Abstract
Alfa-synuklein (α-syn) proteinet är rikligt uttrycks främst inom neuroner, och förekommer i ett antal olika former - monomerer, tetramerer, oligomerer och fibriller. Under sjukdom, undergår α-syn konformationsförändringar för att bilda oligomerer och högmolekylära aggregat som tenderar att göra proteinet mer olösliga. Onormalt aggregerade α-syn är en neuropatologiska inslag av Parkinsons sjukdom (PD), Lewykroppsdemens (DLB) och multipel systematrofi (MSA). Biokemisk karakterisering och analys av olösliga a-syn med hjälp av buffertar med ökande tvättmedel styrka och höghastighetsultracentrifugering ger ett kraftfullt verktyg för att bestämma utvecklingen av α-syn patologi i samband med sjukdomsprogression. Detta protokoll beskriver isolering av allt olösligt / aggregerad α-syn från obduktion mänsklig hjärnvävnad. Denna metod kan anpassas med ändringar av studier av normal och onormal α-syn biologi i transgena djurmodeller hyser olika a-syn mutationer liksom i andra neurodegenerativa sjukdomar som presenterar avvikande fibrillära fyndigheter av proteiner som rör deras respektive sjukdomar.
Introduction
En av de viktigaste patologiska drag gemensamma bland flera neurodegenerativa sjukdomar är bildandet av abnorma proteinaggregat som uppträder i ett protein / sjukdom specifikt sätt ett. Sålunda finns de karakteristiska extraneuronal amyloidbeta plaketter och aggregerade hyperfosforylerat Tau-insättningar inom neuroner vid Alzheimers sjukdom (AD); de aggregerade a-syn insättningar i Lewy Bodies (LBS), som är intraneuronala inneslutningar, och även inom dystrofiska neuronala processer som kallas Lewy neurites (LNS) i PD, PD demens och Lewykroppsdemens (DLBs) 2-4. Onormala a-syn inlåning ska också ses i hallmark lesioner av gliaceller cytoplasmiska inneslutningar i MSA 5. I Huntingtons sjukdom, finns det karaktäristiska Poly-Q inlåning och onormal Tar DNA-bindande protein-43 och smält i sarkom proteiner (FUS) deponeras i frontotemporal demens. Viktigt för PD har α-syn genmutationer befunnits cause autosomalt dominant PD 11/06. Dessutom, α-syn genen tredubbling 12 och dubbelarbete 13 orsakar också familjär PD därmed länka ökad α-syn uttryck åt pathomechanisms av PD. Noterbart är både sporadiska och familjära PD fall hyser onormala fyndigheter av α-syn patologi 14. Nuvarande tillgängliga behandlingar för PS är endast palliativ och har ingen effekt på att stoppa eller fördröja den obevekliga sjukdomsförloppet.
α-syn är rikligt uttryckt i den mänskliga hjärnan och utgör cirka 1% av den totala hjärnproteinet. Det finns mer specifikt inom nervceller, men kan förekomma även i mindre mängder inom gliaceller. En omtvistad punkt är den naturliga strukturen av α-syn som kan existera som en slumpmässig monomer 15 eller som en vikt tetramer 16. Under sjukdom, ändrar α-syn dess konformation som gör det möjligt att få felvikt och denna process tros vara orsaken till sjukdomen pathogeNesis. Trots flera år av undersökningar av patofysiologiska aspekter av α-syn och sjukdom, har de exakta orsakerna till sjukdomsmekanismer förblivit elusive 14.
Studier som använder obduktion analys av Parkinson hjärnor har hittills gett viktiga ledtrådar om normal och onormal biologi α-syn både i sporadisk PD och även PD samband med mutationer i genen LRRK2 17-22. Här har en biokemisk extraktion protokoll (se schema presenteras i figur 1) för alltmer olösliga a-syn-insättningar från humant obduktion PD hjärnvävnad som hyser α-syn aggregat i varierande grad beskrivits. Denna teknik kan även anpassas med modifieringar i buffertkompositioner att studera aggregerade proteiner från andra neurodegenerativa sjukdomar 23,24 och även från transgent djur hjärnvävnad 25-27. Det viktigaste skälet för anpassningar är skillnaderna i solubihet och de totala mängderna av de respektive proteinerna varav somliga har huvudsakligen kärnkraft och kan behöva hög saltbuffertar för optimal extraktion som visas för FUS 28.
Protocol
Obduktion hjärnvävnad skänktes till Drottningtorget Hjärnbanken för neurologiska sjukdomar, University College London, Institute of Neurology använder etiskt godkända protokoll och lagras för forskning inom ramen för en licens utfärdad av det mänskliga vävnaden myndigheten (HTA) Storbritannien (nr. 12198). Se lista över de fall som används för detta protokoll (tabell 1).
1. Framställning av buffertar
- Bered 1x TBS (Tris-buffrad saltlösning) buffert:
- Förbered 10X TBS som stamlösning med 500 mM Tris-HCl pH 7,4 och 1500 mM NaCl.
- Väg upp 60,5 g Tris-Cl pH 7,6 och 87,6 g NaCl i 800 ml vatten med hög renhet. Justera pH med 1 M HCI och göra det slutliga aktie volymen till 1 L.
- Framställning av den slutliga koncentrationen av 1X TBS genom utspädning av lager 10 gånger i destillerat vatten.
- Lägg proteashämmare (PI), (1 tablett per 50 ml buffert) och Phos-stop tabletter fosfatasinhibitor (1 tablett per 10 ml buffert) ochupphäva effekterna av icke-specifika enzymatiska åtgärder proteaser och fosfataser.
Obs: Här har vi använt enzyminhibitorn tabletter från Roche men lika andra kommersiellt tillgängliga hämmare kan användas i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Förbered 10X TBS som stamlösning med 500 mM Tris-HCl pH 7,4 och 1500 mM NaCl.
- Förbered TBS-SDS-buffert genom att tillsätta 5% vikt / volym Natriumdodecylsulfat (SDS) till 1X TBS (pH 7,4) buffert. Värm lösningen till 60 ° C under konstant omröring med användning av en magnetisk omrörare för att solubilisera SDS.
- Förbered TBS-SDS-urea-buffert genom tillsättning av urea till en slutlig koncentration av 8 M vikt / volym till 1X TBS-SDS-buffert (pH 7,4). Värm lösningen till 60 ° C under konstant omröring på en magnetomrörare för att upplösa urea.
2. Prov Homogenisering och differentierad Ultracentrifugering
Obs: Följande del av arbetet innebär hantering av mänskliga hjärnvävnad enligt reglerna i HTA Storbritannien. Lokala standardrutiner följs alls times. Hjärnprover dissekeras från frusna hjärnblock och vävnadsmaterial homogeniserades i en microcabinet hölls vid negativt tryck. Engångs klänningar handskar, ansiktsmasker, över sko beskyddare och skyddsglasögon bärs under hela förfarandet. Humant vävnadsavfall kastas efter autoklavering vid 121 ° C under 20 min för säkert bortskaffande. Sharps (skalpellblad) är anordnade i en lämplig avfallsbehållare för inneslutning och säkert omhändertagande.
- Ta en bit av frusen mänsklig vävnad (ca 0,5 g i vikt från de basala ganglierna region) och snabbt finhacka i små fragment (cirka 1 mm 2) på is med en liten petriskål och en steril skalpell blad. Använd en separat Petri-skål och skalpellblad för varje prov. Samla det malda vävnaden i ett 15 ml rör och tillsätt 10 volymer iskall 1XTBS buffert till röret.
- Homogenisera proverna med användning av en mekanisk homogenisator vid 20.000 varv per minut under 10 sek. Kyl på is under 2 minuter. Upprepa detta steg tre gångers.
Obs: Detta görs så att proverna inte värms upp under homogenisering. - Klargöra genom centrifugering vid 1000 xg under 5 min vid 4 ° C. Kassera pellet av icke-homogeniserade materialet.
- Ta supernatanten (råhomogenat), lägg till polykarbonat centrifugrör (storlek röret beror på rotorstorlek) och balansera försiktigt. Centrifugera vid 100 tusen xg under 1 h vid 4 ° C.
- Behåll supernatanten eftersom detta är TBS-lösliga fraktionen.
- Tvätta pelleten två gånger i fem volymer 1X TBS-buffert och centrifugera varje gång vid 100 tusen xg under 15 min vid 4 ° C. Kasta supernatanterna.
- Resuspendera slutliga pelleten genom ultraljudsbehandling pelleten i 10 sekunder vid 20 kHz på cirka 5 volymer 1X TBS-SDS vid RT.
Obs! Innan tillsättning av SDS innehåller buffertprover ska tas vid 10 ° C för att undvika SDS utfällning. - Ultracentrifug vid 100 tusen xg under 30 minuter vid 25 ° C.
- Resuspendera slutliga pelleten genom ultraljudsbehandling pelleten i 10 sekunder vid 20 kHz på cirka 5 volymer 1X TBS-SDS vid RT.
- Behåll supernatanten eftersom detta är the SDS lösliga fraktionen.
- Tvätta pelleten två gånger i 5 volymer 1X TBS-SDS-buffert vid RT. Centrifugera varje gång vid 100 tusen xg under 15 minuter vid 25 ° C.
- Solubilisera den slutliga pelleten i 50 fil 1X TBS-SDS-urea-buffert med användning av en sonikator inställd på 20 kHz för 10 sek för att uppnå fullständig solubilisering; detta benämns urealösliga fraktionen.
- Analysera varje fraktion för totalt proteininnehåll med hjälp av en kommersiell proteinanalys kit enligt tillverkarens protokoll. Späd TBS-SDS-urea prover 1: 1 med 1X TBS buffert för att möjliggöra kompatibilitet med proteinanalysreagens. Freeze prover i små alikvoter (20 | j, l) vid -80 ° C för att reducera frysnings-upptiningscykler.
Obs: Lägga 10% glycerol till proverna rekommenderas för långtidslagring vid -80 ° C.
3. Immunoblotting av prover och analysera resultat
- Kör prover från TBS, TBS-SDS och TBS-SDS-Urea extrakt på 10 brunnar 4-12% Bis-Tris polyakrylamidgelmed MOPS som rinnande buffert användning av standardtekniker. Se Gallagher och Chakravarti (2008) 29 för en detaljerad western blot-protokollet.
- Belastning 10 pg protein från varje prov på varje bana tillsammans med en molekylviktsmarkör för TBS och SDS och urea fraktioner.
- Kör gelén vid 200 V under 1 h eller tills den blå färgen från laddningsbuffert har nått botten av gelén.
- Överför proteiner från geler elektroforetiskt på nylonmembran 28, förfuktat först i 100% metanol och därefter in i överföringsbuffert innehållande 20% metanol. Tillhandahålla ett identifieringsmärke på blot för att bestämma proteinsidan och orienteringen av de molekylviktsstorleksmarkörer.
- Smörgås gelén med membranet tillsammans med vått filterpapper. Korrekt placering av membran är avgörande med membranet mellan gelén och anoden. Utför överföringen under 2 timmar vid 40 V.
- Späd 1X PBS-Tween (1X PBS-T) buffert: Lös en tablett av PBS i 200 mlvatten för att ge 0,01 M fosfatbuffert, 0,0027 M kaliumklorid och 0,137 M natriumklorid, pH 7,4.
- Blockera membranet i 5% BSA-lösning i 1 x PBS-T under 30 min med skakning vid 70 varv per minut. Detta förhindrar icke-specifik bindning av primär antikropp till membranet.
- Sondera protein blöt med 6 ml α-syn-primär antikropp Syn-1 (BD Biosciences, mus monoklonal antikropp) på ett: 750 utspädning (O / N vid 4 ° C), följt av en serie av tvättningar med 1 x PBS-T ( 3 x 5 minuter varje gång) 28.
- Inkubera blotten med det lämpliga HRP-konjugerad sekundär antikropp vid en: 2000 spädning under 30 minuter. Utför en serie tvättar (3 x 5 min varje gång) med 1X PBS-T.
- Doppa blottar i förstärkt kemiluminescens lösning under 15 sekunder i ett mörkt rum. Täck blottar med en plastfolie och placera autoradiografi filmer mot blot med proteinsidan uppåt i en ljustät kassett för att fånga lämpliga signaler (lämplig storlek band).
- Utveckla autoradiografi filmer i en automatiserad utvecklare.
Obs: Blots kan också utvecklas manuellt med utvecklare och fixare från en kommersiell källa vid en automatiserad utvecklare maskin är inte tillgänglig.
- Inkubera western blöt med 6 ml western blöt strippbuffert under 10 min med konstant skakning för att skala av blöt av α-syn-antikropp signalen. Följ stegen 3.43 fram till 3.6.2 med användning av beta-aktin primär antikropp (mus monoklonal) på 1: 8000 utspädning.
- Skanna och konvertera den slutliga bilden i en TIFF-bild och mäta densiteter som använder NIH ImageJ för kvantifiering ändamål (en gratis nedladdningsbar programvara).
Obs: Programvaran tillåter läsning av densiteter av relativa arean av intresse (de lämpliga storleksbanden) och data kan uttryckas antingen som ett förhållande av α-syn densitet / β-aktin (ett hus bevarande gen) som godtyckliga enheter eller på egen hand när en kammaren hålla gen är inte giltig (såsom i fallet med urealösliga prover).
Representative Results
TBS, SDS och urea lösliga proteiner extraherade från basala ganglierna efter protokollet som visas i fig 1 kördes på geler och immun med Syn-en musmonoklonal α-syn-primär antikropp. TBS lösliga fraktioner visade närvaron av mono α-syn (~ 14 kDa species) i PD och kontroll granskade fallen (Figur 2A). SDS lösliga fraktioner visade också rikligt mono α-syn i alla tre undertyper av fall studeras som visas i den låga exponerings blot (Figur 2C). PD fall visade också högre molekylvikt (MW) a-syn arter som kan ses på den höga exponerings blot, som sannolikt kommer att vara oligomerer (figur 2C). Urea lösliga fraktioner från PD fall visade förhöjda mängder av a-syn monomerer, oligomerer och aggregerade arter jämfört med kontroll fall. De hjärnbarkens idiopatisk PD fall visar större mängder aggreg ated α-syn arter, medan de limbiska fall visar mellanliggande nivåer av olösligt α-syn. Både SDS och urea fraktioner från idiopatisk PD fall visar varierande nivåer av stympade a-syn produkter på 12 kDa och 6 kDa såsom beskrivits 20. Däremot hade kontroll fall inte någon olöslig eller aggregerad α-syn (Figur 2E). Semi-kvantitativa åtgärder densitet speglar mängden LB belastning som categoriesd använder α-syn immunohistokemi visar den olösliga karaktär aggregerad α-syn (Figur 2B, 2D, 2F) i hjärnbarkens och limbiska PD fall.
Figur 1. Skiss av olöslig α -syn extraktionsmetod.rget = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa immunoblots av a -syn nivåer från PD och styra mänsklig vävnad. TBS, SDS och urea lösliga fraktioner från basala ganglierna (en region som hyser α-syn patologi i PD fall) av idiopatisk PD fall och neurologiskt normala (kontroll) hjärnor analyserades med avseende på närvaron av α-syn med hjälp av Western immunoblotting. 10 | j, g av protein laddades på varje bana. I TBS fraktionerna (A), huvudsakligen α-syn monomerer är närvarande i samtliga fall. Vid SDS-fraktioner (C), är vissa oligomerer av α-syn ses längs med monomerer huvudsakligen i PD-vävnad. I urea fraktioner (C), monomerer, oligomerer och aggregerad α-syn är variabelt uttrycks i PD fall reflekting respektive LB belastning. De neurologiskt normala kontrollprover visar förekomsten av endast små mängder av mono α-syn. Observera möjliga nedbrytningsprodukter av α-syn ses i vissa av fallen med hög LB belastning. Den fasta pilhuvud representerar den monomera formen av α-syn. Den * eventuellt representerar en C-terminalt stympad form av α-syn som tidigare beskrivits 20,26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Fall | Sex | livslängd år | obduktion fördröjning (timmar) | pH hos vävnad |
| Hjärnbarkens 1 | M | 82 | 40 | 6,3 |
| Hjärnbarkens 2 | F | 75 | 35,3 | 6,4 |
| Limbiska 1 | M | 81 | 28,5 | 6,2 |
| Limbiska 2 | F | 79 | 36,5 | 6,2 |
| Kontroll 1 | M | 80 | 38 | 6,1 |
| Kontroll 2 | F | 83 | 32,5 | 6,3 |
Tabell 1. Begränsade demografi av fallen används
Discussion
Den här artikeln beskriver en biokemisk protokoll för utvinning och undersökning av egenskaper differential löslighetsegenskaper monomera, oligomera och aggregeras α-syn från sjuka hjärnor med hjälp av denaturerings gel driftsförhållanden. Detta är en väl etablerad teknik för att studera aggregerade α-syn 17, 18, 20, 21 ett protein som normalt är lösligt i dess naturliga form, men få amyloidogeniska eller ökad aggregering fastigheter med sjukdomsprogression eller med genetiska mutationer. Icke desto mindre har vissa grupper användes små variationer i SDS-koncentrationer i sina buffertar (8% eller 10% i stället för 5%) 21,22, 30. SDS är en anjonisk detergent och solubiliserar α-syn oligomerer som kan inkludera membranbundna former av α-syn, medan urea, denaturerar ett kaotropiskt reagens de olösliga aggregerade och fibrillära eller amyloidogena former av α-syn 20. I detta avseende en systematisk studie av Paleologou et al 31 undersökte stabilitetenav a-syn oligomerer och fibriller med varierande koncentrationer av urea (6,5-8 M) eller SDS (0,25-2%) och rapporterade att oligomerer stabila i SDS-koncentrationer, men inte med höga koncentrationer av urea. Deras FILA-1-antikropp, specifik för a-syn oligomerer och fibriller upptäcks högre koncentrationer av fibriller vid 6,5 M ureakoncentrationer under icke-denaturerande betingelser. De buffertkoncentrationer som används i detta protokoll avspeglar nära vad som har beskrivits i Culvenor et al., (1999) 32.
De anatomiska delar av hjärnan för biokemisk utvinning av olöslig α-syn bör väljas med omsorg och detta bör återspegla α-syn LB och LN belastning beroende på sjukdomsförloppet 33,34. De fall som används här är basala ganglierna prover från hjärnbarkens och limbiska subtyper av PD återspeglar sent och mellanstadier PD progression enligt McKeith ctriteria 34. På Queen Square Brain Bank, är ena halvan av hjärnanrutinmässigt fixerades i formalin för histokemisk analys och den andra halvan är noggrant dissekeras in i olika anatomiska regioner och frystes och förvarades vid -80 ° C frysar för ytterligare biokemiska och DNA-studier / RNA-analys. Efter formalin fixering av hjärnan och dissektion av neuropathologists är immunohistokemi utförs med hjälp av α-syn antikropp och resultat arkiveras. Också som en rutinprocedur, är pH-värdet i hjärnvävnad mättes vid ankomst som ett mått på agonal tillståndet i hjärnvävnad. Detta utgör en stabil grund för kvaliteten på vävnads bevarande för biokemisk analys.
Våra data här visar att det finns fler SDS lösliga α-syn monomer i PD fall jämfört med kontroller; särskilt hjärnbarkens PD fall har högre α-syn belastning jämfört med det limbiska PD sorten. De hjärnbarkens fall representerar större progression av PD α-syn patologi i hjärnbarkens regioner som cor de främre och övreTices 33,34. De limbiska PD fall har högre LB poäng i den basala framhjärnan / limbiska regioner områden som amygdala, transentorhinal och cingulum regionerna. För meningsfull information och statistisk analys, måste man köra minst 4 fall från varje årskull. Likaså vi inte har försökt statistisk analys av data blot presenteras här.
Det skall också noteras att olika antikroppar kan känna igen olika blanketter / sammansättningen av högre ordning a-syn oligomerer och var och en kan ha sin egen relativa känsligheten och preferens. Detta framgår av resultaten av Tong et al. 29, där de visar att 4 olika a-syn antikroppar (Syn-1, SS, Onco och LB509) ger utbytbara resultat åtminstone för a-syn oligomerer / aggregat. De α-syn monomerer erkändes på liknande grad av alla 4-antikroppar även om dessa kan ha variationer beroende på om α-syn antikroppsepitop är belägen antingen i den N-terminala eller Cterminal 29. Likaså specifika antikroppar för fosfo-alfa synuklein bestämma distinkt hög molekylvikt α-synuklein arter 20,21. I det protokoll som beskrivs här, har i hög grad kännetecknas antikropp Syn-1 använts 19-21.
Emellertid är det viktigt att överväga validera alla nya antikroppen på western blöts genom antikropps förabsorption experiment och även överuttryck och knockdown av proteinet i cellerna.
Det är viktigt att överväga andra variationer som har tillämpats av forskare för att bestämma mindre fragment av a-syn och eller instabila tetra a-syn former. Detta skulle kunna omfatta mild fixering av membran med 0,4% PFA i PBS för att behålla stympade former av α-syn 35 eller behandling av provhomogenat med tvärbindare för att stabilisera tetramers 36.
Exakt biokemisk utvärdering av proteiner med användning av post mortem tissue kräver minimering av enzymatisk proteinnedbrytning och modifiering. Det är därför lämpligt att använda vävnad med de kortaste obduktions förseningar och / eller välj matchade prover inom fall årskullar. Immunohistokemi med användning av standard antikroppar för α-syn immunohistokemi bör utföras före start av isolering protokollet. Omfattningen av α-syn-patologi är mycket varierande och kan variera beroende på regioner valda. Det är lämpligt att välja regioner med riklig patologi som en positiv kontroll för optimalt utbyte med varje körning. Användningen av proteasinhibitorer och om nödvändigt fosfatasinhibitorer att förhindra oönskad enzymatisk nedbrytning efter frisättning av intracellulära proteaser eller fosfataser förekommer under cell-lys och upprätthållande av proverna vid 4 ° C är avgörande.
Det är viktigt att alla prover inom partiet experiment hanteras jämnt och konsekvent för att undvika inom användar variationer; multipel freeze-upptiningscykler bör undvikas eftersom detta potentiellt kan dra tillbaka posttranslationella modifieringar såsom fosforylering. En kritisk punkt att tänka på när man undersöker ett stort antal prover är att data från immunoblottar bör normaliseras till ett prov, som skall löpa parallellt med alla andra prover på geler och all data refererade till det provet. Detta görs för att säkerställa normalisering av immunoblot data mellan flera blöts. Detta är den metod som i vår senaste undersökning 22.
Det bör noteras att för att hålla bakgrunden ECL låg, blottarna bör inte tillåtas att torka ut när som helst under Western blot-protokollet. Dessutom bör mycket långa exponeringstider (> 10 min) på autoradiografi filmer undvikas eftersom detta kommer att leda till mättnad av ECL signal och kommer att leda till felaktiga kvantifiering.
Denna ovanstående protokoll är en relativt enkel teknik som använder vanliga laboratoriereagens och iinstrument och kan vara ett värdefullt verktyg för att undersöka patofysiologi α-syn protein i PD forskning. Denna metod kan inte bara utökas med lämpliga ändringar i studiet av α-syn biologi a-syn transgena djur, men även andra neurodegenerativa sjukdomar som presenterar abnorma avlagringar av aggregerade proteiner såsom AD, MSA, DLB, HD och frontotemporaldementias. Men västra blot uppgifter som beskrivs här kan också valideras med hjälp av enzymkopplade immunosorbentanalyser användning av antikroppar för specifika former av α-syn 31.
Disclosures
Författaren har inget att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-HCL | Sigma | T5912 | |
| sodium chloride | VWR | 27800.291 | |
| SDS | Fluka | 71727 | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 04 693 116001 | |
| Phosphatase inhibitor tablets | Roche | 04 906 837001 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma | P4417 | |
| Tween-20 | Sigma | P9416 | |
| NuPAGE MOPS SDS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| NuPAGE transfer buffer | Invitrogen | NP0006-1 | |
| Hybond-P membrane | GE Healthcare | RPN303F | |
| Whatman 3MM filter paper | Sigma | WHA30306185 | |
| Bis-tris gels 4-12% | Invitrogen | NP0322BOX | |
| Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| Bio-RAD DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | |
| Thickwall Beckman Polycarbonate tubes | Beckman | 355630 | |
| Western blot stripping buffer | Thermo scientific | 46430 | |
| Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 610786 | |
| beta-actin primary antibody (mouse monoclonal | Sigma | A5441 | |
| HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody | Santa Cruz | sc-2031 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Instrument | Company | Rotor/ model no | |
| Benchtop Ultracentrifuge Optima Max | Beckman | MLA-80 | |
| Sonicator | Heat Systems | XL20-20 | |
| Homogeniser | Jenke and Kunkel | TP18/10 |
References
- Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative disease a decade od discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10, 1055-1063 (2004).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. A-synuclein in Lewy bodies. Nature. 388, 839-840 (1997).
- Spillantini, M. G., Crowther, R. A., Jakes, R., Hasegawa, M., Goedert, M. Alpha-synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. Proc Natl Acad Sci. 95, 6469-6473 (1998).
- Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. Am J Pathol. 152, 879-884 (1998).
- Ahmed, Z., et al. The neuropathology, pathophysiology and genetics of multiple system atrophy. Neuroptahol Appl Neurobiol. 38 (1), 4-24 (2012).
- Ploymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science. 276, 2045-2047 (1997).
- Kruger, R., et al. Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease. Nat Genet. 18, 106-108 (1998).
- Zarranz, J. J., et al. The new mutation, E46K, of alpha-synuclein causes Parkinson and Lewy Body dementia. Ann. Neurol. 55, 164-173 (2004).
- Proukakis, C., et al. A novel alpha-synuclein missense mutation in Parkinson disease. Neurology. 80 (11), 1062-1064 (2013).
- Kiely, A., et al. Synucleinopathy associated with G51D SNCA mutation: a link between Parkinson's disease and Multiple System atrophy? Acta Neuropathol. 125 (5), 753-769 (2013).
- Lesage, S., et al. G51D alpha-synuclein mutation causes a novel Parkinson-pyramidal syndrome. Ann Neurol. 73 (4), 459-471 (2013).
- Singleton, A. B., et al. Alpha-synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science. 302, 841 (2003).
- Chartier-Harlin, M. C., et al. Alpha-synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease. Lancet. 364, 1167-1169 (2004).
- Cookson, M. R., Hardy, J., Lewis, P. A. Genetic neuropathology of PD. Int J Clin Exp Pathol. 1 (3), 217-231 (2008).
- Fauvet, B., et al. α-synuclein in central nervous system and from erythrocytes, mammalian cells, and. Escherichia coli exists predominantly as disordered monomer. J Biol Chem. 287, 15345-15364 (2012).
- Bartels, T., et al. α-synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477, 107-110 (2011).
- Campbell, B. C., et al. Accumulation of insoluble alpha-synuclein in dementia with Lewy bodies. Neurobiol of Dis. 7 (3), 192-200 (2000).
- Campbell, B. C., et al. The solubility of alpha-synuclein in multiple system atrophy differs from that of dementia with Lewy bodies and Parkinson's disease. J Neurochem. 76, 87-96 (2001).
- Miller, D. W., et al. Alpha-synuclein in blood and brain from familial Parkinson's disease with SNCA locus triplication. Neurology. 62, 1835-1838 (2004).
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
- Zhou, J., et al. Changes in the solubility and phosphorylation of alpha-synuclein over the course of Parkinson's disease. Acta Neuropathol. 121, 695-704 (2013).
- Mamais, A., et al. Divergent solubility and aggregation properties in G2019S LRRK2 Parkinson's disease brains with Lewy Body pathology compared to idiopathic cases. Neurobiol of Dis. 58, 183-190 (2013).
- Lashley, T., et al. A comparative clinical, pathological, biochemical and genetic study of fused in sarcoma proteinopathies. Brain. 134 (pt9), 2548-2564 (2011).
- Brelstaff, J., et al. Transportin-1: a marker of FTLD-FUS. Acta Neuropathol. 122 (5), 591-600 (2011).
- Kahle, P. J., et al. Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes. EMBO reports. 3 (6), 583-588 (2002).
- Nuber, S., et al. A progressive dopaminergic phenotype associated with neurotoxic conversion of α-synuclein in BAC-transgenic rats. Brain. 136, 412-432 (2013).
- Tofaris, G. K., et al. Pathological changes in dopaminergic nerve cells odf the substantia nigra and olfactory bulb in mice transgenic for truncated human a-synuclein (1-120): implications for Lewy Body disorders. J Neurosci. 26 (15), 3942-3950 (2006).
- Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
- Gallagher, S., Chakravarti, D. Immunoblot analysis . J Vis. Exp. (16), e759 (2008).
- Tong, J., et al. Brain alpha-synuclein accumulation in multiple system atrophy, Parkinson's disease and progressive supranuclear palsy: a comparative investigation. Brain. 133, 172-188 (2010).
- Paleologou, K. E., et al. Detection of elevated levels of soluble α-synuclein oligomers in post-mortem brain extracts from patients with dementia with Lewy bodies. Brain. 132, 1093-1101 (2009).
- Culvenor, J. G., et al. Non-Aβ component of Alzheimer s disease Amyloid (NAC) revisited. American Journal of Pathology. 155 (4), 1173-1181 (1999).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 24, 197-211 (2003).
- McKeith, I. G., et al. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB consortium. Neurology. 65, 1863-1872 (2005).
- Lee, B. R., Kamitani, T. Improved immunodetection of endogenous α-synuclein. PLoS ONE. 6, e23939 (2011).
- Newman, A. J., et al. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous α-synuclein. PLoS ONE. 8 (11), e81314 (2013).
