Abstract
Direkte Umwandlung von kardialen Fibroblasten (CFS) in Kardiomyozyten induziert (ICMS) birgt ein großes Potential für die regenerative Medizin, indem sie alternative Strategien für die Behandlung von Herzkrankheiten. Diese Umwandlung wurde durch erzwungene Expression von definierten Faktoren wie Gata4 (G), Mef2c (M) und Tbx5 (T) erreicht ist. Traditionell ICMS werden von einem Cocktail von Viren, die diese individuellen Faktoren generiert. Reprogrammierung Effizienz ist jedoch relativ gering und die meisten der in vitro G, M, T-transduzierten Fibroblasten nicht zu voll umprogrammiert, so dass es schwierig ist, die Umprogrammierung Mechanismen zu studieren. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Stöchiometrie der G, M, T ist entscheidend für die effiziente iCM Neuprogrammierung. Eine optimale Stöchiometrie von G, M, T mit relativ hohen und niedrigen Pegeln M von G und T durch unseren polycistronischen MGT-Vektor (im Folgenden als MGT bezeichnet) deutlich erhöht Umprogrammierung Effizienz erzielt und eine verbesserte Qualität iCM in vitro. Hier stellen wir eine detaillierte Beschreibung der Methode, nach der ICMS mit MGT Konstrukt von kardialen Fibroblasten zu generieren. Isolierung von kardialen Fibroblasten, Generation von Virus zur Neuprogrammierung und Bewertung der Umprogrammierung sind ebenfalls enthalten, um eine Plattform für die effiziente und reproduzierbare Erzeugung von ICMS bereitzustellen.
Protocol
Die hier vorgestellte Protokoll verwendet neugeborenen Mäusen. Tierpflege und Experimente werden in Übereinstimmung mit den von der Abteilung für Labortiermedizin (DLAM) an der University of North Carolina, Chapel Hill festgelegten Richtlinien durchgeführt.
1. Herstellung von Puffern und Medien
- Bereiten Fibroblasten (FB) Medium: Nachtrag 500 ml IMDM Medium mit 100 ml fötalem Rinderserum (FBS) und 6 ml Penicillin / Streptomycin.
- Bereiten iCM Medium: Nachtrag 400 ml DMEM-Medium mit 100 ml M199 Medien und 50 ml FBS.
- Bereiten B27 Medium: Nachtrag 490 ml RPMI1640 Medium mit 10 ml B27 Medien.
- Bereiten Plat-E Kulturmedium: Nachtrag 500 ml DMEM-Medium mit 50 ml FBS, 5 ml Penicillin / Streptomycin und 5 ml Nicht-essentiellen Aminosäuren.
- Bereiten Plat-E Transfektionsmedium: Nachtrag 500 ml DMEM-Medium mit 50 ml FBS und 5 ml Nicht-essentiellen Aminosäuren.
- Prepare Gelatine beschichtete Platte mit 24 Vertiefungen: 0,5 ml 0,1% Gelatinelösung zu einer gut 24-Well-Platte, bei 37 ° C für mindestens 10 min und saugen rechts vor dem Gebrauch.
- Vorbereitung FACS Markierungspuffer: Beilage 500 ml DPBS mit 10 ml FBS, 2 ml EDTA (0.5 M), um eine Endkonzentration von 2 mM zu erreichen. Die Lösung durch ein 0,22 um Filter und bei 4 ° C.
- Vorbereitung MACS Sortierpuffer: Beilage 500 ml DPBS mit 2,5 g BSA und 2 ml EDTA (0.5 M), um eine Endkonzentration von 2 mM zu erreichen. Die Lösung durch ein 0,22 um Filter und bei 4 ° C.
- Vorbereitung 2x HBS-Puffer für die Transfektion: Zusätzliche 500 ml HEPES-Puffer (50 mM) mit 280 mM NaCl (8,1816 g), 10 mM KCl (0,37275 g), 1,5 mM Na 2 HPO 4 (0,10647 g), 12 mM Glucose (1,08096 g ). In etwa 650 & mgr; l 10 N NaOH auf pH-Wert auf 7,05 bis 7,12 anpassen. Man filtriert durch ein 0,22 um Porenfilter und bei 4 ° C.
- Bereiten 2,5 M CaCl 2 -Lösung zur Transfektion: Fügen 18,376 g CaCl 2 bis 50 ml ddH 2 O. Man filtriert durch ein 0,22 um Porenfilter und bei 4 ° C.
- Bereitet ICC (Immunzytochemie) Fixierungspuffer: 5 ml Paraformaldehyd (PFA, 32%) zu 35 ml DPBS, um eine Endkonzentration von 4% erreicht werden.
- Bereitet ICC Permeabilisierung Puffer: 0,1 ml Triton 100 ml DPBS, um eine Endkonzentration von 0,1% zu erreichen.
- Bereitet ICC Blockierungspuffer: 5 g Rinderserumalbumin (BSA) und 100 ml DPBS auf eine Endkonzentration von 5% zu erreichen.
- Bereitet ICC Färbepuffer: 1 g BSA auf 100 ml DPBS auf eine Endkonzentration von 1% zu erreichen.
2. Erzeugung von Neonatal Maus kardialen Fibroblasten
- Generieren kardialen Fibroblasten aus Explantatkultur Verfahren
- Sauber neonatalen & alpha; MHC-GFP transgenen Maus (P1 bis P2) mit 75% Ethanol. Schneiden Sie den Kopf mit einer sterilen Schere. Dann machen Sie einen horizontalen Schnitt von unter einem Achselhöhle zu den anderen. Verwenden Sie eine sterilestumpf und gebogenen Pinzette zu sezieren das Herz heraus und legen Sie sie in einem Brunnen der 24 Well-Platte mit eiskaltem PBS-Puffer.
- Alternativ Squeeze-out der Herzen nach dem horizontalen Schnitt.
- Überprüfen GFP-Expression in Herz von Fluoreszenzmikroskop. Da der GFP-Expression durch & alpha; MHC-Promotor, der ein herzspezifischen Promotor angetrieben wird, sollte der Kern aus transgenen Maus in grün 15, während der negative Herz dim jeden Fluoreszenz.
- Nehmen Sie 3-4 GFP positive Herzen in eine 60 mm-Center auch Kulturschale und zerkleinern sie in kleine Stücke von weniger als 1 mm 3 in der Größe von sterilen Schere und Pinzette.
- Zeigen 3-4 Hackfleisch Herzen in einer 10 cm Schüssel mit 2 ml FB Medien. Lassen Sie sich die Gewebe niederzulassen für 3 Stunden.
- Langsam 8 ml vorgewärmten FB Medien zu den Schalen mit Herzgewebe. Das Gewebe nicht stören für drei Tage.
- Ersetzen Sie die Medien alle drei Tage.
- Am Tag 7 aspiraß das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit DPBS. 3 ml 0,05% Trypsin zu jeder Platte und Digest bei 37 ° C für 5 min.
- 5 ml FB Medien Trypsin quenchen. Leicht lösen die Zellen mit einem Zellschaber. Pipettieren Sie die Medien auf und ab, um weiter mechanisch das Gewebe zu distanzieren.
- Sammeln Zellen und filtriert über 40 um Zellsiebe, um eine Kontamination von Herzgewebefragmente zu vermeiden und zu pelletieren dann die Zellen durch Zentrifugieren bei 200 xg für 5 min.
- Wash Zellen einmal mit MACS-Puffer und Zellen sind bereit für die Sortierung.
- Sauber neonatalen & alpha; MHC-GFP transgenen Maus (P1 bis P2) mit 75% Ethanol. Schneiden Sie den Kopf mit einer sterilen Schere. Dann machen Sie einen horizontalen Schnitt von unter einem Achselhöhle zu den anderen. Verwenden Sie eine sterilestumpf und gebogenen Pinzette zu sezieren das Herz heraus und legen Sie sie in einem Brunnen der 24 Well-Platte mit eiskaltem PBS-Puffer.
- Generieren kardialen Fibroblasten aus Enzymverdau Verfahren
- Ernte-GFP positive Herzen als 2.1.1. Übertragen Sie alle Herzen in einen 10 cm-Schale mit 10 ml eiskaltem DPBS.
- Squeeze Ventrikel mit einer sterilen Pinzette, um Blut zu entfernen und einmal gründlich mit eiskaltem DPBS.
- Schneiden Sie die Herzen frei von anderen Geweben und fettfrei sein.
- Cut jedes Herz in etwa 4 Stücke, die noch lose verbunden sind.
- Wenn weniger als 20 Herzen, zu übertragen, die Herzen in ein 15 ml konischen Rohr mit 8 ml warmes 0,05% Trypsin-EDTA, und bei 37 ° C für 15 min.
- Wenn es 20-30 Herzen, zu übertragen, die Herzen in ein 50 ml konisches Röhrchen mit 10 ml warmem 0,05% Trypsin-EDTA, und bei 37 ° C für 15 min.
- Entsorgen Sie die Trypsin und 5 ml (für weniger als 20 Herzen) oder 10 ml (20-30 Herzen) warme Typ II Kollagenase (0,5 mg / ml) in HBSS.
- Vortex die Röhre auf Vortexer für 1 min bei einer Geschwindigkeit Niveau um 4 bis 6 (wenn die Flüssigkeit nicht aufstehen, um den Deckel, so wird die Geschwindigkeit ist in Ordnung).
- Das Röhrchen bei 37 ° C Wasserbad für 3-5 min.
- Das Röhrchen vortexen für 1 min.
- Sediment für 1 min durch die Schwerkraft, bis die Gewebestücke niederzulassen, sammeln die Flüssigkeit in ein neues Röhrchen mit 5 ml kaltem FB Medium.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.6-2.2.10 3-5 mal.
- Kombinieren Sie all die Sammlungen durch Filtrieren durch 40 & mgr; m Zellsiebzur Einzelzellsuspension zu machen.
- Zentrifuge bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C.
- Die Zellen in 10 ml MACS-Puffer und Zentrifugieren bei 200 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
- Optional: Wenn es eine Menge von Blutzellen, resuspendieren Zellen mit 1 ml RBC-Lyse-Puffer (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 und 0,1 mM EDTA), auf Eis halten für 1 min, dann mit 10 ml MACS verdünnen Puffer und Zentrifugieren bei 200 xg für 5 min. Ein weiteres Mal mit MACS-Puffer waschen.
- Isolierung von Thy1.2 + Fibroblasten durch MACS (magnetic cell separation)
- Bestimmen Sie Anzahl lebensfähiger Zellen durch Trypanblau-Färbung.
- Nehmen Sie 10 ul Zellen aus 10 ml Zellsuspension in Schritt 2.2.14. Mischen Sie es mit 10 & mgr; l 0,4% Trypanblau-Lösung.
- Das Gemisch in einem Hämocytometer. Lassen Sie es für 3-5 Minuten stehen gelassen und dann umgehend prüft unter dem Mikroskop. Die toten Zellen sind in blau und lebensfähigen Zellen gefärbt sind ungefärbt.
- Bestimmen Sie Anzahl lebensfähiger Zellen durch Trypanblau-Färbung.
- Weniger als 1 x 10 7 Zellen Die Zellen werden mit 10 ul Thy1.2 Mikrokügelchen in 90 & mgr; l MACS-Puffer gekühlt. Fügen Sie mehr Perlen proportional, wenn es mehr als 1 × 10 7 Zellen. Gut mischen und inkubieren im Kühlschrank (2-8 ° C) für 30 Minuten.
- 10 ml MACS-Puffer und Spin-Proben bei 200 × g für 5 min; sofort abwaschen mit 10 ml MACS-Puffer und Zentrifuge wieder.
- Bringt Volumen auf 2 ml in MACS-Puffer.
- Up ein MACS Separator in Haube eingestellt. Legen Sie eine LS-Säule in den Separator. Eine 3 ml MACS zu dem Säulenpuffer, um sie äquilibrieren.
- Übergeben Sie die Zellsuspension durch die äquilibriert LS Spalte.
- 3 x waschen mit 2 ml MACS-Puffer jedes Mal.
- Nehmen Sie die Spalte LS off ter Separator und eluieren 3 mal mit 2 ml MACS in eine neue 50-ml-Tube zu puffern.
- Spin bei 200 × g für 5 min.
- Die Zellen in 10 ml FB Medien, zählen Sie die Zellen und Samen in Platten an geeigneten Dichte. Fibroblasten aus Explantatkultur Verfahren erzeugt wird, kann die Aussaat Zellen Dichte um 2-3 × 10 4 Zellen / Vertiefung Platte mit 24 Vertiefungen sein. Fibroblasten aus Enzymverdau Verfahren erzeugt wird, könnte die Zellen Dichte um 4-5 × 10 4 Zellen / Vertiefung Platte mit 24 Vertiefungen sein.
3. Erzeugung von Retrovirus für iCM Reprogrammierung
Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte in einem BSL2 Biologische Sicherheitswerkbank unter sterilen Bedingungen. Die ordnungsgemäße Entsorgung von transfizierten Zellen, Pipettenspitzen und Röhren wird empfohlen, um das Risiko von Umwelt- und Gesundheitsgefahren zu vermeiden.
- Aufrechtzuerhalten PLAT-E-Zellen in PLAT-E-Medium mit 1 & mgr; g / ml Puromycin und 10 ug / ml b ergänztlasticidin bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Am Tag 2, ersetzen Sie das Medium durch Plat-E Kulturmedium fehlt Puromycin und Blasticidin.
- Am Tag 0, aufgeteilt PLAT-E-Zellen, in 10-cm-Schalen am Tag vor der Transfektion auf etwa 4-5 x 10 6 Zellen pro Platte. Zellen sollten 80-90% konfluent waren am Tag der Transfektion werden ~.
- An Tag 1, ändern Nährmedien in Transfektionsmedium auf Zellen innerhalb 1 h vor der Transfektion. Transfektionsverfahren ist wie folgt:
- Transfektion mit kommerziellen Kits
- Mischungs 20 ul Transfektionsreagenz (zB Lipofectamin) und 500 & mgr; l reduziert Serum Medien (zB Opti-MEM). In 10 ug des retroviralen Plasmid, um weitere 500 & mgr; l Serum-Medien reduziert. Inkubieren jeder Mischung bei Raumtemperatur (RT) für 5 min.
- Langsam die Plasmid-Mischung auf Transfektionsgemisch. Dieser Schritt kann 15-30 Sekunden dauern. Inkubieren Sie die Mischung für 20 min bei RT (Lösung kann eine Trübung). In Mischung tropfenweise zu den Zellen.
- Beimpft und über Nacht in einem 37 ° C Inkubator.
- Transfektion mit Calciumphosphat.
- Mix 40 ul 2,5 M CaCl 2 und 440 & mgr; l ddH 2 O, dann fügen Sie 20 ug des retroviralen Plasmid (stellen Sie die Menge ddH 2 O, so dass Gesamtvolumen von 500 & mgr; l).
- Gib 500 ul 2x HBS zu einem 15 ml konischen Röhrchen.
- Mischen Sie den HBS und in der Zwischenzeit fügen die Calcium-DNA-Gemisch zu der HBS tropfenweise. Dieser Schritt dauert etwa 30 Sekunden für jede Probe. So maximal 3-4 Proben gleichzeitig zu tun.
- Inkubation bei RT für 3 min Inkubation für längere Zeit führt zu größeren Niederschlag und weniger Zellen nehmen den Niederschlag.
- In die Mischung tropfenweise zu den Zellen und beobachten unter 20X Mikroskop. Feine Ausscheidungen (viele kleine sind gut, aber ein paar Großen sind nicht gut) gesehen werden sollte.
- Inkubieren über Nacht bei 37 ° C Inkubator.
- Am Tag 2 ändern Medien auf Zellen mit 8 ml vorgewärmtem Kulturmedien. Inkubationszeit von 24 h.
- An Tag 3 und Tag 4, sammeln Kulturüberstand aus den Schalen unter Verwendung einer sterilen 10 ml-Einwegspritze, Filtrieren über eine 0,45 um Porengrße Celluloseacetat-Filter und Überführen in eine 50 ml Röhre. 2 ml Retrofällungslösung zu jedem 8 ml virushaltigen Überstands. Vorsichtig mischen und Inkubation über Nacht bei 4 ° C.
- Am Tag 5 zu drehen, die das virale Mischung bei 1.500 × g bei 4 ° C für 30 min. Die viralen Partikel sollten in weißes Pellet am Boden des Röhrchens angezeigt.
- Überstand verwerfen. Spin down Restlösung durch Zentrifugation bei 1.500 × g für 5 min. Entfernen Sie alle Spuren von Flüssigkeit durch Absaugen, wobei große Sorgfalt nicht, um die ausgefällten retrovirale Partikel in Pellet stören.
- Resuspendieren retroviralen Pellets mit 100 ul DPBS-Puffer für jeweils 8 ml Virusüberstand. Aliquotdas Virus auf Eis. Verwenden Sie sofort oder bei -80 ° C.
4. Reprogrammierung von kardialen Fibroblasten
- In 4 ul 10 mg / ml Polybren Lösung in den 10 ml iCM Medium und vorsichtig mischen durch Auf-und Abpipettieren. Die Endkonzentration von Polybren 4 ug / ml.
- Fügen Sie 500 ul iCM Medien, die Polybren zu jeder Vertiefung der 24-Well-Platte mit Fibroblasten beimpft.
- Zugabe von 10 & mgr; l-Retrovirus in jede Vertiefung, die entweder von 2-3 × 10 4 Zellen von Explantatkultur oder 4-5 x 10 4 Zellen von Enzym-Aufschlußverfahren. Die Virusmenge, sollte proportional zu einer erhöhten Zellzahl in verschiedenen Kulturschalen oder Schalen erhöht werden. Legen Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator für 24-48 h, um die Virusinfektion zu ermöglichen. Die Zeitlinie für die Herz Neuprogrammierung wird in Abbildung 1 gezeigt.
- Nach virale Transduktion, ersetzen Virus haltigen Medien mit 500 ul regelmäßigen iCM Medien.
- Ändern Medien alle 2-3 Tage. Für die positive Selektion von viralen transduzierten Zellen, fügen iCM Medien mit Puromycin ergänzt mit 2 ug / ml an die Zielzellen. Halten Sie es für drei Tage. Danach halten Puromycin im ICM-Medium bei einer Konzentration von 1 ug / ml.
- Drei Tage nach der Virusinfektion, nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und legen Sie sie unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop (20x), um die GFP-Expression zu beobachten.
Anmerkung: Zehn Tage nach der Virusinfektion, könnte Zellen für die FACS-Analyse und ICC-Analyse, um die Umprogrammierung Effizienz bestimmen geerntet werden (in Schritt 5 und 6). - Vierzehn Tage nach der Virusinfektion, ersetzen iCM Medien mit B27 Medien. Ändern Medien alle drei Tage. Spontane Schlagen Zell Loci kann aus drei (Zellen aus Enzym Verdauungsmethode) oder vier (Zellen aus Explantatkultur Methode) Wochen nach Virusübertragung angezeigt.
5. Immunzytochemische Analyse der Reprogrammierung Efficiency
- Rinse-Zellenmit eiskaltem PBS dreimal; Entfernen überschüssiger Lösung.
- 0,5 ml ICC Fixierungspuffer zu jeder Vertiefung der Platten mit 24 Vertiefungen. Befestigen Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 15-20 min.
- Spülen Zellen dreimal mit PBS.
- 0,5 ml ICC Permeabilisierung Puffer in jede Vertiefung der 24-Well-Platten. Permeabilisierung der Zellen bei RT für 15 min.
- Spülen Zellen dreimal mit PBS.
- 0,5 ml ICC Blocking-Puffer in jede Vertiefung der Platte mit 24 Vertiefungen, Inkubation bei RT für 1 h.
- Verdünnten primären Antikörper mit ICC Färbepuffer. Fügen Sie 200 ul Antikörperlösungen in jede Vertiefung beimpft und über Nacht bei 4 ° C. Die Antikörperverdünnungsfaktoren sind in Materialien aufgeführt.
- Am nächsten Tag, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
- Fügen Sie 200 ul sekundären Antikörperlösungen zu den Zellen und Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln.
- Wasche die Zellen mit PBS dreimal.
- Fügen Sie 150 ul Montagelösung, die DAPI in jede Vertiefung. Ermöglichen, Keime für 1 min färben. Dannauf jede Auftragsstelle runden Deckglas und drücken Sie vorsichtig den Schlupf gegen die Bodenfläche mit einer Pinzette, um Luftblasen zu entfernen.
- Absaugen überschüssige Lösung und die Proben sind bereit für Bildgebung. Die repräsentativen Bilder, welche die umprogrammiert Zellen, die zum Ausdruck bringen Herzmarker cTnT und αActinin bei d14 sind in 2B gezeigt.
6. FACS Analyse der Reprogrammierung Efficiency
- Gründlich waschen Zellen einmal mit DPBS. Zugabe von 0,3 ml Trypsin (0,05%) in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 5 min.
- Klopfen Sie leicht die Platte zu erleichtern, die Aufhebung der Zellen. Überprüfen Sie die Zellablösung unter Mikroskop. 1 ml FACS-Puffer in jede Vertiefung gegeben, wenn die meisten Zellen werden dissoziiert. Pipette nach oben und unten, um weiter mechanisch distanzieren die Zellen.
- Übertragen Sie Zellen in der 24-Well-Platte auf eine 96-Well Tiefbrunnenplatte auch gut. Schleudern bei 200 xg für 5 Minuten bei 4 ° C, um die Zellen zu sammeln.
- Wasche die Zellen einmal mitFACS-Puffer.
- 100 ul Fixierung / Permeabilisierung Lösungen um Zellen für 20 min bei 4 ° C zu suspendieren.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x Waschlösung, Pellet und Überstand zu entfernen.
- Bereiten primären Antikörperlösung gegen GFP und cTnT in 1x Waschpuffer. Jede Probe mit 50 ul Antikörper-Lösung gründlich resuspendieren und Inkubieren bei 4 ° C für 30 min.
- Waschen Sie die Zellen einmal in 1x Waschlösung, Pellet und Überstand zu entfernen.
- Zugabe von 50 & mgr; l sekundärem Antikörper enthaltenden Lösung Alexa Fluor 488 konjugiert Esel-Anti-Kaninchen-IgG und Alexa Fluor 647 konjugiert Esel-anti-Maus-IgG zu jeder Probe. Inkubieren bei 4 ° C für 30 Minuten im Dunkeln.
- Waschen Sie die Zellen einmal in 1x Waschlösung, Pellet und Überstand zu entfernen.
- Die Zellen in 400 ul Fixierungspuffer (DPBS mit 1% PFA). Bringen Zelle in FACS-Röhrchen mit Zellsieb Kappe. Die Proben sind bereit für die FACS-Detektion. Der Vertreter der FACS-Analyse von Umprogrammierung efficiency mit pMxs-Puromycin-MGT-Konstrukts mit oder ohne Puromycin-Selektion ist in 2A gezeigt.
- Transfektion mit kommerziellen Kits
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Representative Results
Die Umprogrammierung Schritte werden von schematischen in Figur 1 zusammengefasst. Nach MGT Transduktion, konnte die GFP-Expression in Zellen Umprogrammierung bereits an Tag 3. Puromycin-Selektion von transduzierten Zellen ab Tag 3 und wird während der ersten zwei Wochen aufrechterhalten erkannt werden, wenn pMX-puro -MGT Konstrukt verwendet. Von Tag 10 bis Tag 14 konnte die Expression von herzspezifische Marker wie cTnT und αActinin sowohl ICC (2B, Schritt 5) und FACS (2A, Schritt 6) detektiert werden, was anzeigt, dass die Ausgangs Fibroblasten durchlaufen Umprogrammierung zu einer Herzzelle Schicksal.
Abb. 1: Schematische Darstellung der direkten Herz Umprogrammierung Verfahren zu jedem Zeitpunkt in black boxes beschrieben. Kulturmedien für die einzelnen Phasen werden in farbigen Feldern unterhalb der Zeit gezeigt,Leitung.
Abbildung 2: Neuprogrammierung Effizienz durch FACS und ICC bewertet (A) FACS-Analyse auf ICMS von frisch isolierten Fibroblasten am Tag 10 nach der MGT Übertragung generiert.. (B) Färbung von ICMs von 2 Wochen mit & alpha; MHC-GFP, Herz cTnT und αActinin mit DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol). Maßstabsbalken: 200 & mgr;
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Discussion
Für erfolgreiche iCM Erzeugung bei der Verwendung dieses Protokoll gibt es mehrere wichtige Faktoren, die einen Einfluss auf den Gesamtwirkungsgrad zu haben. Insbesondere die Bedingungen für die Start Fibroblasten und die Qualität der Retrovirus-Codierung MGT kann großen Einfluss auf die Reprogrammierung Effizienz.
Es wichtig ist, Fibroblasten zu erzeugen, wie frisch und gesund wie möglich. Für Explantatkultur Verfahren können Fibroblasten verwendet werden, bevor sieben Tage nach der Explantate wurden auf Schalen plattiert werden. Enzymaufschlußverfahren können Fibroblasten bereits am nächsten Tag der Isolierung verwendet werden. Einfrieren oder Passagieren der Fibroblasten zur Neuprogrammierung wird nicht empfohlen. Diese zusätzlichen Behandlungen von Fibroblasten wird die Neuprogrammierung Effizienz deutlich zu verringern. Die Aussaatdichte ist ein weiterer wichtiger Faktor, der die Neuprogrammierung Leitung beeinträchtigt. Wenn Zellen sind spärlich gesäten, neigen sie ungesund mit unregelmäßiger Zellmorphologie und im Großformat zu werden. Selten CoULD diese Zellen in ICMS umgewandelt werden. Wenn Zellen zu dicht ausgesät wird der MOI (multiplicity of infection) für die virale Infektion verringert. Übermäßiges Wachstum von nicht-infizierten Fibroblasten deutlich verdünnt die Umprogrammierung Veranstaltungen was zu einem geringen Prozentsatz der ICMS. Wir merken auch die Entstehung von kleineren Zellen in Kopfsteinförmige Morphologie, wenn mehr Zellen zur Reprogrammierung ausgesät. Sie konnten es kaum neu programmiert werden und damit zu einer verminderten Umprogrammierung Effizienz führen. Bei einer Änderung des Protokolls für unterschiedliche Größe der Gewebekulturschalen, ist es empfehlenswert, dass der Aussaat Zellzahlen proportional zur Oberfläche der Kulturschale justiert werden.
Die Reinheit der Fibroblasten ist kritisch für eine Neuprogrammierung. Die hohe Reinheit des Fibroblasten könnte entweder durch FACS-Sortierung 15 oder MACS Anreicherung als wir hier beschrieben erreicht werden. Verglichen mit FACS-Sortierung ist MACS Sortierung zu erleichtern, sanftere und bequemer. Zellreinheit nach der MACS konnten mehr als 90% w erreichenHenne streng nach dem Protokoll. Mit niedriger Reinheit von Fibroblasten kann Umprogrammierung Wirkungsgrad verringern, weil die kontaminierten Zellen sind schwerer als Fibroblasten umprogrammiert werden und daß sie proliferieren viel schneller als die Neuprogrammierung Zellen. Es ist auch sehr zu empfehlen, um die Zellen direkt nach MACS Saatgut und durchzuführen, virale Infektion über Nacht nach der Aussaat. Die sortierten Fibroblasten kann teilweise nach der wachsenden in Schale für eine lange Zeit, die Aufnahme des Retrovirus, das nur die wuchernden Zellen infiziert verringert seneszenten zu werden. Schwanzspitze Fibroblasten (TTFs) und embryonalen Fibroblasten (MEFs) wurde berichtet, dass in ICMS mit einem anderen Transkriptionsfaktoren umgewandelt 10,12,19,26 werden. Unser Protokoll konzentriert sich hier nur auf kardialen Fibroblasten. Die Anwendung dieses Protokolls auf andere Fibroblasten-Typen kann außerdem aufgrund der inhärenten Variationen von Fibroblasten-Signaturen wie die Verbreitung Status, genetischen und epigenetischen Sehenswürdigkeiten optimiert werden.
The Qualität der Retrovirus zur Transduktion von größter Bedeutung ist. Niedrigem Titer Viren nicht zu Fibroblasten in ICMS konvertieren. Der Erwägung, dass Viren auf übermäßige Menge bewirkt, Zytotoxizität, die direkt führt zu Zelltod Fibroblasten. Es ist notwendig, den Virustiter um basierend auf Laboraufbau und Versuchsbedingungen Umprogrammierung zu bestimmen, und die Optimierung der viralen Dosis. Das Verfahren für die virale Titration wurde gründlich vor 23 beschrieben. In der Tat haben wir gefunden, daß die Wachstumsbedingung von PLAT-E-Zellen direkt betrifft virale Qualität. Es wird empfohlen, PLAT-E-Zellen im unteren Kanal (<30) jedesmal aufzutauen. Zellen bei Passage drei erhalten werden, sind am besten für Verpackungs Virus in einer Dichte etwa 4-5 x 10 6 Zellen pro 10 cm-Kulturschale. Zusätzlich werden die frisch geernteten Viren ergeben höhere Effizienz als Reprogrammierung eingefroren Viren. Bitte beachten Sie, dass die gleichzeitige Infektion von MGT-Virus mit einem anderen pMxs Vektor-basierte Retrovirus wird die Neuprogrammierung Effizienz possib verringernly aufgrund der Konkurrenz zwischen den beiden Viren des gleichen Typs. Hier sind zwei verschiedene Transfektionsmethoden zur Verfügung gestellt. Beide Methoden zu vergleichbaren Retrovirus. Während kommerzielle Lipofectamin ist teuer, aber stabil ist, ist die Transfektion mit Calciumphosphat billiger. Vorbereitung der HBS-Puffer muss große Vorsicht zu nehmen, weil der pH-Wert der HBS-Puffer die Transfektionseffizienz erheblich beeinträchtigt.
Es gibt einige Einschränkungen dieses Protokolls, die angegangen werden müssen. Eine der Beschränkungen liegt in der Verwendung von Retroviren, die zwangsläufig macht auf die biologische Sicherheit Probleme. Die Heterogenität der Fibroblasten und der Mangel an spezifischen kardialen Fibroblasten-Marker für die Isolierung auch Auswirkungen auf die Reinheit der Zellen, die umprogrammierbar sind. Variation der Umprogrammierung Effizienz kann auf Chargenvariabilität inhärent Fibroblasten-Zustand und die Virusproduktion beobachtet werden. Darüber hinaus, obwohl die umgewandelten Zellen exprimieren Sarkomerstruktur Proteine wie Troponin Tund αActinin, sind sie noch nicht ausgereift Kardiomyozyten gekennzeichnet durch funktionelle Eigenschaften wie zB die Kontraktilität und elektrische Ausbreitung.
Zusammenfassend ist die hier beschriebene Methode ermöglicht die effiziente Erzeugung von ICMs basierend auf retrovirale Abgabe von M, G, T-Transkriptionsfaktoren in einem einzelnen Konstrukt. Unser Protokoll liefert eine reproduzierbare und wertvolle Plattform für iCM Forschung, und die laufenden Bemühungen auf Hochdurchsatz-Screening und mechanistische Untersuchungen von iCM Umprogrammierung zu erleichtern und letztlich zu bewegen iCM Umprogrammierung Feld näher an die klinische Anwendung.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-cardiac troponin T | Thermo Scientific | MS-295-PO | 1:200 for FACS and 1:400 for ICC |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | 1:500 for both FACS and ICC |
| anti- aActinin | Sigma-Aldrich | A7811 | 1:500 for both FACS and ICC |
| anti-Connexin43 | Sigma-Aldrich | C6219 | 1:500 for ICC |
| anit-Mef2c | Abcam | ab64644 | 1:1,000 for ICC |
| anti-Gata4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1237 | 1:200 for ICC |
| anti-Tbx5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17866 | 1:200 for ICC |
| Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-545-152 | 1:500 for both FACS and ICC |
| Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 715-605-150 | 1:500 for both FACS and ICC |
| Cytofix/Cytoperm kit for intracellular staining | BD Biosciences | 554722 | |
| Rhod-3 Calcium Imaging Kit | Life Technologies | R10145 | |
| Thy1.2 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | |
| Vectashield solution with DAPI | Vector labs | H-1500 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F-2442 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052 | |
| PRMI1640 medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| IMDM | Life Technologies | 12440-053 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| M199 medium | Life Technologies | 10-060 | |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin | Corning | 30-002 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11130-050 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668500 | |
| blasticidin | Life Technologies | A11139-03 | |
| puromycin | Life Technologies | A11138-03 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | BP358-212 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | PX1405 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | 9048-46-8 | |
| paraformaldehyde | EMS | 15714 | |
| Retrovirus Precipitation Solution | ALSTEM | VC-200 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Corning | 21022 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 0.45 μm cellulose acetate filter | Thermo Scientific | 190-2545 | |
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Thermo Scientific | 172958 | |
| 60 mm center well culture dish | Corning | 3260 | |
| 96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well Plate | Denville Scientific | P9639 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Vortexer MINI | VWR | 58816-121 | |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System | Life Technologies | AMAFD1000 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Round glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 72195-15 |
References
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