Abstract
Directe omzetting van cardiale fibroblasten (CFS) in geïnduceerde hartspiercellen (ICMS) heeft een groot potentieel voor de regeneratieve geneeskunde door het aanbieden van alternatieve strategieën voor de behandeling van hart-en vaatziekten. Deze conversie is bereikt door geforceerde expressie van bepaalde factoren zoals GATA4 (G), MEF2C (M) en Tbx5 (T). Traditioneel ICMS worden gegenereerd door een cocktail van virussen die deze individuele factoren. Echter, herprogrammering rendement relatief laag is en de meeste in vitro G, M, T-getransduceerde fibroblasten niet volledig zijn geprogrammeerd, waardoor het moeilijk om de herprogrammering mechanismen te bestuderen. We hebben onlangs aangetoond dat de stoichiometrie van G, M, T is cruciaal voor efficiënte icm herprogrammering. Een optimale stoïchiometrie van G, M, T met relatief hoog M en lage niveaus van G en T bereikt door onze polycistronische MGT vector (hierna MGT) aanzienlijk toegenomen herprogrammering efficiënter en ICM kwaliteit in vitro. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de gebruikte ICMS met MGT construct van cardiale fibroblasten te genereren methodologie. Isolatie van cardiale fibroblasten, generatie virus herprogrammering en evaluatie van de herprogrammeringsproces zijn ook een platform voor efficiënte en reproduceerbare generatie ICMS verschaffen.
Protocol
Het protocol hier geschetste gebruikt neonatale muizen. Dierlijke zorg en experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met de door de afdeling Laboratory Animal Medicine (DLAM) aan de Universiteit van North Carolina, Chapel Hill richtlijnen.
1. Bereiding van Buffers en media
- Bereid fibroblast (FB) medium: Supplement 500 ml IMDM-medium met 100 ml foetaal runderserum (FBS) en 6 ml penicilline / streptomycine.
- Bereid ICM medium: Supplement 400 ml DMEM medium met 100 ml M199 media en 50 ml FBS.
- Bereid B27 medium: Supplement 490 ml RPMI1640 media met 10 ml B27 media.
- Bereid Plat-E kweekmedium: Supplement 500 ml DMEM medium met 50 ml FBS, 5 ml penicilline / streptomycine en 5 ml niet-essentiële aminozuren.
- Bereid Plat-E transfectiemedium: Supplement 500 ml DMEM medium met 50 ml FBS en 5 ml niet-essentiële aminozuren.
- Prepare gelatine gecoate 24 wells plaat: Voeg 0,5 ml 0,1% gelatine-oplossing met een putje van 24 putjesplaat, incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 10 minuten en zuig vlak voor gebruik.
- Bereid FACS labeling buffer: Supplement 500 ml DPBS met 10 ml FBS en 2 ml EDTA (0,5 M) tot een eindconcentratie van 2 mM te bereiken. Passeren door een 0,22 pm filter en bewaar bij 4 ° C.
- Bereid sorteren MACS buffer: Supplement 500 ml DPBS met 2,5 g BSA en 2 ml EDTA (0,5 M) tot een eindconcentratie van 2 mM te bereiken. Passeren door een 0,22 pm filter en bewaar bij 4 ° C.
- Bereid 2x HBS buffer voor transfectie: aanvullen 500 ml HEPES-buffer (50 mM) met 280 mM NaCl (8,1816 g), 10 mM KCl (0,37275 g), 1,5 mM Na 2 HPO 4 (0,10647 g), 12 mM glucose (1,08096 g ). Voeg ongeveer 650 pi 10 N NaOH om de pH op 7,05-7,12. Filteren door een 0,22 pm porie filter en bewaar bij 4 ° C.
- Bereid 2,5 M CaCl2-oplossing voor transfectie: Voeg 18,376 g CaCl 2 om 50 ml DDH 2 O. Filteren door een 0,22 pm porie filter en bewaar bij 4 ° C.
- Bereid ICC (immunocytochemie) fixatie buffer: Voeg 5 ml paraformaldehyde (PFA, 32%) tot 35 ml DPBS tot een uiteindelijke concentratie van 4% te bereiken.
- Bereid ICC permeabilisatie buffer: Voeg 0,1 ml Triton tot 100 ml DPBS tot een eindconcentratie van 0,1% te bereiken.
- Bereid ICC blokkerende buffer: Voeg 5 g Bovine serum albumine (BSA) tot 100 ml DPBS tot een eindconcentratie van 5% bereikt.
- Bereid ICC kleurbuffer Voeg 1 g BSA tot 100 ml DPBS tot een uiteindelijke concentratie van 1% te bereiken.
2. Generatie van neonatale muis Cardiale fibroblasten
- Genereren van cardiale fibroblasten van explantatie kweekmethode
- Clean neonatale αMHC-GFP transgene muizen (P1 tot P2) met 75% ethanol. Snijd het hoofd af met een steriele schaar. Vervolgens een horizontale incisie onder een oksel naar de andere. Gebruik een sterielestompe en gebogen tang om ontleden uit het hart en plaats het in een putje van de 24 wells plaat met ijskoud PBS buffer.
- Als alternatief, knijp het hart na de horizontale snede.
- Check GFP expressie in hart door fluorescentiemicroscoop. Omdat de GFP expressie wordt gedreven door αMHC promoter die een cardiale specifieke promotor, moet het hart van transgene muizen in groen 15, terwijl de negatieve hart is zwak in een fluorescentie.
- Neem 3-4 GFP positieve harten in een 60 mm centrum goed cultuur schotel en gehakt ze in kleine stukjes van minder dan 1 mm 3 in grootte door een steriele schaar en pincet.
- Plaats 3-4 gehakt harten in een 10 cm schotel met 2 ml FB media. Laat de weefsels settelen voor 3 uur.
- Voeg langzaam 8 ml voorverwarmde FB media om de gerechten met hart weefsels. Laat de weefsels niet storen voor drie dagen.
- Vervang de media om de drie dagen.
- Op dag 7, Aspiraten het kweekmedium en was cellen met DPBS. Voeg 3 ml 0,05% trypsine aan elke plaat en vertering bij 37 ° C gedurende 5 min.
- Voeg 5 ml FB media om trypsine te lessen. Voorzichtig los van de cellen met een cel schraper. Pipet de media op en neer om verder mechanisch distantiëren van het weefsel.
- Verzamel cellen en filtreer door 40 urn cel filters verontreinigd hartweefsel fragmenten te vermijden, en vervolgens pellet cellen door spinnen bij 200 xg gedurende 5 min.
- Was cellen eenmaal met MACS buffer en cellen zijn klaar voor het sorteren.
- Clean neonatale αMHC-GFP transgene muizen (P1 tot P2) met 75% ethanol. Snijd het hoofd af met een steriele schaar. Vervolgens een horizontale incisie onder een oksel naar de andere. Gebruik een sterielestompe en gebogen tang om ontleden uit het hart en plaats het in een putje van de 24 wells plaat met ijskoud PBS buffer.
- Genereren van cardiale fibroblasten van enzymdigestie methode
- Oogst GFP positieve harten als 2.1.1. Breng alle harten in een 10 cm schaal met 10 ml ijskoude DPBS.
- Knijp ventrikels met een steriel pincet om bloed te verwijderen en een keer spoelen met ijskoude DPBS.
- Trim de harten vrij van andere weefsels en vet te zijn.
- Snijd elk hart in ongeveer 4 stukken die nog steeds losjes verbonden zijn.
- Indien minder dan 20 harten, breng de harten in een 15 ml conische buis met 8 ml warme 0,05% trypsine-EDTA, en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min.
- Als er 20-30 harten, breng de harten in een 50 ml conische buis met 10 ml warme 0,05% trypsine-EDTA, en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min.
- Gooi het trypsine en voeg 5 ml (minder dan 20 harten) of 10 ml (20-30 harten) warm type II collagenase (0,5 mg / ml) in HBSS.
- Vortex de buis op vortexer gedurende 1 min bij een snelheidsniveau ongeveer 4 tot 6 (indien de vloeistof niet opstaan om het deksel wordt het toerental is goed).
- Incubeer de buis 37 ° C waterbad gedurende 3-5 min.
- Vortex de buis gedurende 1 min.
- Sediment gedurende 1 minuut door de zwaartekracht tot het weefselstukken vestigen, verzamel de vloeistof in een nieuwe buis met 5 ml koud FB medium.
- Herhaal stappen 2.2.6-2.2.10 3-5 keer.
- Combineren alle collecties door te filteren door middel van 40 micrometer cel zeefom enkele celsuspensie te maken.
- Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Resuspendeer cellen in 10 ml MACS-buffer en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Optioneel: Als er veel bloedcellen, resuspendeer cellen met 1 ml RBC lysis buffer (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3 en 0,1 mM EDTA), houdt op ijs gedurende 1 minuut, daarna verdund met 10 ml MACS buffer en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 min. Was nog een keer met MACS buffer.
- Isolatie van Thy1.2 + fibroblasten door MACS (magnetische-geactiveerde cel sortering)
- Bepaal aantal levensvatbare cellen door middel van trypan blauwe vlekken.
- Neem 10 pi cellen uit 10 ml celsuspensie in stap 2.2.14. Meng het met 10 pi 0,4% trypan blauwe oplossing.
- Voeg het mengsel van een hemocytometer. Laat het 3-5 minuten staan en dan onmiddellijk te onderzoeken onder een microscoop. De dode cellen zijn gekleurd in blauw en levensvatbare cellen ongekleurd.
- Bepaal aantal levensvatbare cellen door middel van trypan blauwe vlekken.
- Voor minder dan 1 x 10 7 cellen, resuspendeer cellen met 10 pi Thy1.2 microbolletjes in 90 gl gekoeld MACS buffer. Voeg meer parels verhouding als er meer dan 1 x 10 7 cellen. Goed mengen en incuberen in een koelkast (2-8 ° C) gedurende 30 min.
- Voeg 10 ml MACS-buffer en centrifugeren monsters bij 200 xg gedurende 5 min; eenmaal wassen met 10 ml MACS-buffer en centrifugeer weer.
- Breng volume op 2 ml in MACS buffer.
- Het opzetten van een MACS Separator in capuchon. Plaats een LS kolom aan de separator. Breng 3 ml MACS buffer aan de kolom te equilibreren.
- Leid de celsuspensie door de LS kolom geëquilibreerd.
- Was 3 keer met 2 ml MACS buffer elke keer.
- Neem de kolom LS uit tHij Separator en elueer 3 maal met 2 ml MACS buffer naar een nieuwe 50 ml buis.
- Spin bij 200 xg gedurende 5 min.
- Resuspendeer cellen in 10 ml FB media, de telling van de cellen en zaad in platen op de juiste dichtheid. Voor fibroblasten gegenereerd uit explantaatkweek methode, kan de zaaien cellen dichtheid ongeveer 3/2 x 10 4 cellen / putje van de 24 wells plaat. Voor fibroblasten gegenereerd uit enzymdigestie methode, zou de cellen dichtheid ongeveer 5/4 x 10 4 cellen / putje van de 24 wells plaat.
3. Productie van retrovirus voor icm herprogrammeren
Opmerking: Voer de volgende stappen in een BSL2 bioveiligheidskast onder steriele omstandigheden. De correcte verwijdering van getransfecteerde cellen, pipetpunten en buisjes wordt aanbevolen om het risico van milieu- en gezondheidsrisico's te voorkomen.
- Handhaaf Plat-E cellen Plat-E medium aangevuld met 1 ug / ml puromycine en 10 ug / ml blasticidin bij 37 ° C met 5% CO2.
- Op dag 2, vervang het medium door Plat-E kweekmedium ontbreekt puromycine en blasticidine.
- Op dag 0, split Plat-E cellen in 10 cm schalen van de dag vóór transfectie bij ongeveer 4-5 x 10 6 cellen per plaat. De cellen moeten ~ 80-90% confluent op de dag van transfectie.
- Op dag 1, wijziging kweekmedia transfectie media op cellen binnen 1 uur voorafgaand aan transfectie. Transfectie procedure is als volgt:
- Transfectie met behulp van commerciële kits
- Meng 20 pl transfectiereagens (bijvoorbeeld Lipofectamine) en 500 ul verminderde serum media (bijvoorbeeld Opti-MEM). Voeg 10 pg van de retrovirale plasmide een 500 ul gereduceerd serum medium. Incubeer elk mengsel bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 min.
- Voeg langzaam het plasmide mengsel transfectie mengsel. Deze stap kan 15-30 seconden duren. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (oplossing kan troebel). Voeg mengsel druppelsgewijs aan de cellen.
- Incubeer overnacht in een 37 ° C incubator.
- Transfectie met calciumfosfaat.
- Mix 40 pi 2,5 M CaCl 2 en 440 pl DDH 2 O, voeg dan 20 pg van de retrovirale plasmide (pas het bedrag van DDH 2 O, zodat de totale hoeveelheid is 500 pl).
- Voeg 500 ul 2x HBS een 15 ml conische buis.
- Vortex de HBS en ondertussen voeg de calcium-DNA-mengsel aan de HBS druppelsgewijs. Deze stap duurt ongeveer 30 seconden voor elk monster. Dus maximaal doen 3-4 monsters tegelijk.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min Incubatie gedurende langere tijd leidt tot grotere neerslag en minder cellen zal de neerslag.
- Voeg het mengsel druppelsgewijs naar de cellen en acht onder 20X microscoop. Fijne precipitaten (een heleboel kleintjes zijn goed, maar een paar grote bedrijven zijn niet goed) moet worden gezien.
- Incubeer overnacht bij 37 ° C incubator.
- Op dag 2, veranderen de media op cellen met 8 ml voorverwarmd kweekmedium. Incubeer 24 uur.
- Op dag 3 en dag 4, verzamel kweeksupernatant van de schotels met een 10 ml steriele wegwerpspuit, filtering door een 0,45 urn poriegrootte celluloseacetaatfilter en overbrengen naar een 50 ml buis. Voeg 2 ml van retrovirus precipitatieoplossing elk 8 ml virus-bevattende supernatant. Voorzichtig mengen en incubeer overnacht bij 4 ° C.
- Op dag 5, draai het virale mengsel bij 1500 xg bij 4 ° C gedurende 30 min. De virale deeltjes moet in witte pellet op de bodem van de buis.
- Verwijder het supernatant. Spin down resterende oplossing door centrifugatie bij 1500 x g gedurende 5 min. Verwijder alle sporen van de vloeistof door aspiratie, het nemen van grote zorg van de neergeslagen retrovirale deeltjes niet te storen in pellet.
- Resuspendeer retrovirale pellets met 100 gl DPBS buffer voor elk 8 ml viraal supernatant. Evenmatighet virus op ijs. Onmiddellijk te gebruiken of op te slaan bij -80 ° C.
4. Herprogrammering van Cardiale fibroblasten
- Voeg 4 pi 10 mg / ml polybreen oplossing in de 10 ml Icm medium en meng voorzichtig op en neer te pipetteren. De eindconcentratie van polybreen is 4 ug / ml.
- Voeg 500 ul ICM medium dat polybreen aan elke well van 24 wells plaat geënt met fibroblasten.
- Voeg 10 ul retrovirus aan elk putje met ofwel 03/02 x 10 4 cellen uit explantatie cultuur of 5/4 x 10 4 cellen van enzymdigestie methode. De hoeveelheid virus proportioneel worden verhoogd met een verhoogd aantal cellen in verschillende kweekplaten of schotels. Plaats de plaat in een 37 ° C incubator gedurende 24-48 uur om de virale infectie toe. De tijdslijn cardiale herprogrammering wordt getoond in figuur 1.
- Na virale transductie, vervang virus bevattende media met 500 ul icm reguliere media.
- Veranderen de media om de 2-3 dagen. Voor positieve selectie van viraal getransduceerde cellen, voeg icm medium aangevuld met puromycine bij 2 ug / ml aan doelwitcellen. Houd het voor drie dagen. Daarna houden puromycine in de ICM medium bij een concentratie van 1 ug / ml.
- Drie dagen na virale infectie, neem de plaat uit de incubator en plaats het onder een omgekeerde fluorescentie microscoop (20X) om GFP expressie te observeren.
Opmerking: Tien dagen na virale infectie, kunnen cellen voor FACS-analyse en ICC analyse om de herprogrammering efficiëntie vast worden geoogst (in stap 5 en 6). - Veertien dagen na de virale infectie, vervang ICM media B27 media. Veranderen de media om de drie dagen. Spontane kloppende cel loci kan blijken uit drie (cellen van enzymdigestie methode) of vier (cellen van explantaatkweek methode) weken na de virale transductie.
5. Immunocytochemische Analyse van herprogrammeren Efficiency
- Rinse cellenmet ijskoud PBS driemaal; verwijdert overtollige oplossing.
- Voeg 0,5 ml ICC fixatie buffer aan elk putje van platen met 24 putjes. Fixeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 15-20 min.
- Spoel de cellen met PBS driemaal.
- Voeg 0,5 ml ICC permeabilisatie buffer aan elk putje van de 24 wells platen. Permeabilize de cellen bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Spoel de cellen met PBS driemaal.
- Voeg 0,5 ml ICC blockingbuffer elke well van 24 wells plaat, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Verdunde primaire antilichamen met ICC-vlekken buffer. Voeg 200 ul antilichaam oplossingen aan elk putje en incubeer overnacht bij 4 ° C. De antilichaamverdunning factoren worden opgesomd in Materials.
- De volgende dag wassen cellen met PBS driemaal.
- Voeg 200 ul secundair antilichaam oplossingen aan de cellen en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
- Was de cellen met PBS driemaal.
- Voeg 150 ul bevestigingsoplossing met DAPI aan elk putje. Laat kernen vlek gedurende 1 min. Danbestrijken elk putje met ronde glazen afdekplaat slip en druk de slip tegen de onderkant met een tang om luchtbellen te verwijderen.
- Zuig het overtollige oplossing en de monsters zijn klaar voor de beeldvorming. De representatieve beelden die de geherprogrammeerd cellen die uitdrukken cardiale marker cTnT en αActinin bij d14 zijn weergegeven in figuur 2B.
6. FACS analyse van herprogrammeren Efficiency
- Grondig cellen één keer met DPBS. Voeg 0,3 ml trypsine (0,05%) aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min.
- Tik voorzichtig de plaat naar het opheffen van de cellen te vergemakkelijken. Controleer de cel detachement onder de microscoop. Voeg 1 ml FACS buffer aan elk putje wanneer de meeste cellen worden gescheiden. Pipet op en neer om verder mechanisch scheiden van de cellen.
- Transfer cellen in de 24 wells plaat met een 96 well diepe well plaat ook goed. Spin bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om de cellen te verzamelen.
- Was de cellen eenmaal metFACS buffer.
- Voeg 100 ul fixatie / permeabilisatie oplossing om cellen opnieuw in suspensie gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Was de cellen tweemaal met 1x wasoplossing, pellet en verwijder supernatant.
- Bereid primaire antilichaam oplossing tegen GFP en cTnT in 1x wasbuffer. Grondig mengen elk monster met 50 gl antilichaamoplossing en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 min.
- Was cellen eenmaal in 1x wasoplossing, pellet en verwijder supernatant.
- Voeg 50 ul secundair antilichaam oplossing met Alexa Fluor 488 geconjugeerd ezel anti-konijn IgG en Alexa Fluor 647-geconjugeerd ezel-anti muis IgG aan elk monster. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 min in het donker.
- Was cellen eenmaal in 1x wasoplossing, pellet en verwijder supernatant.
- Resuspendeer cellen in 400 gl fixatie buffer (DPBS met 1% PFA). Transfer cel in FACS buis met cel zeef dop. Monsters zijn klaar voor FACS detectie. De vertegenwoordiger FACS analyse van de herprogrammering efficiency behulp pMxs-puromycine-MGT construct met of zonder puromycine selectie wordt getoond in figuur 2A.
- Transfectie met behulp van commerciële kits
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De herprogrammering stappen zijn samengevat schema in figuur 1. Na MGT transductie kan GFP expressie in cellen herprogrammering al op dag 3. Puromycineselectie van getransduceerde cellen begint vanaf dag 3 en de eerste twee weken gehandhaafd wordt waargenomen PMX-puro -MGT construct wordt gebruikt. Overdag 10 tot dag 14, zou expressie van cardiale markers zoals cTnT en αActinin worden gedetecteerd door zowel ICC (figuur 2B, stap 5) en FACS (Figuur 2A, stap 6), wat aangeeft dat het uitgangsmateriaal fibroblasten herprogrammering ondergaan naar een hartcel lot.
Figuur 1. Schematische weergave van de directe cardiale herprogrammeringsproces Procedures op elk tijdstip worden in zwarte dozen. Voedingsbodems voor elke fase worden weergegeven in gekleurde vakken onder de tijdlijn.
Figuur 2: herprogrammeren efficiency geëvalueerd door FACS en ICC (A) FACS analyse van ICMS gegenereerd uit vers geïsoleerde fibroblasten op dag 10 na de MGT transductie.. (B) Het kleuren van ICM op 2 weken αMHC-GFP, cardiale cTnT en αActinin met DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol). Schaal bar: 200 pm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor een succesvolle ICM generatie bij het gebruik van dit protocol, zijn er een aantal belangrijke factoren die een impact hebben op de algehele efficiëntie. Vooral de voorwaarden van het starten van fibroblasten en de kwaliteit van retrovirus dat codeert MGT kan grote invloed herprogrammering efficiency.
Het is belangrijk om fibroblasten als vers en gezond mogelijk te genereren. Voor explantaatkweek werkwijze kan fibroblasten worden gebruikt voor zeven dagen na de explantaten werden uitgeplaat op de vaat. Voor enzymdigestie werkwijze kan fibroblasten al de volgende dag van isolatie worden toegepast. Bevriezing of passage van de fibroblasten voor de herprogrammering wordt niet aanbevolen. Deze extra behandelingen van fibroblasten zal de herprogrammering efficiëntie aanzienlijk dalen. De zaaidichtheid is een andere belangrijke factor die de herprogrammering efficiëntie beïnvloedt. Als cellen zijn dun gezaaid, ze de neiging om ongezonde met onregelmatige cel morfologie en in groot formaat te worden. Zelden coULD die cellen omgezet in ICMS. Als cellen te dicht gezaaid wordt de MOI (multipliciteit van infectie) van virale infectie afgenomen. Overmatige groei van niet-geïnfecteerde fibroblasten aanzienlijk verdunt de herprogrammering gebeurtenissen hetgeen resulteert in een laag percentage van ICMS. We merken ook de opkomst van kleinere cellen in kasseien-achtige morfologie als er meer cellen worden gezaaid voor herprogrammering. Ze kon nauwelijks worden geherprogrammeerd en dus resulteren in verminderde efficiëntie herprogrammering. Bij het aanpassen van het protocol voor verschillende grootte van weefselkweekplaten, wordt aanbevolen zaaien celaantallen proportioneel aangepast aan het oppervlak van de kweekschaal.
De zuiverheid van fibroblasten is essentieel voor herprogrammering. De hoge zuiverheid van fibroblasten kon worden bereikt door FACS sortering of 15 MACS verrijking zoals we hier beschreven. Vergeleken met FACS sorteren, MACS sortering is makkelijker, zachter, en handiger. Cel zuiverheid na MACS kan oplopen tot meer dan 90% wduivin strikt volgens het protocol. Lage zuiverheid van fibroblasten kan herprogrammering efficiëntie afnemen omdat de besmette cellen moeilijker te herprogrammeren dan fibroblasten en dat ze veel sneller prolifereren dan herprogrammering cellen. Het is ook zeer aan te bevelen om de cellen te zaaien direct na MACS en uitvoeren virale infectie overnachten na zaaien. Het gesorteerd fibroblasten kan gedeeltelijk verouderend worden na kweken in schotel lang, die opname van het retrovirus dat alleen infecteert de prolifererende cellen afneemt. Tail-tip fibroblasten (TTFs) en embryonale fibroblasten (MEF) gemeld worden omgezet in ICMS met andere transcriptiefactoren 10,12,19,26. Ons protocol richt zich alleen hier op de cardiale fibroblasten. De toepassing van dit protocol om andere fibroblast types kan verder worden geoptimaliseerd vanwege de inherente variaties van fibroblast handtekeningen, zoals de proliferatie status genetische en epigenetische bezienswaardigheden.
The kwaliteit van retrovirus voor transductie van het grootste belang. Lage titer virussen niet aan fibroblasten zetten in ICMS. Terwijl virussen bij overmatige hoeveelheid cytotoxiciteit die rechtstreeks leidt tot celdood fibroblasten zal veroorzaken. Het is noodzakelijk de virale titer te bepalen en optimaliseren de virale dosering voor herprogrammering basis van laboratoriumopstelling en de testomstandigheden. Werkwijze virale titratie werd grondig eerder beschreven 23. In feite hebben we vonden dat de groei voorwaarde van Plat-E cellen rechtstreeks betrekking op virale kwaliteit. Aanbevolen wordt Plat-E cellen ontdooien bij lage passage (<30) per keer. Cellen verkregen bij passage drie zijn het beste voor de verpakking virus bij een dichtheid ongeveer 4-5 x 10 6 cellen per 10 cm cultuur schotel. Bovendien, de vers geoogste virussen opleveren herprogrammering hoger rendement dan bevroren virussen. Houd er rekening mee dat co-infectie van MGT virus met een andere pMxs vector gebaseerd retrovirus de herprogrammering efficiëntie possib verlagenly vanwege de concurrentie tussen de twee virussen van hetzelfde type. Twee verschillende transfectie methoden worden hier gegeven. Beide methoden produceren vergelijkbare retrovirus. Terwijl commerciële Lipofectamine is kostbaar, maar stabiel, transfectie met calciumfosfaat goedkoper. Voorbereiding van de HBS-buffer moet zeer voorzichtig te nemen omdat de pH van HBS buffer aanzienlijke invloed op de transfectie-efficiëntie.
Er zijn een aantal beperkingen van dit protocol die moeten worden aangepakt. Een van de beperkingen ligt in het gebruik van retrovirus, wat onvermijdelijk maakt bioveiligheid problemen. De heterogeniteit van fibroblasten en het gebrek aan specifieke cardiale fibroblasten marker voor isolatie ook van invloed op de zuiverheid van cellen die herprogrammeerbare zijn. Variatie van herprogrammering efficiëntie kan worden waargenomen als gevolg van batch variabiliteit die inherent zijn aan fibroblast conditie en virus productie. Bovendien, hoewel de geherprogrammeerd cellen brengen sarcomeer structuur eiwitten zoals cardiaal troponine TαActinin en zijn ze nog steeds niet volwassen hartspiercellen kenmerk functionele eigenschappen zoals contractiliteit en elektrische voortplanting.
Samengevat, de hier beschreven werkwijze maakt een efficiënte productie van ICM op basis van retrovirale afgifte van M, G, T transcriptiefactoren in één construct. Ons protocol voorziet in een reproduceerbare en waardevol platform voor ICM onderzoek, en zal voortdurende inspanningen op high-throughput screening en mechanistische studies van icm herprogrammering te vergemakkelijken, en uiteindelijk verhuizen ICM herprogrammering veld dichter bij klinische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-cardiac troponin T | Thermo Scientific | MS-295-PO | 1:200 for FACS and 1:400 for ICC |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | 1:500 for both FACS and ICC |
| anti- aActinin | Sigma-Aldrich | A7811 | 1:500 for both FACS and ICC |
| anti-Connexin43 | Sigma-Aldrich | C6219 | 1:500 for ICC |
| anit-Mef2c | Abcam | ab64644 | 1:1,000 for ICC |
| anti-Gata4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1237 | 1:200 for ICC |
| anti-Tbx5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17866 | 1:200 for ICC |
| Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-545-152 | 1:500 for both FACS and ICC |
| Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 715-605-150 | 1:500 for both FACS and ICC |
| Cytofix/Cytoperm kit for intracellular staining | BD Biosciences | 554722 | |
| Rhod-3 Calcium Imaging Kit | Life Technologies | R10145 | |
| Thy1.2 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | |
| Vectashield solution with DAPI | Vector labs | H-1500 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F-2442 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052 | |
| PRMI1640 medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| IMDM | Life Technologies | 12440-053 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| M199 medium | Life Technologies | 10-060 | |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin | Corning | 30-002 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11130-050 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668500 | |
| blasticidin | Life Technologies | A11139-03 | |
| puromycin | Life Technologies | A11138-03 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | BP358-212 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | PX1405 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | 9048-46-8 | |
| paraformaldehyde | EMS | 15714 | |
| Retrovirus Precipitation Solution | ALSTEM | VC-200 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Corning | 21022 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 0.45 μm cellulose acetate filter | Thermo Scientific | 190-2545 | |
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Thermo Scientific | 172958 | |
| 60 mm center well culture dish | Corning | 3260 | |
| 96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well Plate | Denville Scientific | P9639 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Vortexer MINI | VWR | 58816-121 | |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System | Life Technologies | AMAFD1000 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Round glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 72195-15 |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2014).
- Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
- Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
- Choi, W. Y., Poss, K. D.
- Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A.
- Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
- Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
- Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
- Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
- Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577 (2013).
- Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
- Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
- Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
- Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
- Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
- Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
- Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. , (2014).
- Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. , (2014).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
- Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652 (2012).
- Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
- Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. , 116-216 (2015).
- Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).
