Abstract
Alpha-synuclein (α-syn) proteinet er rikelig uttrykt hovedsakelig innenfor neuroner, og finnes i en rekke forskjellige former - monomerer, tetramerer og oligomerer fibriller. I løpet av sykdommen, gjennomgår α-syn konformasjonsendringer å danne oligomerer og høymolekylære aggregater som har en tendens til å gjøre proteinet uløselig mer. Unormalt aggregert α-syn er en nevropatologiske trekk ved Parkinsons sykdom (PD), demens med Lewy-legemer (DLB) og multippel system atrofi (MSA). Biokjemisk karakterisering og analyse av uoppløselige a-syn ved hjelp av buffere med økende vaskemiddel styrke og høy hastighet ultrasentrifugering gir et kraftig verktøy for å bestemme utviklingen av α-syn patologi assosiert med sykdomsprogresjon. Denne protokollen beskriver isolering av stadig uløselig / aggregert α-syn fra post-mortem menneskelig hjernevev. Denne metodikken kan tilpasses med modifikasjoner til studier av normale og unormale α-syn biologi i transgene dyremodeller som bærer forskjellige a-syn-mutasjoner, så vel som i andre nevrodegenerative sykdommer som har avvikende fibrillære avsetninger av proteiner som er relatert til deres respektive patologier.
Introduction
En av de viktigste patologiske trekk felles blant flere neurodegenerative sykdommer er dannelsen av unormale proteinaggregater som oppstår i et protein / sykdomsspesifikk måte en. Dermed er det de karakteristiske extraneuronal amyloid-beta plakk og aggregerte hyperfosforylert tau forekomster innenfor nevroner i Alzheimers sykdom (AD); de aggregerte a-syn innskudd i Lewy-legemer (LBS) som er intranevronale slutninger, og også innenfor dystrofiske nevronale prosesser kalt Lewy neuritter (LNS) i PD, PD demens og demens med Lewy-legemer (DLBs) 2-4. Unormale a-syn depositum kan også ses i kjennetegn lesjoner av gliaceller cytoplasmatiske slutninger i MSA 5. I Huntingtons sykdom, det er de karakteristiske Poly-Q innskudd, og unormal Tar DNA-bindende protein-43 og smeltet i sarkom proteiner (FUS) er avsatt i frontotemporal demens. Viktigere for PD, har α-syn genmutasjoner blitt funnet å cause autosomal dominant PD 6-11. I tillegg α-syn genet triplication 12 og duplisering 13 fører også familiær PD og dermed knytte økt α-syn uttrykk til pathomechanisms av PD. Spesielt, både sporadiske og familiære PD-tilfeller båtplass unormale forekomster av α-syn patologi 14. Nåværende tilgjengelige behandlinger for PD er kun palliativ og har ingen effekt på å stanse eller forsinke den ubønnhørlige sykdomsprogresjon.
α-syn er rikelig uttrykt i den menneskelige hjerne og utgjør ca 1% av den totale hjerne protein. Det er til stede mer spesifikt i de neuroner, men kan eksistere om enn i lavere mengder innen gliaceller. En omstridte punkt er den opprinnelige struktur av α-syn, som kan eksistere som en tilfeldig monomer 15 eller som en foldet tetramer 16. I løpet av sykdommen, forandrer α-syn dens konformasjon som gjør at den kan bli misfolded og denne prosessen er antatt å være årsaken til sykdommen pathogeNesis. Til tross for flere år med etterforskning av patofysiologiske aspekter av α-syn og sykdom, har de nøyaktige årsakene til sykdomsmekanismer vært unnvikende 14.
Studier ved hjelp av post-mortem analyse av Parkinson hjerner har så langt gitt viktige ledetråder om normal og unormal biologi α-syn både i sporadisk PD og også PD assosiert med mutasjoner i LRRK2 genet 17-22. Her har en biokjemisk ekstraksjon protokoll (se skjema vist i figur 1) for i økende grad uoppløselige a-syn-innskudd fra humant post-mortem PD hjernevev som havn α-syn-aggregater i varierende grad blitt beskrevet. Denne teknikken kan også bli tilpasset med modifikasjoner i bufferblandinger for å studere aggregerte proteiner fra andre nevrodegenerative sykdommer 23,24, og også fra transgene dyr hjernevev 25-27. Det viktigste hensynet for tilpasninger er forskjellene i solubiheten og de totale mengder av de respektive proteiner, hvorav noen er i hovedsak atom og kan ha behov for høy-saltbuffer for optimal ekstraksjon som vist for FUS 28.
Protocol
Post-mortem hjernevev ble donert til Queen Square Brain Bank for nevrologiske lidelser, University College London, Institute of Neurology bruker etisk godkjente protokoller og lagres for forskning under en lisens utstedt av menneskelig vev myndighet (HTA) UK (nr. 12198). Se listen av saker som brukes til denne protokoll (tabell 1).
1. Utarbeidelse av buffere
- Forbered 1X TBS (Tris-bufret saltvann) buffer:
- Forbered 10X TBS som stamoppløsning med 500 mM Tris-HCl pH 7,4 og 1500 mM NaCl.
- Vei ut 60,5 g Tris-Cl pH 7,6, og 87,6 g NaCl i 800 ml vann av høy renhet. Justere pH med en M HCl og ta den endelige aksjevolum til en L.
- Klargjør sluttkonsentrasjon på 1X TBS ved fortynning av lager 10 ganger i destillert vann.
- Legg proteasehemmere (PI), (1 tablett per 50 ml buffer) og Phos-stop fosfatase hemmer tabletter (1 tablett pr 10 ml buffer) tiloppheve effekten av ikke-spesifikke enzymatisk handlinger av proteaser og fosfataser.
Merk: Her har vi brukt enzymhemmeren tabletter fra Roche men like andre kommersielt tilgjengelige hemmere kan brukes i henhold til produsentens instruksjoner.
- Forbered 10X TBS som stamoppløsning med 500 mM Tris-HCl pH 7,4 og 1500 mM NaCl.
- Forbered TBS-SDS buffer ved tilsetning av 5% vekt / volum Natrium-dodecyl-sulfat (SDS) til 1X TBS (pH 7,4) buffer. Oppvarm løsningen til 60 ° C med konstant omrøring ved hjelp av en magnetisk rører for å oppløse SDS.
- Forbered TBS-SDS-urea-buffer ved å tilsette urea til en sluttkonsentrasjon på 8 M w / v til 1X SDS TBS-buffer (pH 7,4). Oppvarm løsningen til 60 ° C under konstant omrøring med en magnetisk rører for å oppløse urea.
2. Prøve Homogenisering og Differential Ultrasentrifuge
Merk: Følgende del av arbeidet innebærer håndtering av menneskelig hjernevev i henhold til reglene i HTA Storbritannia. Lokale standard operasjonsprosedyrer er fulgt i det hele tatt times. Hjerneprøver blir dissekert fra frosne hjerne blokker og vev materialet homogenisert i en microcabinet holdes ved undertrykk. Engangs kjoler hansker, ansiktsmasker, over-shoe beskyttere og vernebriller er slitt gjennom hele prosedyren. Humant vev avfallet kastes etter autoklavering ved 121 ° C i 20 min for sikker deponering. Sharps (skalpellblader) er plassert i en egnet beholder for skarpe gjenstander for oppsamling og trygg avhending.
- Ta en del av frossen menneskelig vev (ca. 0,5 g vekt fra basal ganglia region) og raskt hakke i små fragmenter (ca. 1 mm 2) på isen ved hjelp av en liten petriskål og en steril skalpell blad. Bruk en egen petriskål og skalpell blad for hver prøve. Samle kvernet vevet i et 15 ml rør og tilsett 10 volumer iskald buffer 1XTBS til røret.
- Homogen prøvene ved hjelp av en mekanisk homogenisator ved 20 000 rpm i 10 sekunder. Avkjøles på is i 2 min. Gjenta dette trinnet tre gangs.
Merk: Det er gjort slik at prøvene ikke varmes opp under homogenisering. - Avklare ved sentrifugering ved 1000 xg i 5 min ved 4 ° C. Kasser pelleten av ikke-homogeniserte materiale.
- Ta supernatant (råolje homogenate), legge til Polykarbonat sentrifugerør (størrelsen på røret avhenger rotor størrelse) og balansere nøye. Sentrifuger ved 100 000 xg i 1 time ved 4 ° C.
- Supernatanten beholder da dette er den TBS-løselige fraksjon.
- Vask pellet to ganger i fem volumer av 1X TBS-buffer og sentrifuger hver gang ved 100.000 xg i 15 min ved 4 ° C. Kast Supernatantene.
- Resuspender den endelige pellet ved sonikering av pelleten i 10 sekunder ved 20 kHz på ca. 5 volumer av TBS-1X SDS ved RT.
Merk: Før tillegg av sikkerhetsdatabladet inneholder bufferprøver bør bringes ved 10 ° C for å unngå SDS nedbør. - Ultrasentrifugering ved 100.000 xg i 30 min ved 25 ° C.
- Resuspender den endelige pellet ved sonikering av pelleten i 10 sekunder ved 20 kHz på ca. 5 volumer av TBS-1X SDS ved RT.
- Beholder supernatant som dette er the SDS løselig fraksjon.
- Vask pellet to ganger i 5 volumer 1X TBS-SDS buffer ved romtemperatur. Sentrifuger hver gang ved 100.000 xg i 15 min ved 25 ° C.
- Oppløse den siste pellet i 50 pl TBS-1X SDS-urea-buffer ved anvendelse av en sonikator satt til 20 kHz i 10 sek for å oppnå fullstendig oppløsning; Dette er kalt urea løselige fraksjon.
- Analysere hver fraksjon for totalt proteininnhold ved bruk av en kommersiell proteinanalyse-sett i overensstemmelse med fabrikantens protokoll. Fortynn TBS-SDS-urea-prøver på 1: 1 med 1 x TBS-buffer for å tillate kompatibilitet med protein assay-reagenser. Freeze prøver i små alikvoter (20 ul) ved -80 ° C for å redusere fryse-tine-sykluser.
Merk: Legge til 10% glyserol til prøver anbefales for langtidslagring ved -80 ° C.
3. Immunoblotting av prøver og analysere resultatene
- Kjør prøver fra TBS, TBS-SDS og TBS-SDS-Urea ekstrakter på 10-brønn 4-12% Bis-Tris polyacrylamidgelmed MOPS som buffer ved bruk av standard teknikker. Se Gallagher og Chakravarti (2008) 29 for en detaljert western blot protokollen.
- Belastning 10 ug protein fra hver prøve på hvert spor sammen med en molekylvekt markør for TBS og SDS og urea fraksjoner.
- Kjør gelen ved 200 V i en time eller inntil den blå fargestoff fra ladningsbuffer har nådd bunnen av gelen.
- Overfør proteiner fra gelene elektroforetisk på nylonmembraner 28, pre-fuktede først i 100% metanol og deretter inn i overføringsbuffer inneholdende 20% metanol. Tilveiebringe et identifikasjonsmerke på blot for å bestemme protein side og orienteringen av molekylvekt størrelsesmarkører.
- Sandwich gelen med membranen sammen vått filterpapir. Riktig plassering av membranen er avgjørende med membranen mellom gelen og anoden. Utfør overføring for to timer ved 40 V.
- Sminke 1X PBS-tween (1X PBS-T) buffer: Løs opp en tablett av PBS i 200 mlvann for å gi 0,01 M fosfatbuffer, 0,0027 M kaliumklorid og 0,137 M natriumklorid, pH 7,4.
- Blokkere membranen i 5% BSA-oppløsning i 1 x PBS-T i 30 minutter med risting ved 70 rpm. Dette forhindrer ikke-spesifikk binding av primært antistoff til membranen.
- Probe protein blot med 6 ml av α-syn primære antistoff Syn-1 (BD Biosciences, monoklonalt antistoff fra mus) ved 1: 750 fortynning (O / N ved 4 ° C), etterfulgt av en serie av vaskinger med 1 x PBS-T ( 3 x 5 min hver gang) 28.
- Inkuber blot med den passende HRP-konjugert sekundært antistoff i 1: 2000 fortynning i 30 min. Utføre en serie av vaskinger (3 x 5 minutter hver gang) med 1 x PBS-T.
- Fordype blotter i forbedret chemiluminescence løsning for 15 sek i et mørkt rom. Cover blotter med en plastfolie og sted autoradiografi filmer mot blot med protein siden opp i en lystett kassett for å fange de riktige signaler (passende størrelse band).
- Utvikle autoradiografi filmer i en automatisert utvikler.
Merk: Blot kan også utvikles manuelt med utbygger og fixer fra en kommersiell kilde i tilfelle en automatisert utbygger maskin er ikke tilgjengelig.
- Inkuber western blot med 6 ml av western blot stripping buffer for 10 min med konstant risting å strippe den blot av α-syn antistoff signal. Følg trinn 3,43 gjennom til 3.6.2 ved hjelp av beta-aktin primær antistoff (Mouse monoklonalt) ved 1: 8000 fortynning.
- Skanne og konvertere det endelige bildet inn et TIFF-bilde og måle tettheten ved hjelp av NIH ImageJ for kvantiteringsstandarder formål (en gratis nedlastbar programvare).
Merk: Programvaren tillater avlesning av tettheter av relative området av interesse (passende størrelse bånd), og dataene kan uttrykkes enten som et forhold mellom α-syn tetthet / β-actin (en vaktmester genet) som vilkårlige enheter eller på sin rett når en rengjørings gen ikke er gyldig (som i tilfellet av urealøselige prøver).
Representative Results
TBS, SDS og urea oppløselige proteiner ekstrahert fra basalgangliene følge protokollen vist i figur 1 ble kjørt på geler og immunoblottet med Syn-1 mus monoklonalt α-syn primære antistoff. TBS løselige fraksjoner viste nærvær av monomere α-syn (~ 14 kDa arter) i PD og kontroll sakene (figur 2A). SDS løselige fraksjoner viste også rikelig monomerisk α-syn i alle tre undertyper av tilfeller studert som vises i lav eksponering blot (figur 2C). PD tilfeller viste også høyere molekylvekt (MW) a-syn-arter som vist på den høye eksponeringen blot, som sannsynligvis vil være oligomerer (figur 2C). Urealøselige fraksjoner fra PD-tilfeller viste forhøyede mengder av a-syn-monomerer, oligomerer og aggregerte arter sammenlignet med kontrollgruppen tilfeller. De neokortikale idiopatisk PD-tilfeller utviser høyere mengder aggreg rerte α-SYN arter, mens det limbiske saker viser middels nivå av uløselig α-syn. Både SDS og urea fraksjoner fra idiopatisk PD-tilfeller vise variable nivåer av avkortede a-syn produkter på 12 kDa og 6 kDa som beskrevet 20. I kontrast, gjorde kontroll tilfeller ikke viser noen uløselig eller aggregeres α-syn (figur 2E). Semi-kvantitative tetthets tiltak reflektere mengden av LB belastning som categoriesd bruker α-syn immunhistokjemi demonstrere uløselig natur aggregert α-syn (figur 2B, 2D, 2F) i neokortikale og limbiske PD-tilfeller.
Figur 1. Prinsippskisse av uløselig α -syn utvinning prosedyre.rget = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representative immunoblotter av a -syn nivåer fra PD og kontrollere menneskelig vev. TBS, SDS og urealøselige fraksjoner fra basalgangliene (en region som havner α-syn patologi i PD-tilfeller) av idiopatisk PD-tilfeller og nevrologisk normal (kontroll) Hjernene ble analysert for tilstedeværelse av α-syn ved hjelp av western immunoblot. 10 ug protein ble applisert på hvert spor. I TBS fraksjonene (A), hovedsakelig α-syn- monomerer er til stede i alle tilfeller. I SDS-fraksjoner (C), er noen oligomerer av α-syn sett sammen med monomerene hovedsakelig i PD vev. I urea fraksjoner (C), monomerer, oligomerer og aggregert α-syn er trinnløst uttrykk i PD-tilfeller reflecting deres respektive LB belastning. De nevrologisk normale kontrollprøver viser tilstedeværelse av bare små mengder av monomere α-syn. Vær oppmerksom på mulige nedbrytningsprodukter av α-syn er sett i noen av tilfellene med høy LB belastning. Det faste pilhodet representerer den monomere formen av α-syn. Den * representerer muligens en C-terminalt avkortet form av α-syn som tidligere beskrevet 20,26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Sak | Kjønn | alder år | post-mortem forsinkelse (timer) | pH av vev |
| Neokortikale 1 | M | 82 | 40 | 6.3 |
| Neokortikale 2 | F | 75 | 35.3 | 6.4 |
| Limbiske 1 | M | 81 | 28.5 | 6.2 |
| Limbiske 2 | F | 79 | 36.5 | 6.2 |
| Kontroll 1 | M | 80 | 38 | 6.1 |
| Kontroll 2 | F | 83 | 32.5 | 6.3 |
Tabell 1. Begrenset demografi av tilfellene brukes
Discussion
Denne artikkelen beskriver en biokjemisk protokoll for ekstrahering og undersøkelse av de differensielle løselighetsegenskapene til monomere, oligomere og aggregeres α-syn fra syke hjernene ved hjelp av denaturerende gel driftsforhold. Dette er en veletablert teknikk for å studere aggregert α-syn 17, 18, 20, 21 et protein som normalt er oppløselig i sin native form, men får amyloidogene eller økt aggregering egenskaper med sykdomsprogresjon eller med genetiske mutasjoner. Likevel har noen grupper benyttet små variasjoner i SDS-konsentrasjoner i sine buffere (8% eller 10% i stedet for 5%) 21,22, 30. SDS er en anionisk detergent og solubilises α-syn-oligomerer som kan inneholde membranbundne former av α-syn, mens urea, denatures et kaotropt reagens de uløselige aggregert og fibrillære eller amyloidogene former av α-syn-20. I denne forbindelse en systematisk studie av Paleologou et al 31 undersøkte stabilitetenav a-syn-oligomerer og fibriller med varierende konsentrasjoner av urea (6,5 - 8 M) eller SDS (0,25-2%) og rapporterte at oligomerer stabile i SDS-konsentrasjoner, men ikke med høye konsentrasjoner av urea. Deres FILA-1 antistoff, spesifikt for a-SYN oligomerer og fibriller oppdaget høyere konsentrasjoner av fibriller 6.5 M urea konsentrasjoner under ikke-denaturerende forhold. Bufferkonsentrasjonene som ble anvendt i denne protokollen tett speil det som har blitt beskrevet i Culvenor et al. (1999) 32.
Anatomiske områder av hjernen til biokjemisk utvinning av uløselig α-syn bør velges med omhu, og dette bør gjenspeile α-syn LB og LN belastning avhengig av sykdomsprogresjon 33,34. Sakene som brukes her er basal ganglia prøver fra neokortikale og limbiske subtyper av PD reflekterer sene og mellomliggende stadier av PD progresjon i henhold til McKeith ctriteria 34. På Queen Square Brain Bank, er den ene halvdelen av hjernenrutinemessig fast i formalin for histokjemisk analyse og den andre halvparten er nøye dissekert i ulike anatomiske regioner og flash frosset og lagret ved -80 o C frysere for ytterligere biokjemiske og DNA / RNA-analyse studier. Etter formalin fiksering av hjernen og disseksjon av neuropathologists er immunhistokjemi utført ved hjelp av α-syn antistoff og resultater arkivert. Også som en rutinemessig prosedyre, blir pH i hjernevevet målt ved ankomst som et mål på agonal tilstand av hjernevevet. Dette danner et solid grunnlag for kvaliteten på vevet bevaring for biokjemisk analyse.
Våre data viser her at det er flere SDS oppløselige α-syn monomer i PD-tilfeller sammenlignet med kontroller; særlig neokortikale PD-tilfeller har høyere α-syn last i forhold til det limbiske PD variasjon. De neokortikale tilfeller representerer større progresjon av PD α-syn patologi i neokortikale regioner som frontpartiet og parietal corsis 33,34. Det limbiske PD-tilfeller har høyere LB score i de basale forhjerne / limbiske regioner områder som amygdala, transentorhinal og cingulate regioner. For meningsfull data og statistisk analyse, må man kjøre minst 4 tilfeller fra hver årsklasse. Likeledes har vi ikke forsøkt statistisk analyse av de data som er presentert her blot.
Det må også bemerkes at forskjellige antistoffer kan gjenkjenne forskjellige former / sammensetningen av høyere orden a-syn-oligomerer og hver kan ha sitt eget relative følsomhet og preferanser. Dette fremgår av resultatene av Tong et al., 29 hvor de viser at 4 forskjellige a-syn-antistoffer (syn-1, SS, ONCO og LB509) gir resultater som kan endres i det minste for a-syn-oligomerer / aggregater. De α-syn-monomerer ble gjenkjent med tilsvarende grad ved alle 4-antistoff, selv om disse kan ha variasjoner avhengig av om α-syn-antistoff epitop er lokalisert enten i N-terminal eller C-terminale 29. Tilsvarende spesifikke antistoffer for fosfo-alfa-synuclein bestemme tydelig med høy molekylvekt α-synuclein arter 20,21. I den protokoll som er beskrevet her, har den høyt karakterisert antistoffet Syn-1 blitt anvendt 19-21.
Imidlertid er det viktig å vurdere validere en ny antistoff på Western blot gjennom antistoff preabsorption eksperimenter og også overekspresjon og knockdown av proteinet i cellene.
Det er viktig å vurdere andre varianter som er brukt av forskere for å avgjøre mindre fragmenter av a-syn og eller ustabile tetramer a-syn former. Dette kan omfatte milde-fiksering av membraner med 0,4% PFA i PBS for å beholde avkortede former av α-syn 35 eller behandling av prøven homogenater med kryssbindere for å stabilisere tetramers 36.
Nøyaktig biokjemiske evaluering av proteiner ved hjelp av post-mortem tissue krever minimering av enzymatisk protein degradering og modifikasjon. Det er derfor lurt å bruke vev med de korteste obduksjons forsinkelser og / eller velg matchet prøver innenfor saks kohorter. Immunhistokjemi ved å bruke standard antistoff for α-syn immunhistokjemi bør utføres før start av isolasjonsprotokoll. Omfanget av α-syn patologi er svært variabel, og kan variere i henhold til utvalgte områder. Det er lurt å velge regioner med rikelig patologi som en positiv kontroll for optimal avkastning med hvert løp. Anvendelsen av protease-inhibitorer, og hvis det er nødvendig fosfatase-inhibitorer for å hindre uønsket enzymatisk nedbrytning etter frigjøring av intracellulære proteaser eller fosfataser som forekommer i løpet av cellelysering og vedlikehold av prøvene ved 4 ° C er avgjørende.
Det er viktig at alle prøvene innenfor den gruppe av forsøk håndteres jevnt og kontinuerlig for å unngå intraElle varianter; multippel freEze-tine sykluser bør unngås da dette kan potensielt trekke post-translasjonelle modifikasjoner som fosforylering. Et kritisk punkt å huske på når du undersøker et stort antall prøver er at dataene fra immunoblotter skal være normalisert til en prøve, som skal løpe parallelt med alle andre prøver på geleer, og alle data refererte til at prøven. Dette gjøres for å sikre normalisering av Immunoblotanalyse data mellom flere blotter. Dette er den metoden som ble vedtatt i vår fersk undersøkelse 22.
Det bør bemerkes at for å holde den lave bakgrunns ECL, blottene bør ikke få lov til å tørke ut når som helst i løpet av western blot-protokollen. I tillegg bør meget lange eksponeringer (> 10 min) på autoradiografi film unngås da dette vil føre til metning av ECL-signal og vil føre til unøyaktig kvantitering.
Dette ovenfor protokollen er en relativt grei teknikk med vanlige laboratorie reagenser og iinstrumenter og kan være et verdifullt verktøy for å undersøke patofysiologien av α-syn protein i PD forskning. Denne metodikken kan ikke bare bli utvidet med passende modifikasjoner til studiet av α-syn biologi i a-syn transgene dyr, men også til andre nevrodegenerative sykdommer med unormale forekomster av aggregerte proteiner som AD, MSA, DLB, HD og frontotemporaldementias. Men de vestlige blot data som er beskrevet her kan også bli validert ved hjelp av enzymbundet immunosorbentbestemmelser bruker antistoffer for bestemte former for α-syn 31.
Disclosures
Forfatteren har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-HCL | Sigma | T5912 | |
| sodium chloride | VWR | 27800.291 | |
| SDS | Fluka | 71727 | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 04 693 116001 | |
| Phosphatase inhibitor tablets | Roche | 04 906 837001 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma | P4417 | |
| Tween-20 | Sigma | P9416 | |
| NuPAGE MOPS SDS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| NuPAGE transfer buffer | Invitrogen | NP0006-1 | |
| Hybond-P membrane | GE Healthcare | RPN303F | |
| Whatman 3MM filter paper | Sigma | WHA30306185 | |
| Bis-tris gels 4-12% | Invitrogen | NP0322BOX | |
| Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| Bio-RAD DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | |
| Thickwall Beckman Polycarbonate tubes | Beckman | 355630 | |
| Western blot stripping buffer | Thermo scientific | 46430 | |
| Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 610786 | |
| beta-actin primary antibody (mouse monoclonal | Sigma | A5441 | |
| HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody | Santa Cruz | sc-2031 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Instrument | Company | Rotor/ model no | |
| Benchtop Ultracentrifuge Optima Max | Beckman | MLA-80 | |
| Sonicator | Heat Systems | XL20-20 | |
| Homogeniser | Jenke and Kunkel | TP18/10 |
References
- Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative disease a decade od discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10, 1055-1063 (2004).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M.
- Spillantini, M. G., Crowther, R. A., Jakes, R., Hasegawa, M., Goedert, M. Alpha-synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. Proc Natl Acad Sci. 95, 6469-6473 (1998).
- Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. Am J Pathol. 152, 879-884 (1998).
- Ahmed, Z., et al. The neuropathology, pathophysiology and genetics of multiple system atrophy. Neuroptahol Appl Neurobiol. 38 (1), 4-24 (2012).
- Ploymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science. 276, 2045-2047 (1997).
- Kruger, R., et al. Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease. Nat Genet. 18, 106-108 (1998).
- Zarranz, J. J., et al. The new mutation, E46K, of alpha-synuclein causes Parkinson and Lewy Body dementia. Ann. Neurol. 55, 164-173 (2004).
- Proukakis, C., et al. A novel alpha-synuclein missense mutation in Parkinson disease. Neurology. 80 (11), 1062-1064 (2013).
- Kiely, A., et al. Synucleinopathy associated with G51D SNCA mutation: a link between Parkinson's disease and Multiple System atrophy? Acta Neuropathol. 125 (5), 753-769 (2013).
- Lesage, S., et al. G51D alpha-synuclein mutation causes a novel Parkinson-pyramidal syndrome. Ann Neurol. 73 (4), 459-471 (2013).
- Singleton, A. B., et al. Alpha-synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science. 302, 841 (2003).
- Chartier-Harlin, M. C., et al. Alpha-synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease. Lancet. 364, 1167-1169 (2004).
- Cookson, M. R., Hardy, J., Lewis, P. A.
- Fauvet, B., et al. α-synuclein in central nervous system and from erythrocytes, mammalian cells, and. Escherichia coli exists predominantly as disordered monomer. J Biol Chem. 287, 15345-15364 (2012).
- Bartels, T., et al. α-synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477, 107-110 (2011).
- Campbell, B. C., et al. Accumulation of insoluble alpha-synuclein in dementia with Lewy bodies. Neurobiol of Dis. 7 (3), 192-200 (2000).
- Campbell, B. C., et al. The solubility of alpha-synuclein in multiple system atrophy differs from that of dementia with Lewy bodies and Parkinson's disease. J Neurochem. 76, 87-96 (2001).
- Miller, D. W., et al. Alpha-synuclein in blood and brain from familial Parkinson's disease with SNCA locus triplication. Neurology. 62, 1835-1838 (2004).
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
- Zhou, J., et al. Changes in the solubility and phosphorylation of alpha-synuclein over the course of Parkinson's disease. Acta Neuropathol. 121, 695-704 (2013).
- Mamais, A., et al. Divergent solubility and aggregation properties in G2019S LRRK2 Parkinson's disease brains with Lewy Body pathology compared to idiopathic cases. Neurobiol of Dis. 58, 183-190 (2013).
- Lashley, T., et al. A comparative clinical, pathological, biochemical and genetic study of fused in sarcoma proteinopathies. Brain. 134 (pt9), 2548-2564 (2011).
- Brelstaff, J., et al.
- Kahle, P. J., et al. Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes. EMBO reports. 3 (6), 583-588 (2002).
- Nuber, S., et al. A progressive dopaminergic phenotype associated with neurotoxic conversion of α-synuclein in BAC-transgenic rats. Brain. 136, 412-432 (2013).
- Tofaris, G. K., et al. Pathological changes in dopaminergic nerve cells odf the substantia nigra and olfactory bulb in mice transgenic for truncated human a-synuclein (1-120): implications for Lewy Body disorders. J Neurosci. 26 (15), 3942-3950 (2006).
- Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
- Gallagher, S., Chakravarti, D.
- Tong, J., et al. Brain alpha-synuclein accumulation in multiple system atrophy, Parkinson's disease and progressive supranuclear palsy: a comparative investigation. Brain. 133, 172-188 (2010).
- Paleologou, K. E., et al. Detection of elevated levels of soluble α-synuclein oligomers in post-mortem brain extracts from patients with dementia with Lewy bodies. Brain. 132, 1093-1101 (2009).
- Culvenor, J. G., et al. Non-Aβ component of Alzheimer s disease Amyloid (NAC) revisited. American Journal of Pathology. 155 (4), 1173-1181 (1999).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 24, 197-211 (2003).
- McKeith, I. G., et al. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB consortium. Neurology. 65, 1863-1872 (2005).
- Lee, B. R., Kamitani, T.
- Newman, A. J., et al. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous α-synuclein. PLoS ONE. 8 (11), e81314 (2013).
