Abstract
La conversione diretta dei fibroblasti cardiaci (CFS) in cardiomiociti indotte (ICMS) ha un grande potenziale per la medicina rigenerativa, offrendo strategie alternative per il trattamento di malattie cardiache. Questa conversione è stato ottenuto mediante espressione forzata di fattori definiti come Gata4 (G), MEF2C (M) e Tbx5 (T). Tradizionalmente, ICMS sono generati da un cocktail di virus che esprimono questi singoli fattori. Tuttavia, riprogrammazione efficienza è relativamente basso e la maggior parte in vitro G, M, T-trasdotte fibroblasti non diventano completamente riprogrammati, rendendo difficile lo studio dei meccanismi di riprogrammazione. Abbiamo recentemente dimostrato che la stechiometria di G, M, T è fondamentale per un'efficiente riprogrammazione ICM. Un stechiometria ottimale di G, M, T ad alto livello relativo di M e bassi livelli di G e T ottenuti utilizzando il nostro vettore MGT policistronico (di seguito denominato MGT) significativamente maggiore efficienza riprogrammazione e una migliore qualità Icm in vitro. Qui forniamo una descrizione dettagliata della metodologia utilizzata per generare ICMS con MGT costrutto da fibroblasti cardiaci. Isolamento di fibroblasti cardiaci, la generazione di virus per la riprogrammazione e la valutazione del processo di riprogrammazione sono inclusi anche di fornire una piattaforma per la generazione efficiente e riproducibile di ICMS.
Protocol
Il protocollo descritto qui utilizza topi neonati. La cura degli animali e gli esperimenti sono eseguiti in conformità con le linee guida stabilite dalla Divisione di Medicina di Laboratorio animali (àlam) presso l'Università del North Carolina, Chapel Hill.
1. Preparazione di buffer e Media
- Preparare fibroblasti (FB) mezzo: Supplemento 500 ml supporti IMDM con 100 ml di siero fetale bovino (FBS) e 6 ml di penicillina / streptomicina.
- Preparare ICM medio: Supplemento 400 ml supporti DMEM con 100 ml mezzi M199 e 50 ml di FBS.
- Preparare media B27: Supplemento 490 ml RPMI1640 multimediali con 10 ml B27 media.
- Preparare Plat-E terreno di coltura: Supplemento 500 ml supporti DMEM con 50 ml di FBS, 5 ml di penicillina / streptomicina e 5 ml aminoacidi non essenziali.
- Preparare Plat-E medio trasfezione: Supplemento 500 ml supporti DMEM con 50 ml di FBS e 5 ml aminoacidi non essenziali.
- Prepare gelatina rivestito 24 pozzetti: Aggiungere soluzione di gelatina 0,5 ml di 0,1% ad un pozzo di 24 pozzetti, incubare a 37 ° C per almeno 10 minuti e aspirare a destra prima dell'uso.
- Preparare tampone etichettatura FACS: Supplemento 500 ml DPBS con 10 ml di FBS e 2 ml di EDTA (0,5 M) per raggiungere una concentrazione finale di 2 mm. Passare attraverso un filtro di 0,22 micron e conservare a 4 ° C.
- Preparare MACS ordinamento buffer: Supplemento 500 ml DPBS con 2,5 g BSA e 2 ml di EDTA (0,5 M) per ottenere una concentrazione finale di 2 mM. Passare attraverso un filtro di 0,22 micron e conservare a 4 ° C.
- Preparare tampone HBS 2x per trasfezione: integrare 500 ml di tampone HEPES (50 mM) con 280 mM NaCl (8,1816 g), KCl 10 mM (0,37,275 mila g), 1,5 mM Na 2 HPO 4 (0,10,647 mila g), glucosio 12 mM (1,08,096 mila g ). Aggiungere circa 650 ml NaOH 10 N per aggiustare il pH a 7,05-7,12. Filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron pori e conservare a 4 ° C.
- Preparare 2,5 M CaCl 2 soluzione per la trasfezione: Aggiungere 18,376 g CaCl 2 a 50 ml DDH 2 O. Filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron pori e conservare a 4 ° C.
- Preparare ICC (immunoistochimica) tampone fissazione: Aggiungere 5 ml di paraformaldeide (PFA, 32%) a 35 ml DPBS per raggiungere una concentrazione finale del 4%.
- Preparare tampone permeabilizzazione ICC: Aggiungere 0,1 ml di Triton a 100 ml DPBS per raggiungere una concentrazione finale di 0,1%.
- Preparare ICC tampone bloccante: Aggiungere 5 g di albumina di siero bovino (BSA) per 100 ml DPBS per raggiungere una concentrazione finale del 5%.
- Preparare tampone colorazione ICC: Aggiungere 1 g BSA a 100 ml DPBS per raggiungere una concentrazione finale di 1%.
2. Generazione di neonatali mouse fibroblasti cardiaci
- Generare fibroblasti cardiaci dal metodo di coltura espianto
- Clean neonatale αMHC-GFP topo transgenico (P1 a P2) con il 75% di etanolo. Tagliare la testa con le forbici sterili. Poi fare una incisione orizzontale da sotto un'ascella all'altra. Utilizzare uno sterileforcipe smussato e piegate a sezionare il cuore e collocarlo in un pozzetto della piastra 24 pozzetti contenenti tampone PBS ghiacciata.
- In alternativa, spremere il cuore dopo l'incisione orizzontale.
- Controllare espressione GFP nel cuore al microscopio a fluorescenza. Poiché l'espressione GFP è guidato da αMHC promotore che è un promotore specifico cardiaco, cuore di topo transgenico dovrebbe essere in verde 15, mentre il cuore negativo è scarsa in alcuna fluorescenza.
- Prendere 3-4 GFP cuori positivi in un centro ben piatto di coltura 60 mm e tritateli pezzetti meno di 1 mm 3 dimensioni di forbici sterili e pinze.
- Mettere 3-4 cuori tritato in un piatto 10 centimetri con 2 ml di mezzi FB. Lasciate che i tessuti stabilirsi per 3 ore.
- Lentamente aggiungere 8 ml supporti FB pre-riscaldato per i piatti contenenti tessuti cardiaci. Non disturbare i tessuti per tre giorni.
- Sostituire i media ogni tre giorni.
- Il giorno 7, aspirmangiato il terreno di coltura e lavare le cellule con DPBS. Aggiungere 3 ml 0,05% tripsina per ciascuna piastra e digerire a 37 ° C per 5 min.
- Aggiungere 5 ml supporto FB per placare la tripsina. Staccare delicatamente le cellule con un raschietto cellulare. Pipettare media su e giù per dissociare ulteriormente meccanicamente il tessuto.
- Raccogliere le cellule e filtrare attraverso 40 micron filtri cellulari per evitare la contaminazione dei frammenti di tessuto cardiaco, e poi pellet cellule facendo girare a 200 xg per 5 min.
- Lavare le cellule una volta con MACS tampone e le cellule sono pronte per l'ordinamento.
- Clean neonatale αMHC-GFP topo transgenico (P1 a P2) con il 75% di etanolo. Tagliare la testa con le forbici sterili. Poi fare una incisione orizzontale da sotto un'ascella all'altra. Utilizzare uno sterileforcipe smussato e piegate a sezionare il cuore e collocarlo in un pozzetto della piastra 24 pozzetti contenenti tampone PBS ghiacciata.
- Generare fibroblasti cardiaci dal metodo di digestione enzimatica
- Harvest GFP cuori positivi come 2.1.1. Trasferire tutti i cuori in un piatto 10 centimetri con 10 ml di DPBS ghiacciate.
- Spremere ventricoli con pinza sterile per rimuovere il sangue e lavare una volta con DPBS gelide.
- Tagliare i cuori di essere libero di altri tessuti e grasso.
- Tagliare ogni cuore in circa 4 pezzi che sono ancora collegate liberamente.
- Se meno di 20 cuori, trasferire i cuori in un tubo da 15 ml con 8 ml caldo 0,05% tripsina-EDTA, e incubare a 37 ° C per 15 min.
- Se ci sono 20-30 cuori, trasferire i cuori in una provetta conica da 50 ml con 10 ml caldo 0,05% tripsina-EDTA, e incubare a 37 ° C per 15 min.
- Eliminare la tripsina e aggiungere 5 ml (per meno di 20 cuori) o 10 ml (per 20-30 cuori) caldo collagenasi di tipo II (0,5 mg / ml) in HBSS.
- Vortex tubo sul vortex per 1 min a livello velocità intorno 4 a 6 (se il liquido non ottiene fino al coperchio, allora la velocità è bene).
- Incubare la provetta in 37 ° C bagnomaria per 3-5 minuti.
- Vortex la provetta per 1 min.
- Sedimenti per 1 min per gravità fino a che i pezzi di tessuto stabilirsi, raccogliere il liquido in un nuovo tubo contenente 5 ml di medie FB freddo.
- Ripetere i punti 2.2.6-2.2.10 3-5 volte.
- Unire tutte le collezioni filtrando attraverso 40 micron colino cellaper rendere sospensione singola cella.
- Centrifugare a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Risospendere le cellule in 10 ml MACS buffer e centrifugare a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Opzionale: se ci sono un sacco di cellule del sangue, risospendere le cellule con 1 ml di RBC tampone di lisi (150 mm NH 4 Cl, 10 KHCO mm 3, e 0.1 mM EDTA), tenere in ghiaccio per 1 minuto, quindi diluire con 10 ml MACS buffer e centrifugare a 200 xg per 5 min. Lavare una volta con il tampone MACS.
- Isolamento di Thy1.2 + fibroblasti da MACS (magnetico attivato separazione delle cellule)
- Determinare il numero di cellule vitali attraverso tripano colorazione blu.
- Prendere 10 celle microlitri dalla sospensione cellulare 10 ml al punto 2.2.14. Mescolare con 10 microlitri 0,4% trypan soluzione blu.
- Aggiungere il composto di un emocitometro. Lasciare riposare per 3-5 minuti e poi esaminare immediatamente al microscopio. Le cellule morte vengono colorate in cellule blu e vitali sono senza macchia.
- Determinare il numero di cellule vitali attraverso tripano colorazione blu.
- Per meno di 1 x 10 7 cellule, risospendere le cellule con 10 microlitri microsfere Thy1.2 in 90 microlitri di buffer MACS refrigerati. Aggiungere più perline proporzionalmente se ci sono più di 1 x 10 7 cellule. Mescolare bene e incubare in frigorifero (2-8 ° C) per 30 min.
- Aggiungere 10 ml MACS tampone e campioni di spin a 200 xg per 5 minuti; lavare una volta con tampone 10 ml MACS e centrifugare di nuovo.
- Portare il volume a 2 ml in tampone MACS.
- Impostare un separatore MACS in cappuccio. Inserire una colonna LS al separatore. Applicare 3 ml MACS Buffer alla colonna di equilibrare esso.
- Passare la sospensione cellulare attraverso la colonna LS equilibrata.
- Lavare 3 volte con 2 ml di buffer MACS ogni volta.
- Prendere colonna LS fuori tlui separatore ed eluire 3 volte con 2 ml MACS tampone in un nuovo tubo da 50 ml.
- Spin a 200 xg per 5 min.
- Risospendere le cellule in 10 ml di FB media, contano le cellule e le sementi in piastre a giusta densità. Per fibroblasti generati dal metodo di coltura espianto, la semina di cellule densità potrebbe essere circa 2-3 x 10 4 cellule / pozzetto di 24 pozzetti. Per fibroblasti generati dal metodo di digestione enzimatica, la densità di cellule potrebbe essere di circa 4-5 x 10 4 cellule / pozzetto di 24 pozzetti.
3. Generazione di Retrovirus per ICM Riprogrammazione
Nota: Effettuare le seguenti operazioni in un BSL2 Cappa di sicurezza biologica in condizioni sterili. Il corretto smaltimento delle cellule transfettate, puntali e tubi si consiglia di evitare il rischio di rischi ambientali e per la salute.
- Mantenere le cellule Plat-E a Plat-E multimediale integrato con 1 mg / ml puromicina e 10 ug / ml blasticidin a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Il giorno 2, sostituire il mezzo con Plat-E terreno di coltura privo di puromicina e blasticidin.
- Il giorno 0, dividere le celle Plat-E in 10 cm piatti del giorno prima trasfezione a circa 4-5 x 10 6 cellule per piastra. Le cellule devono essere ~ 80-90% confluenti il giorno della trasfezione.
- Il giorno 1, il cambiamento culturale dei media ai media di trasfezione su cellule entro 1 ora prima della trasfezione. Trasfezione procedimento è il seguente:
- Trasfezione utilizzando kit commerciali
- Mescolare 20 ml di reagente di trasfezione (ad esempio Lipofectamine) e 500 microlitri mezzi siero ridotto (ad esempio, Opti-MEM). Aggiungere 10 ug del plasmide retrovirale per altri 500 microlitri ridotte supporti siero. Incubare ogni miscela a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
- Aggiungere lentamente il composto plasmide di miscela di trasfezione. Questo passaggio potrebbe richiedere 15-30 secondi. Incubare la miscela per 20 minuti a temperatura ambiente (soluzione può apparire torbida). Aggiungete il composto goccia a goccia per le cellule.
- Incubare per una notte in un incubatore a 37 °.
- Trasfezione con fosfato di calcio.
- Mescolare 40 ml 2.5 M CaCl 2 e 440 ml DDH 2 O, quindi aggiungere 20 mg del plasmide retrovirale (regolare la quantità di DDH 2 O in modo che il volume totale è di 500 microlitri).
- Aggiungere 500 microlitri 2x HBS in una provetta da 15 ml.
- Vortex la HBS e nel frattempo aggiungere la miscela Calcio-DNA alla HBS cadere saggio. Questa fase dura circa 30 secondi per ogni campione. Quindi al massimo fare 3-4 campioni contemporaneamente.
- Incubare a temperatura ambiente per 3 minuti di incubazione per più tempo porta a grandi precipitato e meno cellule assumerà il precipitato.
- Aggiungere il composto cadere saggio alle cellule e osservare sotto 20X microscopio. Precipitati fini (un sacco di piccoli sono buone, ma pochi grandi non sono buone) dovrebbe essere visto.
- Incubare una notte a 37 ° C incubatore.
- Il giorno 2, cambiare media su cellule con 8 ml preriscaldata coltura. Incubare per 24 ore.
- Il giorno 3 e il giorno 4, raccogliere coltura supernatante dai piatti utilizzando una siringa monouso 10 ml sterile, filtrandola attraverso un filtro di acetato di cellulosa dimensioni 0,45 micron pori, e il trasferimento in un tubo da 50 ml. Aggiungere 2 ml di soluzione retrovirus precipitazioni per ogni 8 ml contenente il virus surnatante. Mescolare delicatamente e incubare una notte a 4 ° C.
- Il giorno 5, girare la miscela virale a 1.500 xg a 4 ° C per 30 min. Le particelle virali dovrebbero apparire in pellet bianco sul fondo della provetta.
- Scartare il surnatante. Spin down soluzione residua mediante centrifugazione a 1500 xg per 5 min. Eliminare tutte le tracce di liquido per aspirazione, facendo molta attenzione a non disturbare le particelle retrovirali precipitati in pellet.
- Risospendere pellet retrovirali con 100 microlitri di buffer DPBS per ogni 8 ml surnatante virale. Aliquotail virus su ghiaccio. Utilizzare immediatamente o conservare a -80 ° C.
4. La riprogrammazione dei fibroblasti cardiaci
- Aggiungere 4 ml di 10 mg / ml soluzione polibrene nel Icm medio di 10 ml, e mescolare delicatamente pipettando su e giù. La concentrazione finale di polibrene è 4 mg / ml.
- Aggiungere 500 microlitri mezzi ICM contenente polibrene a ciascun pozzetto di 24 pozzetti seminato con fibroblasti.
- Aggiungere 10 microlitri retrovirus a ciascun pozzetto contenente sia 2-3 x 10 4 cellule della cultura espianto o 4-5 x 10 4 cellule da metodo digestione enzimatica. La quantità di virus deve essere aumentato proporzionalmente con l'aumento del numero di cellule in diverse piastre di coltura o piatti. Mettere la piastra a 37 ° C per 24-48 hr incubatore per consentire l'infezione virale. La linea di tempo per la riprogrammazione cardiaca è mostrato in Figura 1.
- Dopo trasduzione virale, sostituire il virus contenente media con 500 microlitri mezzi regolare ICM.
- Modificare i media ogni 2-3 giorni. Per la selezione positiva delle cellule trasdotte virali, aggiungere media ICM integrato con puromicina a 2 mg / ml alle cellule bersaglio. Keep it per tre giorni. Dopo di che, mantenere puromicina nel mezzo ICM alla concentrazione di 1 mg / ml.
- Tre giorni dopo l'infezione virale, prendere la targa fuori dalla incubatrice e posizionarlo sotto un microscopio a fluorescenza invertito (20X) per osservare l'espressione della GFP.
Nota: Dieci giorni dopo l'infezione virale, le cellule possono essere raccolte per l'analisi FACS e analisi ICC per determinare l'efficienza riprogrammazione (nel passaggio 5 e 6). - Quattordici giorni dopo l'infezione virale, sostituire ICM media con i media B27. Modificare i media ogni tre giorni. Spontaneo pestaggio loci cella può apparire da tre (cellule da metodo di digestione enzimatica) o quattro (cellule da espianto metodo cultura) settimane dopo la trasduzione virale.
5. Analisi immunocitochimica di efficienza Riprogrammazione
- Cellule risciacquocon ghiaccio PBS freddo per tre volte; rimuovere la soluzione in eccesso.
- Aggiungere 0,5 ml di tampone di fissaggio ICC a ciascun pozzetto di piastre da 24 pozzetti. Fissare le cellule a temperatura ambiente per 15-20 minuti.
- Risciacquare le cellule con PBS per tre volte.
- Aggiungere 0,5 ml di buffer permeabilizzazione ICC a ciascun pozzetto di piastre da 24 pozzetti. Permeabilize le cellule a temperatura ambiente per 15 min.
- Risciacquare le cellule con PBS per tre volte.
- Aggiungere 0,5 ml ICC tampone di bloccaggio in ciascun pozzetto di 24 pozzetti, incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Anticorpi primari diluiti con tampone colorazione ICC. Aggiungere 200 ml di soluzioni di anticorpi a ogni pozzetto e incubare una notte a 4 ° C. I fattori di diluizione anticorpo sono elencati in Materiali.
- Il giorno dopo, lavare le cellule con PBS per tre volte.
- Aggiungere 200 microlitri di soluzioni di anticorpi secondari alle cellule e incubare per 1 ora a RT nel buio.
- Lavare le cellule con PBS per tre volte.
- Aggiungere 150 ml soluzione contenente DAPI in ogni pozzetto di montaggio. Lasciare macchia nuclei per 1 min. Poicoprire ogni pozzetto con copertura in vetro rotondo slittamento e premere delicatamente la polizza contro la superficie inferiore con una pinza per rimuovere le bolle d'aria.
- Aspirare la soluzione in eccesso ed i campioni sono pronti per l'imaging. Le immagini rappresentative che mostrano le cellule riprogrammate che esprimono marcatore cardiaco cTnT e αActinin a d14 sono mostrati in figura 2B.
6. Analisi FACS di Riprogrammazione Efficienza
- Lavare accuratamente le cellule una volta con DPBS. Aggiungere 0,3 ml di tripsina (0,05%) a ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per 5 min.
- Battere delicatamente la piastra per facilitare il sollevamento delle cellule. Controllare il distacco delle cellule sotto il microscopio. Aggiungere 1 ml di FACS tampone di quando la maggior parte delle cellule sono dissociate. Pipetta su e giù per dissociare ulteriormente meccanicamente le cellule.
- Trasferire le cellule nella piastra 24 pozzetti ad una piastra ben pozzo profondo 96 pozzo a pozzo. Spin a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C per raccogliere le cellule.
- Lavare le cellule una volta conBuffer di FACS.
- Aggiungere 100 ml di soluzioni di fissaggio / permeabilizzazione per risospendere le cellule per 20 minuti a 4 ° C.
- Lavare le cellule due volte con soluzione di lavaggio 1x, pellet, e rimuovere il surnatante.
- Preparare la soluzione anticorpo primario contro GFP e cTnT in tampone di lavaggio 1x. Risospendere accuratamente ciascun campione con soluzione di anticorpi 50 microlitri e incubare a 4 ° C per 30 min.
- Lavare le cellule una volta nella soluzione di lavaggio 1x, pellet, e rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 50 ml soluzione di anticorpo secondario contenente Alexa Fluor IgG anti-coniglio 488 asino coniugato e Alexa Fluor 647 asino coniugato anti-topo IgG per ogni campione. Incubare a 4 ° C per 30 minuti in scuro.
- Lavare le cellule una volta nella soluzione di lavaggio 1x, pellet, e rimuovere il surnatante.
- Risospendere le cellule in 400 microlitri di buffer di fissazione (DPBS con 1% PFA). Trasferimento delle cellule in provetta FACS con tappo colino cella. I campioni sono pronti per il rilevamento di FACS. Il rappresentante analisi FACS di riprogrammazione efficiency utilizzando pMxs-puromicina-MGT costrutto con o senza selezione puromicina è mostrato in Figura 2A.
- Trasfezione utilizzando kit commerciali
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Representative Results
Le fasi di riprogrammazione sono riassunti da schema in figura 1. Dopo MGT trasduzione, l'espressione della GFP in riprogrammazione delle cellule potrebbe essere rilevato fin dal giorno 3. puromicina selezione di cellule trasdotte parte da giorno 3 e viene mantenuta durante le prime due settimane se PMX-puro è usato costrutto -MGT. Di giorno 10 al giorno 14, espressione di marcatori cardiaci come cTnT e αActinin potrebbe essere rilevato da entrambi ICC (Figura 2B, punto 5) e FACS (Figura 2A, punto 6), che indica che i fibroblasti di partenza stanno subendo riprogrammazione verso una cellula cardiaca destino.
Figura 1:. Rappresentazione schematica del processo di riprogrammazione cardiaco diretto Procedure in ogni punto sono descritte in scatole nere. Terreni di coltura per ogni fase sono mostrati in caselle colorate sotto il tempolinea.
Figura 2: Riprogrammazione efficienza valutati da FACS e ICC (A) FACS analisi su ICMS generate dai fibroblasti appena isolate a giorno 10 dopo MGT trasduzione.. (B) La colorazione di ICMS a 2 settimane con αMHC-GFP, cTnT cardiaco, e αActinin con DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole). Scala bar: 200 micron
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Discussion
Per il successo generazione ICM quando si utilizza questo protocollo, ci sono diversi fattori importanti che hanno un impatto sull'efficienza complessiva. In particolare le condizioni di fibroblasti di partenza e la qualità di codifica retrovirus MGT possono influenzare notevolmente l'efficienza riprogrammazione.
È importante generare fibroblasti fresco e sano possibile. Per espianto metodo di coltura, i fibroblasti possono essere utilizzati prima di sette giorni dopo gli espianti sono stati piastrati su piatti. Per il metodo di digestione enzimatica, fibroblasti possono essere utilizzati fin dal giorno successivo di isolamento. Il congelamento o passaging i fibroblasti di riprogrammazione non è raccomandato. Questi trattamenti supplementari di fibroblasti diminuiranno significativamente l'efficienza riprogrammazione. La densità di semina è un altro fattore importante che influisce sull'efficienza riprogrammazione. Se le cellule sono poco seminati, tendono a diventare malsano con morfologia cellulare irregolare e in grandi dimensioni. Raramente coULD queste cellule essere convertiti in ICMS. Se le cellule vengono seminate troppo densamente, il MOI (molteplicità di infezione) per infezione virale è diminuita. Crescita eccessiva di fibroblasti non infetti diluisce in modo significativo gli eventi di riprogrammazione con il risultato di una bassa percentuale di ICMS. Notiamo anche l'emergere di celle più piccole in ciottoli simile morfologia se più cellule vengono seminate per la riprogrammazione. Essi potevano certo essere riprogrammate e quindi comporta una ridotta efficacia di riprogrammazione. Quando si modifica il protocollo per diverse dimensioni di piastre di coltura tissutale, si raccomanda che il numero di cellule semina essere regolata proporzionalmente alla superficie del piatto cultura.
La purezza dei fibroblasti è critica per la riprogrammazione. L'elevata purezza dei fibroblasti potrebbe essere raggiunto mediante FACS ordinamento 15 o MACS arricchimento come abbiamo descritto qui. Rispetto al FACS ordinamento, MACS ordinamento è più facile, più dolce, e più conveniente. Purezza delle cellule dopo MACS potrebbe raggiungere oltre il 90% wgallina rigorosamente seguendo il protocollo. Bassa purezza dei fibroblasti può diminuire l'efficienza riprogrammazione poiché le cellule contaminate sono più difficili da riprogrammare di fibroblasti e che proliferano molto più veloce di riprogrammazione delle cellule. E 'anche altamente raccomandato di seminare le cellule subito dopo MACS ed eseguire infezione virale durante la notte dopo la semina. I fibroblasti filtrate possono diventare parzialmente senescente dopo la crescita in piatto per un lungo tempo, che diminuisce l'assorbimento del retrovirus che infetta solo le cellule proliferanti. Fibroblasti Coda-tip (TTFs) e fibroblasti embrionali (MEF) sono stati segnalati per essere convertito in ICMS con alcuni altri fattori di trascrizione 10,12,19,26. Il nostro protocollo si concentra qui solo su fibroblasti cardiaci. L'applicazione di questo protocollo ad altri tipi di fibroblasti può essere ulteriormente ottimizzata a causa delle variazioni intrinseche delle firme fibroblasti quali lo stato di proliferazione, punti di riferimento epigenetiche e genetiche.
The qualità di retrovirus per la trasduzione è della massima importanza. Virus basso titolo non riescono a convertire i fibroblasti in ICMS. Mentre i virus in quantità eccessiva causeranno citotossicità che porta direttamente a fibroblasti morte cellulare. È necessario determinare il titolo virale e ottimizzare il dosaggio virale per riprogrammare basato su laboratorio set-up e condizioni sperimentali. Il metodo per la titolazione virale è stato accuratamente descritto in precedenza 23. In realtà abbiamo scoperto che la condizione crescita delle cellule Plat-E si riferisce direttamente alla qualità virale. Si consiglia di scongelare le cellule Plat-E al passaggio inferiore (<30) ogni volta. Le cellule ottenute al passaggio tre sono i migliori per il virus di imballaggio ad una densità circa 4-5 x 10 6 cellule per 10 centimetri piatto di coltura. Inoltre, i virus appena raccolte producono maggiore efficienza riprogrammazione dei virus congelati. Si prega di notare che la co-infezione da virus MGT con un altro vettore basato pMxs retrovirus si riduce la possibi efficienza riprogrammazionely dovuto alla competizione tra i due virus dello stesso tipo. Due diversi metodi di trasfezione sono forniti qui. Entrambi i metodi producono retrovirus comparabili. Mentre Lipofectamine commerciale è costoso, ma stabile, trasfezione con fosfato di calcio è più conveniente. Preparazione di tampone HBS ha bisogno di fare molta attenzione perché il pH del tampone HBS influenza in modo significativo l'efficienza di trasfezione.
Ci sono alcune limitazioni di questo protocollo, che devono essere affrontate. Una delle limitazioni risiede nell'uso dei retrovirus, che rende inevitabilmente problemi biosicurezza. L'eterogeneità dei fibroblasti e la mancanza di marker specifico fibroblasti cardiaco per isolamento influenzano anche la purezza di cellule che sono riprogrammabile. Variazione di efficienza riprogrammazione può osservare a causa della variabilità dei lotti inerente alla condizione di fibroblasti e produzione di virus. Inoltre, anche se le cellule riprogrammate esprimono sarcomero proteine strutturali, come la troponina cardiaca Te αActinin, non sono ancora maturi cardiomiociti caratterizzate da proprietà funzionali come la contrattilità e la propagazione elettrica.
In sintesi, la metodologia qui descritta permette la generazione efficiente di ICMS basati sulla consegna retrovirale di fattori di trascrizione M, G, T in un singolo costrutto. Il nostro protocollo prevede una piattaforma riproducibile e importante per la ricerca ICM, e faciliterà gli sforzi in corso per high-throughput screening e studi meccanicistici di ICM riprogrammazione, e, infine, spostare campo riprogrammazione ICM più vicino alle applicazioni cliniche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-cardiac troponin T | Thermo Scientific | MS-295-PO | 1:200 for FACS and 1:400 for ICC |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | 1:500 for both FACS and ICC |
| anti- aActinin | Sigma-Aldrich | A7811 | 1:500 for both FACS and ICC |
| anti-Connexin43 | Sigma-Aldrich | C6219 | 1:500 for ICC |
| anit-Mef2c | Abcam | ab64644 | 1:1,000 for ICC |
| anti-Gata4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1237 | 1:200 for ICC |
| anti-Tbx5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17866 | 1:200 for ICC |
| Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-545-152 | 1:500 for both FACS and ICC |
| Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 715-605-150 | 1:500 for both FACS and ICC |
| Cytofix/Cytoperm kit for intracellular staining | BD Biosciences | 554722 | |
| Rhod-3 Calcium Imaging Kit | Life Technologies | R10145 | |
| Thy1.2 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | |
| Vectashield solution with DAPI | Vector labs | H-1500 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F-2442 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052 | |
| PRMI1640 medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| IMDM | Life Technologies | 12440-053 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| M199 medium | Life Technologies | 10-060 | |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin | Corning | 30-002 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11130-050 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668500 | |
| blasticidin | Life Technologies | A11139-03 | |
| puromycin | Life Technologies | A11138-03 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | BP358-212 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | PX1405 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | 9048-46-8 | |
| paraformaldehyde | EMS | 15714 | |
| Retrovirus Precipitation Solution | ALSTEM | VC-200 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Corning | 21022 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 0.45 μm cellulose acetate filter | Thermo Scientific | 190-2545 | |
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Thermo Scientific | 172958 | |
| 60 mm center well culture dish | Corning | 3260 | |
| 96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well Plate | Denville Scientific | P9639 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Vortexer MINI | VWR | 58816-121 | |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System | Life Technologies | AMAFD1000 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Round glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 72195-15 |
References
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