Abstract
Alpha-synuclein (α-syn) protein rigeligt udtrykt primært inden for neuroner og findes i en række forskellige former - monomerer, tetramerer, oligomerer og fibriller. Under sygdom, α-syn undergår konformationelle ændringer til dannelse af oligomerer og højmolekylevægtsaggregater, der har tendens til at gøre proteinet mere uopløselige. Unormalt aggregeret α-syn er en neuropatologiske træk ved Parkinsons sygdom (PD), demens med Lewy organer (DLB) og multipel-system atrofi (MSA). Biokemisk karakterisering og analyse af uopløselige a-Syn ved hjælp buffere med stigende vaskemiddel styrke og høj hastighed ultracentrifugering giver et kraftfuldt værktøj til at bestemme udviklingen af α-syn patologi forbundet med sygdomsprogression. Denne protokol beskriver isoleringen af stadig mere uopløseligt / aggregeret α-syn fra post mortem menneskelige hjerne væv. Denne metode kan tilpasses med ændringer til studier af normal og unormal α-syn biologi i transgene dyremodeller huser forskellige a-syn mutationer såvel som i andre neurodegenerative sygdomme, der er udstyret afvigende fibrillære aflejringer af proteiner relateret til deres respektive patologier.
Introduction
Et af de vigtigste patologiske træk fælles blandt flere neurodegenerative sygdomme er dannelsen af unormale proteinaggregater der forekommer i et protein / sygdom specifik måde 1. Der er således de karakteristiske extraneuronal amyloid-beta plaques og aggregerede hyperphosphoryleret Tau-indskud inden neuroner i Alzheimers sygdom (AD); de aggregerede a-syn indskud i Lewy Bodies (LBS), som er intraneuronale inklusioner, og også inden for dystrofiske neuronal processer kaldet Lewy neuritter (LNS) i PD, PD demens og demens med Lewy organer (DLBs) 2-4. Unormale a-syn aflejringer ses også i kendetegnende læsioner af gliøse cytoplasmatiske inklusioner i MSA 5. I Huntingtons sygdom, er der de karakteristiske Poly-Q indlån, og unormal Tar DNA-bindende protein-43 og sammensmeltet i sarkom proteiner (FUS) er deponeret i frontotemporal demens. Vigtigere for PD, har α-SYN genmutationer vist sig at cauSE autosomal dominant PD 6-11. Derudover α-SYN gen triplication 12 og dobbeltarbejde 13 forårsager også familiær PD dermed forbinder øget α-syn udtryk for de patomekanismer af PD. Især både sporadiske og familiær PD sager harbor unormale aflejringer af α-syn patologi 14. Nuværende tilgængelige behandlinger for PD kun er palliativ og har ingen effekt på at standse eller forsinke den ubønhørlige sygdomsprogression.
α-syn er rigeligt udtrykt i den menneskelige hjerne og udgør omkring 1% af den totale hjerne protein. Det er til stede mere specifikt inden for neuronerne, men kan eksistere end i lavere mængder inden gliaceller. Et omstridt punkt er den native struktur α-syn, som kan eksistere som en tilfældig monomer 15 eller som et foldet tetramer 16. Under sygdom, α-syn ændrer sin konformation, der gør det muligt at få misfoldet og denne proces menes at være årsag til sygdommen pathogeNesis. Trods flere års undersøgelser af patofysiologiske aspekter af α-syn og sygdom, har de nøjagtige årsager til sygdomsmekanismer forblevet undvigende 14.
Undersøgelser med post-mortem analyse af Parkinson hjerner har hidtil forudsat vigtige spor om normal og unormal biologi α-syn i både sporadisk PD og også PD i forbindelse med mutationer i LRRK2 genet 17-22. Her er en biokemisk ekstraktion protokol (se skema vist i figur 1) for stadig uopløselige a-syn indskud fra human post mortem PD hjernevæv, som skjuler α-syn aggregater i varierende grad blevet beskrevet. Denne teknik kan også tilpasses med modifikationer i puffersammensætninger at studere aggregerede proteiner fra andre neurodegenerative sygdomme 23,24 og også fra transgene dyr hjernevæv 25-27. Den vigtigste overvejelse for tilpasningerne er forskellene i solubiheden og de samlede mængder af de respektive proteiner nogle af dem er primært kernekraft og kan have behov for høj-salt buffere for optimal udsugning som vist for FUS 28.
Protocol
Post mortem hjernevæv blev doneret til Queen Square Brain Bank for neurologiske lidelser, University College London, Institut for Neurologi hjælp etisk godkendte protokoller og lagres til forskning under en licens udstedt af den menneskelige væv myndighed (MTV) UK (nr. 12198). Se listen over sager, der anvendes til denne protokol (tabel 1).
1. Fremstilling af buffere
- Forbered 1X TBS (Tris-bufret saltvand) buffer:
- Forbered 10X TBS som stamopløsning med 500 mM Tris-HCI pH 7,4 og 1,500 mM NaCl.
- Ud 60,5 g Tris-CI pH 7,6 og 87,6 g NaCl i 800 ml højvande renhed vejes. Indstil pH med 1 M HCI og foretage den endelige stock volumen til 1 L.
- Forbered slutkoncentration på 1X TBS ved at fortynde lager 10 gange i destilleret vand.
- Tilføj proteasehæmmere (PI), (1 tablet pr 50 ml buffer) og Phos-stop phosphataseinhibitor tabletter (1 tablet per 10 ml buffer) tilophæver virkningerne af ikke-specifikke enzymatiske handlinger proteaser og fosfataser.
Bemærk: Her har vi brugt enzyminhibitoren tabletter fra Roche men lige så andre kommercielt tilgængelige inhibitorer kan anvendes i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Forbered 10X TBS som stamopløsning med 500 mM Tris-HCI pH 7,4 og 1,500 mM NaCl.
- Forbered TBS-SDS puffer ved tilsætning af 5% vægt / volumen natriumdodecylsulfat (SDS) til 1X TBS (pH 7,4) buffer. Opvarm opløsningen til 60 ° C under konstant omrøring med en magnetomrører for at solubilisere SDS.
- Forbered TBS-SDS-urinstofbuffer ved tilsætning af urinstof til en slutkoncentration på 8 Mw / v for at 1X TBS-SDS puffer (pH 7,4). Opvarm opløsningen til 60 ° C under konstant omrøring på en magnetomrører for at opløse urinstof.
2. Prøve Homogenisering og differentieret Ultracentifugering
Bemærk: Følgende del af arbejdet indebærer håndtering af humant hjernevæv efter reglerne i MTV UK. Lokale standardprocedurer følges på alle times. Hjerneprøver dissekeres fra frosne hjerne blokke og vævsmateriale homogeniseret i en microcabinet holdes ved undertryk. Engangs kjoler handsker, ansigt-masker, over-sko beskyttere og beskyttelsesbriller er slidt hele proceduren. Humant væv spildet kasseres efter autoklavering ved 121 ° C i 20 minutter for sikker bortskaffelse. Sharps (skalpelblade) er anbragt i en egnet beholder til skarpe genstande til inddæmning og sikker bortskaffelse.
- Tag en bid af frosset humant væv (ca. 0,5 g i vægt fra de basale ganglier regionen) og hurtigt hakkekød i små fragmenter (ca. 1 mm 2) på is under anvendelse af en lille petriskål og en steril skalpel. Bruge en separat petriskål og skalpelblad for hver prøve. Saml det hakkede væv i et 15 ml rør, og der tilsættes 10 volumener iskold buffer 1XTBS til røret.
- Homogeniseres prøverne ved anvendelse af en mekanisk homogenisator ved 20.000 rpm i 10 sek. Afkøl på is i 2 min. Gentag dette trin tre ganges.
Bemærk: Dette gøres således, at prøverne ikke er varmet op, mens homogenisering. - Præcisere ved centrifugering ved 1000 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Kassér pellet af ikke-homogeniserede materiale.
- Tag supernatant (rå homogenat), tilføje til polycarbonat centrifugerør (størrelse rør afhænger rotor størrelse) og balance omhyggeligt. Der centrifugeres ved 100.000 x g i 1 time ved 4 ° C.
- Bevarer supernatanten som dette er TBS-opløselige fraktion.
- Wash pellet to gange i fem volumener 1X TBS-buffer og centrifugeres hver gang ved 100.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Kassér supernatanterne.
- Resuspender den endelige pellet ved sonikering af pelleten i 10 sek ved 20 KHz i ca. 5 volumener 1X TBS-SDS ved stuetemperatur.
Bemærk: Inden tilsætning af SDS indeholder buffer prøver bør bringes ved 10 ° C for at undgå SDS nedbør. - Ultracentrifuge ved 100.000 xg i 30 minutter ved 25 ° C.
- Resuspender den endelige pellet ved sonikering af pelleten i 10 sek ved 20 KHz i ca. 5 volumener 1X TBS-SDS ved stuetemperatur.
- Bevarer supernatanten som dette er the SDS opløselige fraktion.
- Wash pellet to gange i 5 volumener 1X TBS-SDS puffer ved stuetemperatur. Centrifuger hver gang ved 100.000 xg i 15 minutter ved 25 ° C.
- Solubilisere den endelige pellet i 50 pi 1X TBS-SDS-urinstofbuffer under anvendelse af en sonikator indstillet til 20 kHz i 10 sek for at opnå fuldstændig opløsning; dette betegnes urinstof opløselige fraktion.
- Analysere hver fraktion for samlet proteinindhold anvendelse af et kommercielt proteinassaykit ifølge producentens protokol. Fortynd TBS-SDS-urea prøver 1: 1 med 1X TBS-buffer for at tillade kompatibilitet med protein assayreagenser. Frys prøver i små portioner (20 pi) ved -80 ° C for at reducere fryse-tø cykler.
Bemærk: tilsætning af 10% glycerol til prøver anbefales til langtidsopbevaring ved -80 ° C.
3. Immunoblotting af prøver og analysere resultater
- Kør prøver fra TBS, TBS-SDS og TBS-SDS-urea ekstrakter på 10-brønds 4-12% Bis-Tris polyacrylamidgelmed MOPS som løbebuffer anvendelse af standardteknikker. Se Gallagher og Chakravarti (2008) 29 for en detaljeret western blot-protokollen.
- Load 10 ug protein fra hver prøve på hver bane sammen med en molekylvægt markør for TBS og SDS og urinstof fraktioner.
- Kør gel ved 200 V i 1 time eller indtil det blå farvestof fra loadingpuffer har nået bunden af gelen.
- Overfør proteiner fra geler elektroforetisk på nylonmembraner 28, forvædet først i 100% methanol og derefter i overførsel puffer indeholdende 20% methanol. Tilvejebringe et identifikationsmærke på blottet for at bestemme protein side og orienteringen af molekylevægt størrelsesmarkører.
- Sandwich gelen med membranen sammen med vådt filtrerpapir. Korrekt placering af membranen er afgørende med membranen mellem gel og anoden. Udfør overførslen i 2 timer ved 40 V.
- Der fyldes op 1X PBS-Tween (1X PBS-T) puffer: Opløs 1 tablet PBS i 200 mlvand til opnåelse 0,01 M phosphatpuffer, 0,0027 M kaliumchlorid og 0,137 M natriumchlorid, pH 7,4.
- Blokere membranen i 5% BSA-opløsning i 1X PBS-T i 30 minutter under omrystning ved 70 rpm. Dette forhindrer uspecifik binding af primært antistof på membranen.
- Sondere protein blot med 6 ml α-syn primære antistof Syn-1 (BD Biosciences, mus monoklonalt antistof) ved 1: 750 fortynding (O / N ved 4 ° C) efterfulgt af en række vaske med 1X PBS-T ( 3 x 5 minutter hver gang) 28.
- Inkuber blot med den passende HRP-konjugeret sekundært antistof ved 1: 2.000 fortynding i 30 minutter. Udføre en række vaske (3 x 5 min hver gang) med 1X PBS-T.
- Fordybe blots i forøget kemiluminescens opløsningen i 15 sekunder i et mørkt rum. Cover klatter med en plastfolie og sted autoradiografi film mod blottet med protein opad i et lys-bevis kassette til at fange de rette signaler (passende størrelse bands).
- Udvikle autoradiografiundersøgelser film i en automatiseret udvikler.
Bemærk: Blots kan også udvikles manuelt ved hjælp udvikler og fixer fra en kommerciel kilde i tilfælde en automatiseret udvikler maskine er ikke tilgængelig.
- Inkuber western blot med 6 ml western blot stripping buffer i 10 minutter under konstant omrystning at fratage blot af α-syn antistof signal. Følg trin 3.43 igennem til 3.6.2 under anvendelse af beta-actin primære antistof (mus monoklonalt) ved 1: 8.000 fortynding.
- Scan og konvertere det endelige billede i en TIFF-billede og måle tætheder hjælp NIH ImageJ til kvantificering formål (et gratis software til downloading).
Bemærk: Softwaren giver mulighed for læsning af tætheder af relative areal af interesse (de passende størrelse bånd), og dataene kan udtrykkes enten som et forhold mellem α-syn tæthed / β-actin (et hus-holde-gen) som arbitrære enheder eller på sin ret, når et hus holde gen er ikke gyldig (som i tilfælde af urinstof-opløselige prøver).
Representative Results
TBS, SDS og urinstof opløselige proteiner ekstraheret fra basalganglierne ifølge protokollen vist i figur 1 blev kørt på geler og immunoblottedes med Syn-1 muse-monoklonalt α-syn primære antistof. TBS opløselige fraktioner viste tilstedeværelsen af monomere α-syn (~ 14 kDa arter) i PD og kontrol undersøgte tilfælde (figur 2A). SDS opløselige fraktioner viste også rigeligt monomere α-syn i alle tre undertyper af undersøgte tilfælde som vist i lav eksponering blot (figur 2C). PD tilfælde viste også højere molekylvægt (MW) a-Syn arter, som ses på den høje eksponering skamplet, som sandsynligvis vil være oligomerer (Figur 2C). Urinstof opløselige fraktioner fra PD sager viste forhøjede mængder af a-syn monomerer, oligomerer og aggregerede arter sammenlignet med styre sager. De neocorticale idiopatisk PD sager demonstrere større mængder af AGGREG ated α-Syn arter, mens de limbiske sager viser mellemliggende niveauer af uopløseligt α-syn. Både SDS og urinstof fraktioner fra idiopatisk PD sager demonstrere variable niveauer af trunkerede a-SYN produkter på 12 kDa og 6 kDa som beskrevet 20. I modsætning hertil har de kontrolforanstaltninger sager ikke nogen uopløselige eller aggregeret α-syn (Figur 2E). Semi-kvantitative tæthed foranstaltninger afspejler mængden af LB belastning som categoriesd hjælp α-SYN immunhistokemi demonstrerer den uopløselige karakter af aggregeret α-syn (figur 2B, 2D, 2F) i neocorticale og limbiske PD sager.
Figur 1. Skematisk diagram af uopløseligt α -syn ekstraktionsmetode.rFå = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentative immunoblotter af a -syn niveauer fra PD og styre humant væv. TBS, SDS og urinstof opløselige fraktioner fra basalganglierne (en region, der huser α-syn patologi i PD tilfælde) på idiopatisk PD tilfælde og neurologisk normale (kontrol) hjerne blev analyseret for tilstedeværelsen af α-syn anvendelse af Western immunoblot. 10 ug protein blev sat på hver bane. I TBS fraktioner (A), hovedsageligt α-SYN monomerer er til stede i alle tilfælde. I SDS fraktioner (C), er nogle oligomerer af α-syn ses sammen med monomerer hovedsageligt i PD væv. I urinstof fraktioner (C), monomerer, oligomerer og aggregeret α-syn er variabelt udtryk i PD sager reflektinproteinerg deres respektive LB belastning. De neurologisk normale kontrolprøver viser tilstedeværelsen af kun små mængder af monomere α-syn. Bemærk mulige nedbrydningsprodukter af α-syn ses i nogle af de tilfælde med høj LB belastning. Den faste pilehoved repræsenterer den monomere form af α-syn. Den * muligvis repræsenterer en C-terminalt trunkeret form af α-syn som tidligere beskrevet 20,26. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Tilfælde | Køn | alder ved død år | post mortem forsinkelse (timer) | pH af væv |
| Neocorticale 1 | M | 82 | 40 | 6.3 |
| Neocorticale 2 | F | 75 | 35.3 | 6.4 |
| Limbiske 1 | M | 81 | 28.5 | 6.2 |
| Limbiske 2 | F | 79 | 36,5 | 6.2 |
| Kontrol 1 | M | 80 | 38 | 6.1 |
| Kontrol 2 | F | 83 | 32,5 | 6.3 |
Tabel 1. Begrænset demografi af de sager, der anvendes
Discussion
Denne artikel beskriver en biokemisk protokol for ekstraktion og undersøgelse af forskellen opløselighed egenskaber monomere, oligomere og aggregeret α-syn fra syge hjerner ved hjælp af denaturerende gel driftsforhold. Dette er en veletableret teknik til at undersøge aggregerede α-syn 17, 18, 20, 21 et protein, der normalt er opløseligt i dets native form, men få amyloidogene eller forøgede aggregationsegenskaber med sygdomsprogression eller med genetiske mutationer. Ikke desto mindre har nogle grupper anvendt små variationer i SDS-koncentrationer i deres buffere (8% eller 10% i stedet for 5%) 21,22, 30. SDS er en anionisk detergent og opløser α-syn oligomerer, der kan omfatte membranbundne former af α-syn, mens urinstof, en kaotropisk reagens denaturerer de uopløselige aggregerede og fibrillære eller amyloidogene former for α-syn 20. I denne henseende en systematisk undersøgelse af Paleologou et al 31 undersøgte stabilitetaf a-syn oligomerer og fibriller med varierende koncentrationer af urea (6,5 - 8 M) eller SDS (0,25-2%) og rapporterede, at oligomerer stabile i SDS-koncentrationer, men ikke ved høje koncentrationer af urinstof. Deres FILA-1-antistof, der er specifikt for a-syn oligomerer og fibriller påvist højere koncentrationer af fibriller på 6,5 M urinstof koncentrationer under ikke-denaturerende betingelser. De buffer anvendte koncentrationer i denne protokol nøje afspejler det, der er beskrevet i Culvenor et al. (1999) 32.
De anatomiske områder af hjernen for biokemisk udvinding af uopløseligt α-syn bør nøje udvalgt, og dette bør afspejle α-Syn LB og LN belastning afhængig af sygdomsprogression 33,34. Sagerne her anvendes, er basalganglierne prøver fra neocorticale og limbiske undertyper af PD afspejler sene og mellemliggende stadier af PD progression i henhold til McKeith ctriteria 34. På Queen Square Brain Bank, den ene halvdel af hjernen errutinemæssigt fikseret i formalin til histokemisk analyse og den anden halvdel er omhyggeligt dissekeret i forskellige anatomiske områder og lynfrosset og opbevaret ved -80 ° C frysere til yderligere biokemiske og DNA undersøgelser / RNA-analyse. Efter formalin fiksering af hjerne og dissektion ved neuropathologists er immunhistokemi udføres ved hjælp α-SYN antistof og resultater arkiveret. Også som en rutinemæssig procedure, er pH af hjernevæv målt ved ankomsten som et mål for agonal tilstand af hjernevæv. Dette danner et solidt grundlag for kvaliteten af væv bevaring for biokemisk analyse.
Vore data viser her, at der er flere SDS opløselige α-syn monomer i PD tilfælde sammenlignet med kontroller; navnlig neocortical PD tilfælde har højere α-syn belastning i forhold til det limbiske PD sort. De neocorticale tilfælde repræsenterer en større progression af PD α-syn patologi i neocorticale regioner såsom frontale og parietale corsis 33,34. Det limbiske PD sager har højere LB scores i den basale forhjerne / limbiske områder områder såsom amygdala, transentorhinal og cingulate regionerne. For meningsfyldt data og statistisk analyse, må man køre mindst 4 sager fra hver kohorte. Ligeledes har vi ikke forsøgt statistisk analyse af blottet data, der præsenteres her.
Det skal også bemærkes, at forskellige antistoffer kan genkende forskellige former / sammensætning højere ordens a-Syn oligomerer og hver kan have sin egen relative følsomhed og præferencer. Det fremgår af resultaterne af Tong et al. 29, hvor de viser, at 4 forskellige a-syn antistoffer (Syn-1, SS, Onco og LB509) giver udskiftelige resultater i det mindste for a-syn oligomerer / aggregater. De α-SYN monomerer blev anerkendt i tilsvarende grad af alle 4 antistoffer, selv om disse kan have variation alt efter om α-syn antistofepitop ligger enten i den N-terminale eller Cterminale 29. Tilsvarende specifikke antistoffer for phospho-alpha synuclein bestemme særskilte høj molekylvægt α-synuclein arter 20,21. I protokollen beskrevet her, har den meget karakteriseret antistof Syn-1 er blevet anvendt 19-21.
Det er imidlertid vigtigt at overveje validering nye antistof på western blots gennem antistof præadsorption eksperimenter og også overekspression og knockdown af proteinet i celler.
Det er vigtigt at overveje andre variationer, der er blevet anvendt af forskere til at bestemme mindre fragmenter af a-syn og eller ustabile tetramere a-syn former. Dette kunne omfatte mild fiksering af membraner med 0,4% PFA i PBS for at bevare trunkerede former af α-syn 35 eller behandling af prøven homogenater med tværbindere at stabilisere tetramerer 36.
Nøjagtig biokemisk evaluering af proteiner ved hjælp af post mortem-tissue kræver minimering af enzymatisk proteinnedbrydning og modifikation. Det er derfor tilrådeligt at bruge væv med de korteste post mortem forsinkelser og / eller vælg matchede prøver inden for de case-kohorter. Immunohistokemi ved hjælp af standard antistoffer til α-syn immunhistokemi skal udføres før start isolation protokollen. Omfanget af α-syn patologi er meget variable og kan variere alt efter regioner udvalgt. Det er tilrådeligt at vælge regioner med rigelige patologi som en positiv kontrol for optimal udbytte med hvert løb. Anvendelsen af proteasehæmmere og om nødvendigt phosphataseinhibitorer at forhindre uønsket enzymatisk nedbrydning efter frigivelsen af intracellulære proteaser eller phosphataser, der opstår under cellelysis og vedligeholdelse af prøverne ved 4 ° C er afgørende.
Det er vigtigt, at alle prøverne inden for batch af eksperimenter håndteres jævnt og konsekvent at undgå intra-user variationer; multiple frebør undgås eze-tø-cykler, da dette potentielt kan trække post-translationelle modifikationer såsom phosphorylering. En kritisk punkt at huske på, når behandlingen af en lang række prøver er, at data fra immunoblots bør være normaliseret til en prøve, der skal køre sideløbende med alle andre prøver på geler og alle data, der henvises til denne prøve. Dette gøres for at sikre normalisering af immunoblot data mellem flere blots. Det er den metode, der blev vedtaget i vores seneste undersøgelse 22.
Det skal bemærkes, at for at holde baggrunden ECL lav, blottene bør ikke have lov til at tørre ud på noget tidspunkt under western blot-protokollen. Desuden bør meget lange eksponeringer (> 10 min) på autoradiografi film undgås, da dette vil føre til mætning af ECL-signalet og vil føre til unøjagtige kvantificering.
Denne ovennævnte protokol er en forholdsvis enkel teknik ved hjælp af fælles laboratoriereagenser og iinstrumenter og kan være et værdifuldt værktøj til at undersøge patofysiologien af α-syn protein i PD forskning. Denne metode kan ikke kun forlænges med passende modifikationer til studiet af α-syn biologi i a-SYN transgene dyr, men også for andre neurodegenerative sygdomme featuring unormale aflejringer af aggregerede proteiner såsom AD, MSA, DLB, HD og frontotemporaldementias. Men Western blot data beskrevet her kunne også valideres ved hjælp enzymkoblede immunosorbentassays hjælp antistoffer til særlige former for α-syn 31.
Disclosures
Forfatteren har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-HCL | Sigma | T5912 | |
| sodium chloride | VWR | 27800.291 | |
| SDS | Fluka | 71727 | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 04 693 116001 | |
| Phosphatase inhibitor tablets | Roche | 04 906 837001 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma | P4417 | |
| Tween-20 | Sigma | P9416 | |
| NuPAGE MOPS SDS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| NuPAGE transfer buffer | Invitrogen | NP0006-1 | |
| Hybond-P membrane | GE Healthcare | RPN303F | |
| Whatman 3MM filter paper | Sigma | WHA30306185 | |
| Bis-tris gels 4-12% | Invitrogen | NP0322BOX | |
| Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| Bio-RAD DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | |
| Thickwall Beckman Polycarbonate tubes | Beckman | 355630 | |
| Western blot stripping buffer | Thermo scientific | 46430 | |
| Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 610786 | |
| beta-actin primary antibody (mouse monoclonal | Sigma | A5441 | |
| HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody | Santa Cruz | sc-2031 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Instrument | Company | Rotor/ model no | |
| Benchtop Ultracentrifuge Optima Max | Beckman | MLA-80 | |
| Sonicator | Heat Systems | XL20-20 | |
| Homogeniser | Jenke and Kunkel | TP18/10 |
References
- Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative disease a decade od discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10, 1055-1063 (2004).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M.
- Spillantini, M. G., Crowther, R. A., Jakes, R., Hasegawa, M., Goedert, M. Alpha-synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. Proc Natl Acad Sci. 95, 6469-6473 (1998).
- Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. Am J Pathol. 152, 879-884 (1998).
- Ahmed, Z., et al. The neuropathology, pathophysiology and genetics of multiple system atrophy. Neuroptahol Appl Neurobiol. 38 (1), 4-24 (2012).
- Ploymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science. 276, 2045-2047 (1997).
- Kruger, R., et al. Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease. Nat Genet. 18, 106-108 (1998).
- Zarranz, J. J., et al. The new mutation, E46K, of alpha-synuclein causes Parkinson and Lewy Body dementia. Ann. Neurol. 55, 164-173 (2004).
- Proukakis, C., et al. A novel alpha-synuclein missense mutation in Parkinson disease. Neurology. 80 (11), 1062-1064 (2013).
- Kiely, A., et al. Synucleinopathy associated with G51D SNCA mutation: a link between Parkinson's disease and Multiple System atrophy? Acta Neuropathol. 125 (5), 753-769 (2013).
- Lesage, S., et al. G51D alpha-synuclein mutation causes a novel Parkinson-pyramidal syndrome. Ann Neurol. 73 (4), 459-471 (2013).
- Singleton, A. B., et al. Alpha-synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science. 302, 841 (2003).
- Chartier-Harlin, M. C., et al. Alpha-synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease. Lancet. 364, 1167-1169 (2004).
- Cookson, M. R., Hardy, J., Lewis, P. A.
- Fauvet, B., et al. α-synuclein in central nervous system and from erythrocytes, mammalian cells, and. Escherichia coli exists predominantly as disordered monomer. J Biol Chem. 287, 15345-15364 (2012).
- Bartels, T., et al. α-synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477, 107-110 (2011).
- Campbell, B. C., et al. Accumulation of insoluble alpha-synuclein in dementia with Lewy bodies. Neurobiol of Dis. 7 (3), 192-200 (2000).
- Campbell, B. C., et al. The solubility of alpha-synuclein in multiple system atrophy differs from that of dementia with Lewy bodies and Parkinson's disease. J Neurochem. 76, 87-96 (2001).
- Miller, D. W., et al. Alpha-synuclein in blood and brain from familial Parkinson's disease with SNCA locus triplication. Neurology. 62, 1835-1838 (2004).
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
- Zhou, J., et al. Changes in the solubility and phosphorylation of alpha-synuclein over the course of Parkinson's disease. Acta Neuropathol. 121, 695-704 (2013).
- Mamais, A., et al. Divergent solubility and aggregation properties in G2019S LRRK2 Parkinson's disease brains with Lewy Body pathology compared to idiopathic cases. Neurobiol of Dis. 58, 183-190 (2013).
- Lashley, T., et al. A comparative clinical, pathological, biochemical and genetic study of fused in sarcoma proteinopathies. Brain. 134 (pt9), 2548-2564 (2011).
- Brelstaff, J., et al.
- Kahle, P. J., et al. Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes. EMBO reports. 3 (6), 583-588 (2002).
- Nuber, S., et al. A progressive dopaminergic phenotype associated with neurotoxic conversion of α-synuclein in BAC-transgenic rats. Brain. 136, 412-432 (2013).
- Tofaris, G. K., et al. Pathological changes in dopaminergic nerve cells odf the substantia nigra and olfactory bulb in mice transgenic for truncated human a-synuclein (1-120): implications for Lewy Body disorders. J Neurosci. 26 (15), 3942-3950 (2006).
- Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
- Gallagher, S., Chakravarti, D.
- Tong, J., et al. Brain alpha-synuclein accumulation in multiple system atrophy, Parkinson's disease and progressive supranuclear palsy: a comparative investigation. Brain. 133, 172-188 (2010).
- Paleologou, K. E., et al. Detection of elevated levels of soluble α-synuclein oligomers in post-mortem brain extracts from patients with dementia with Lewy bodies. Brain. 132, 1093-1101 (2009).
- Culvenor, J. G., et al. Non-Aβ component of Alzheimer s disease Amyloid (NAC) revisited. American Journal of Pathology. 155 (4), 1173-1181 (1999).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 24, 197-211 (2003).
- McKeith, I. G., et al. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB consortium. Neurology. 65, 1863-1872 (2005).
- Lee, B. R., Kamitani, T.
- Newman, A. J., et al. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous α-synuclein. PLoS ONE. 8 (11), e81314 (2013).
