता का पता चला। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल बफर सांद्रता बारीकी Culvenor एट अल में वर्णित किया गया है दर्पण। (1999) 32।

अघुलनशील α-syn के जैव रासायनिक निकासी के लिए संरचनात्मक मस्तिष्क क्षेत्रों का चयन सावधानी से किया जाना चाहिए और इस रोग प्रगति 33,34 के आधार पर α-syn पौंड और एलएन लोड प्रतिबिंबित करना चाहिए। यहां इस्तेमाल मामलों McKeith के अनुसार पीडी प्रगति की देर और मध्यवर्ती चरणों को दर्शाती पीडी के neocortical और लिम्बिक उपप्रकार से बेसल गैन्ग्लिया के नमूने 34 ctriteria हैं। रानी स्क्वायर ब्रेन बैंक में, मस्तिष्क के एक आधा हैनियमित रूप से histochemical विश्लेषण के लिए formalin में तय की और दूसरे आधे ध्यान से विभिन्न संरचनात्मक क्षेत्रों में विच्छेदित है और फ्लैश जमे हुए हैं और जैव रासायनिक आगे और डीएनए / आरएनए विश्लेषण अध्ययन के लिए -80 ओ सी फ्रीजर में संग्रहीत। Neuropathologists से दिमाग और विच्छेदन की formalin निर्धारण के बाद, इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री संग्रहीत α-syn एंटीबॉडी और परिणामों का उपयोग किया जाता है। इसके अलावा एक नियमित प्रक्रिया के रूप में, मस्तिष्क के ऊतकों का पीएच मस्तिष्क के ऊतकों के अंतकाल राज्य के एक उपाय के रूप में आगमन पर मापा जाता है। यह जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए ऊतक संरक्षण की गुणवत्ता के लिए एक फर्म आधार बनाता है।

हमारे यहाँ डेटा अधिक एसडीएस नियंत्रण की तुलना में पीडी मामलों में घुलनशील α-syn मोनोमर देखते हैं कि पता चलता है; विशेष रूप से neocortical पीडी मामलों लिम्बिक पीडी किस्म की तुलना में अधिक है α-syn भार है। neocortical मामलों में इस तरह के ललाट और पार्श्विका भ्रष्टाचार के रूप में neocortical क्षेत्रों में पीडी α-syn विकृति का अधिक से अधिक प्रगति का प्रतिनिधित्व33,34 tices। लिम्बिक पीडी मामलों में इस तरह के प्रमस्तिष्कखंड, transentorhinal और सिंगुलेट क्षेत्रों के रूप में बेसल अग्रमस्तिष्क / लिम्बिक क्षेत्रों क्षेत्रों में उच्च पौंड स्कोर है। सार्थक डेटा और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, एक-एक पलटन से कम से कम 4 मामलों चलाना चाहिए। इसी तरह हम यहाँ प्रस्तुत धब्बा डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण करने का प्रयास नहीं किया है।

यह भी अलग अलग एंटीबॉडी विभिन्न रूपों / उच्च आदेश α-syn oligomers की संरचना को पहचान सकते हैं और प्रत्येक का अपना रिश्तेदार संवेदनशीलता और वरीयता हो सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। वे 4 अलग α-syn एंटीबॉडी (सिन-1, एस एस, Onco और LB509) α-syn oligomers / समुच्चय के लिए कम से कम अस्थिर परिणाम दे पता चलता है कि जहां यह टोंग एट अल। 29 के परिणामों से स्पष्ट है। इन α-syn एंटीबॉडी मिलान या तो एन टर्मिनल या सी में स्थित है, इस पर निर्भर बदलाव हो सकता है, हालांकि α-syn मोनोमर्स सभी 4 एंटीबॉडी द्वारा इसी तरह के विस्तार के लिए मान्यता प्राप्त किया गया29 -terminal। प्रजातियों 20,21 synuclein α-इसी तरह, phospho-अल्फा के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी synuclein अलग उच्च आणविक भार निर्धारित करते हैं। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में, अत्यधिक विशेषता एंटीबॉडी सिन-1 19-21 इस्तेमाल किया गया है।

हालांकि, यह कोशिकाओं में भी प्रोटीन की overexpression और पछाड़ना एंटीबॉडी preabsorption प्रयोगों के माध्यम से पश्चिमी blots पर किसी भी नई एंटीबॉडी मान्य और विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है।

यह α-syn और या अस्थिर tetrameric α-syn रूपों के छोटे टुकड़े को निर्धारित करने के शोधकर्ताओं द्वारा लागू किया गया है कि अन्य रूपों पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस tetramers 36 को स्थिर करने के लिए α-syn 35 या पार linkers के साथ नमूना homogenates के इलाज का छोटा रूपों बनाए रखने के लिए पीबीएस में 0.4% पीएफए ​​के साथ झिल्ली के हल्के-निर्धारण शामिल हो सकते हैं।

पोस्टमार्टम तिवारी का उपयोग कर प्रोटीन की सटीक जैव रासायनिक मूल्यांकनssue एंजाइमी प्रोटीन गिरावट और संशोधन के न्यूनतम आवश्यकता है। यह मामला साथियों के भीतर से मिलान नमूने कम से कम पोस्टमार्टम में देरी के साथ ऊतक का उपयोग करें और / या चयन करने के लिए इसलिए उचित है। Α-syn immunohistochemistry के लिए मानक एंटीबॉडी का उपयोग Immunohistochemistry अलगाव प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले किया जाना चाहिए। α-syn विकृति की हद तक अत्यधिक परिवर्तनशील है और चयनित क्षेत्रों के अनुसार भिन्न हो सकते हैं। यह हर रन के साथ इष्टतम उपज के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रचुर मात्रा में विकृति के साथ क्षेत्रों का चयन करने की सलाह दी जाती है। आवश्यक फॉस्फेट अवरोधकों प्रोटीज अवरोधकों की और यदि उपयोग सेल के दौरान होने वाली और 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को बनाए रखने इंट्रासेल्युलर प्रोटिएजों या फास्फेटेजों की रिहाई के बाद महत्वपूर्ण है अवांछित enzymatic गिरावट को रोकने के लिए।

यह प्रयोगों के बैच के भीतर नमूने के सभी इंट्रा-उपयोगकर्ता विविधताओं से बचने के लिए समान रूप से और लगातार नियंत्रित किया जाता है कि महत्वपूर्ण है; कई freइस संभावित ऐसे फास्फोरिलीकरण के रूप में बाद translational संशोधनों को वापस लेना हो सकता है के रूप में EZE पिघलना चक्र से बचा जाना चाहिए। नमूनों की एक बड़ी संख्या का परीक्षण immunoblots से डेटा जैल पर अन्य सभी के नमूने, और कहा कि नमूने के लिए संदर्भित सभी डेटा के समानांतर में चलाने चाहिए जो एक नमूना है, के लिए सामान्यीकृत होना चाहिए कि जब एक महत्वपूर्ण बिंदु को ध्यान में रखना। यह कई दाग के बीच immunoblot डेटा को सामान्य बनाने को सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है। यह हमारे हाल के एक अध्ययन में 22 में अपनाया विधि है।

यह कम पृष्ठभूमि ईसीएल रखने के लिए, दाग पश्चिमी धब्बा प्रोटोकॉल के दौरान किसी भी समय पर बाहर सुखाने के लिए अनुमति नहीं दी जानी चाहिए कि ध्यान दिया जाना चाहिए। इस ईसीएल संकेत के संतृप्ति को बढ़ावा मिलेगा और गलत quantitation के लिए नेतृत्व करेंगे के रूप में इसके अलावा, autoradiography फिल्मों पर बहुत लंबे निवेश (> 10 मिनट) से बचा जाना चाहिए।

यह ऊपर प्रोटोकॉल आम प्रयोगशाला अभिकर्मकों और में उपयोग कर एक अपेक्षाकृत सरल तकनीक हैstruments और पीडी अनुसंधान में α-syn प्रोटीन के pathophysiology की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है। यह पद्धति केवल α-syn ट्रांसजेनिक जानवरों में α-syn जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए उचित संशोधनों के साथ भी है लेकिन इस तरह के विज्ञापन, एमएसए, DLB, HD और frontotemporaldementias के रूप में एकत्रित प्रोटीन की असामान्य जमा की विशेषता अन्य neurodegenerative रोगों के लिए बढ़ाया जा सकता है। हालांकि यहां वर्णित पश्चिमी धब्बा डेटा भी α-syn 31 के विशिष्ट रूपों के लिए एंटीबॉडी का उपयोग एंजाइम से जुड़ी immunosorbent assays का उपयोग मान्य किया जा सकता है।

Disclosures

लेखक का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris-HCL Sigma T5912
sodium chloride VWR 27800.291
SDS Fluka 71727
Urea Sigma U5378
Protease inhibitor tablets  Roche 04 693 116001
Phosphatase inhibitor tablets  Roche  04 906 837001
Phosphate buffered saline tablets  Sigma  P4417
Tween-20  Sigma P9416
NuPAGE MOPS SDS running buffer Invitrogen NP0001
NuPAGE transfer buffer Invitrogen NP0006-1
Hybond-P membrane  GE Healthcare RPN303F
Whatman 3MM filter paper Sigma WHA30306185
Bis-tris gels 4-12%  Invitrogen  NP0322BOX
Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate Pierce 34080
Bio-RAD DC protein assay kit  Bio-Rad 500-0112
Thickwall Beckman Polycarbonate tubes Beckman 355630
Western blot stripping buffer Thermo scientific 46430
Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal) BD Biosciences 610786
beta-actin primary antibody (mouse monoclonal  Sigma A5441
HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody Santa Cruz sc-2031
Bovine serum albumin Sigma A7030
Instrument Company Rotor/ model no 
Benchtop Ultracentrifuge Optima Max Beckman MLA-80
Sonicator Heat Systems XL20-20
Homogeniser Jenke and Kunkel TP18/10

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 107 अल्फा-synuclein एकत्रीकरण अघुलनशील अल्फा synuclein Lewy शरीर पोस्टमार्टम मस्तिष्क ultracentrifugation पार्किंसंस रोग immunoblotting।
Parkinsonian दिमाग से घुलनशील और अघुलनशील अल्फा-synuclein की अनुक्रमिक निष्कर्षण
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Bandopadhyay, R. Sequential… More

Bandopadhyay, R. Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains. J. Vis. Exp. (107), e53415, doi:10.3791/53415 (2016).

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