Abstract
誘導された心筋細胞へ心臓線維芽細胞（CFS）の直接変換（ICMS）は、心臓病の治療のための代替戦略を提供することにより、再生医療のための大きな可能性を保持しています。この変換は、GATA4（G）、MEF2C（M）及びTBX5（T）として定義された要素の強制発現によって達成されています。伝統的には、ICMSは、これらの個々の因子を発現するウイルスの混合により生成されます。しかし、効率性を再プログラミングすることは比較的低く、 インビトロ G、M、T-形質導入線維芽細胞のほとんどは、それが困難な再プログラミングのメカニズムを研究すること、完全に再プログラムさになりません。我々は最近、G、Mの化学量論は、Tは、効率的なICMの再プログラミングのために重要であることを示しています。 M、我々のポリシストロンMGTベクトル（以下、MGTと呼ばれる）有意に増加した再プログラミング効率を使用することによって達成GとTの低レベルの相対的な高レベルのG、M、Tの最適な化学量論およびインビトロでの改善されたICMの品質。ここでは、心臓線維芽細胞からMGT構築物ICMSを生成するために使用される方法の詳細な説明を提供します。心臓線維芽細胞の単離、再プログラミングおよび再プログラミングのプロセスの評価のためのウイルスの生成はまた、ICMSの効率的かつ再現可能な生成のためのプラットフォームを提供するために含まれます。
Protocol
ここで説明するプロトコルは、新生児マウスを使用しています。動物のケアと実験は、ノースカロライナ大学チャペルヒルでの実験動物医学（DLAM）の部門によって確立されたガイドラインに従って行われています。
バッファとメディアの作製
- 線維芽細胞（FB）培地を準備します100ミリリットルウシ胎児血清（FBS）、6 mlのペニシリン/ストレプトマイシンを500ミリリットルのIMDM培地を補足。
- 100ミリリットルM199培地、50mlのFBSを400ミリリットルDMEM培地を補足：ICM媒体を準備します。
- B27培地を準備します10ミリリットルB27メディアと490ミリリットルRPMI1640培地を補足。
- Plat-Eの培養培地を調製：50mLのFBS、5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン、および5 mlの非必須アミノ酸と500 mlのDMEM培地サプリメント。
- ぷらっと-Eのトランスフェクション培地を準備します50ミリリットルのFBS、5mlの非必須アミノ酸と500ミリリットルDMEM培地を補足。
- PR右使用前に少なくとも10分を吸引するために、37℃でインキュベートし、24ウェルプレートのウェルに0.5ミリリットルの0.1％ゼラチン溶液を追加します。ゼラチンは、24ウェルプレートをコーティングしepare。
- FACS標識バッファーを準備します：最終濃度2mMに到達するために10ミリリットルFBSおよび2ミリリットルのEDTA（0.5 M）と500ミリリットルのDPBSを補足。 4℃で0.22μmフィルターとストアを介して渡します。
- バッファをMACS選別を準備し、最終濃度2mMに到達するために2.5グラムのBSAと2ミリリットルのEDTA（0.5 M）と500ミリリットルのDPBSを補足。 4℃で0.22μmフィルターとストアを介して渡します。
- トランスフェクションのために2倍HBSバッファーを準備します。サプリメント500ミリリットルHEPES緩衝液（50 mM）の280 mMの塩化ナトリウム（8.1816グラム）、10mMの塩化カリウム（0.37275グラム）、1.5mMのの Na 2 HPO 4（0.10647グ ラム）、12 mMのグルコース（1.08096グラムで）。 7.05から7.12へのpHを調整するために周りに650μlの10NのNaOHを追加します。 4℃で孔径0.22μmフィルターとストアを介してフィルタリングします。
- トランスフェクションのために、2.5MのCaCl 2溶液を調製：18.376グラムのCaを追加Cl 2の50ミリリットルののddH 2 O 4℃で孔径0.22μmフィルターとストアを介してフィルタリングします。
- ICC（免疫細胞化学）固定バッファを準備します。4％の最終濃度に到達するために35ミリリットルのDPBSに5ミリリットルパラホルムアルデヒド（PFA、32％）を追加します。
- ICCの透過性バッファーを準備します。0.1％の最終濃度に達するために100ミリリットルのDPBSに0.1ミリリットルトリトンを追加します。
- ICCは、ブロッキング緩衝液調製：5％の最終濃度に達するように100 mLのDPBSを5gのウシ血清アルブミン（BSA）を追加します。
- ICC染色緩衝液の調製：1％の最終濃度に達するように100 mLのDPBSに1gのBSAを加えます。
新生児マウスの心臓線維芽細胞の2世代
- 移植片培養法から心臓線維芽細胞の生成
- 75％エタノールで新生児αMHC-GFPトランスジェニックマウス（P2にP1）を清掃してください。滅菌はさみで頭をカット。そして、もう一方の脇の下の下から横切開を行います。滅菌を使用してください心を解剖し、氷冷PBS緩衝液を含む24ウェルプレートの1つのウェルに配置するための鈍屈曲鉗子。
- また、横切開後に心を絞り出します。
- 蛍光顕微鏡により心臓におけるGFP発現を確認してください。 GFP発現は、心臓特異的プロモーターであるαMHCプロモーターによって駆動されるため、負の心は任意の蛍光の薄暗いですが、トランスジェニックマウスからの心臓は、緑の15にする必要があります。
- 60ミリメートルセンターウェル培養皿に3-4 GFP陽性心を取ると、滅菌ハサミやピンセットによって小片サイズが1mm未満の3にそれらをミンチ。
- 2ミリリットルのFBメディアとの1 10cmの皿に3-4みじん切り心を置きます。組織は3時間落ち着くしてみましょう。
- ゆっくりと心臓組織を含む皿に8ミリリットル予め温めFBメディアを追加します。 3日間組織を邪魔しないでください。
- 3日ごとにメディアを交換してください。
- 7日目に、aspir培地を食べ、DPBSで細胞を洗浄します。各プレートに3 mlの0.05％トリプシンを添加し、5分間37℃で消化します。
- トリプシンをクエンチするために5ミリリットルのFBメディアを追加します。静かセルスクレーパーで細胞を剥離。メディアをピペットし、さらに機械的に組織を解離まで。
- 細胞を収集し、心臓組織片の汚染を避けるために40μmのセルストレーナーでろ過し、その後5分間200×gで回転させて細胞をペレット化。
- 洗浄細胞を一回MACS緩衝液と細胞とソートするための準備ができています。
- 75％エタノールで新生児αMHC-GFPトランスジェニックマウス（P2にP1）を清掃してください。滅菌はさみで頭をカット。そして、もう一方の脇の下の下から横切開を行います。滅菌を使用してください心を解剖し、氷冷PBS緩衝液を含む24ウェルプレートの1つのウェルに配置するための鈍屈曲鉗子。
- 酵素消化法から心臓線維芽細胞の生成
- 2.1.1として収穫GFP陽性心。 10ミリリットルの氷冷DPBSで10cmの皿にすべての心を転送します。
- 血液を除去し、氷冷DPBSで一度洗浄するために滅菌ピンセットで心室を絞ります。
- 他の組織および脂肪を含まないことが心をトリム。
- まだ緩やかに接続されているおよそ4個にそれぞれの心をカットします。
- 20未満の心は、8ミリリットル暖かい0.05％トリプシン-EDTAで15ミリリットルコニカルチューブに心を移し、37℃で15分間インキュベートした場合。
- 20-30心がある場合は、10 mlの暖かい0.05％トリプシン-EDTAで50 mlのコニカルチューブに心を移し、37℃で15分間インキュベートします。
- トリプシンを破棄し、HBSS中または（20-30ハート用）10ミリリットル暖かいII型コラゲナーゼ（0.5 mg / mlの）（20未満の心のために）5ミリリットルを追加します。
- 約4〜6速レベルで1分間ボルテックスにボルテックスチューブ（液体が蓋に立ち上がっていない場合は、速度は結構です）。
- 3-5分間37℃の水浴中でチューブをインキュベートします。
- 1分間チューブをボルテックス。
- 組織片が落ち着くまで、重力によって1分間の土砂は、5ミリリットルの冷FB培地を含む新しいチューブに液体を集めます。
- 繰り返し2.2.6-2.2.10 3〜5回繰り返します。
- 40μmのセルストレーナーを通して濾過することによりすべてのコレクションを結合単一細胞懸濁液を作製しました。
- 4℃で5分間、200×gで遠心分離します。
- 再懸濁し10ミリリットルMACS緩衝液中の細胞、および4℃で5分間、200×gで遠心します。
- オプション：1ミリリットルのRBC溶解バッファー（150mMのNH 4 Clを 、10 mMのKHCO 3、および0.1mMのEDTA）と血液細胞、細胞を再懸濁するのが多い場合は、10ミリリットルのMACSで希釈、1分間氷上で維持バッファと5分間200×gで遠心します。 MACS緩衝液で一回洗浄します。
- MACS（磁気活性化細胞選別）によりThy1.2 +線維芽細胞の単離
- トリパンブルー染色を介して生存細胞数を決定します。
- ステップ2.2.14で10ミリリットルの細胞懸濁液から10μlの細胞を取り出し。 10μlの0.4％トリパンブルー溶液でそれを混ぜます。
- 血球計数器に混合物を追加します。それは3-5分間放置した後、顕微鏡下ですぐに調べることができるようにします。青と生細胞に染色される死細胞を染色していないです。
- トリパンブルー染色を介して生存細胞数を決定します。
- 未満、1×10 7細胞では、90μlの10μlのThy1.2マイクロビーズで再懸濁細胞をMACS緩衝液を冷却します。以上、1×10 7個の細胞が存在する場合、比例以上のビーズを加えます。よく混合し、30分間冷蔵庫（2〜8℃）でインキュベートします。
- 5分間200×gで10 MACSバッファーミリリットルとスピンのサンプルを追加します。再び10mLのMACS緩衝液および遠心機で一回洗浄します。
- MACS緩衝液2 mlにボリュームを持参してください。
- フード内MACSセパレータを設定します。分離器にLSカラムを挿入します。 MACSはそれを平衡化するために列にバッファ3ミリリットルを適用します。
- 平衡化したLSカラムを介して細胞懸濁液を渡します。
- 毎回バッファ2ミリリットルのMACSで3回洗浄します。
- トンオフLSカラムを取ります彼セパレータおよびMACS、新しい50mlチューブに緩衝液2mlで3回溶出します。
- 5分間200×gでスピン。
- 10ミリリットルのFB培地で再懸濁細胞は、細胞をカウントし、適切な密度でプレートに播種します。移植片培養法から生成された線維芽細胞では、細胞を播種密度は約2〜3×10 4細胞/ウェルの24ウェルプレートである可能性があります。酵素消化法から生成された線維芽細胞では、細胞密度は約4-5×10 4細胞/ウェルの24ウェルプレートである可能性があります。
ICMの再プログラミングのためのレトロウイルスの3世代
注：無菌条件下でBSL2生物学的安全キャビネットで次の手順を実行します。トランスフェクションされた細胞、ピペットチップおよびチューブの適切な処分は、環境と健康の危険のリスクを回避することをお勧めします。
- 1μg/ mlのピューロマイシンおよび10μg/ mLのBを補充したのPlat-E培地でのPlat-E細胞を維持5％CO 2、37℃でlasticidin。
- 2日目に、ピューロマイシン、ブラストサイジンを欠くぷらっと-E培養培地により培地を交換してください。
- 0日目に、10センチの皿で約トランスフェクションの前日、プレート当たり4-5×10 6細胞へのPlat-E細胞を分割します。細胞は、トランスフェクションの日に〜80〜90％コンフルエントにする必要があります。
- 1日目に、トランスフェクション前に1時間内の細胞へのトランスフェクション培地に変更培養培地。次のようにトランスフェクション手順は次のとおりです。
- 市販のキットを使用してトランスフェクション
- 20μlのトランスフェクション試薬（例えばリポフェクタミン）と500μlの減少血清培地（例えば、のOpti-MEM）を混ぜます。血清培地を低減し、他の500μlにレトロウイルスプラスミド10μgのを追加します。 5分間室温（RT）での各混合物をインキュベートします。
- ゆっくりとトランスフェクション混合物へのプラスミドの混合物を追加します。このステップは、15〜30秒かかる場合があります。 （溶液が濁って見える場合があります）室温で20分間混合物をインキュベートします。 細胞に滴下混合降下を追加します。
- 37℃のインキュベーター中で一晩インキュベートします。
- リン酸カルシウムを使用してトランスフェクション。
- 40μlの2.5 MのCaCl 2および440μLのddH 2 Oを混合し、（総容量は500μlであるようにのddH 2 Oの量を調整）レトロウイルスプラスミド20μgのを追加します。
- 15ミリリットルコニカルチューブにHBS 2倍500μLを追加します。
- HBSの渦その間滴下HBSにカルシウム - DNA混合物を追加します。このステップは、各試料について、約30秒かかります。だから、最大限に同時に3-4のサンプルを実行します。
- 長い時間のために3分のインキュベーションを室温でインキュベートすると、大きな沈殿物を導き、より少ない細胞が沈殿物を取り上げます。
- 混合物を細胞に滴下し、20倍の顕微鏡で観察し追加します。微細な析出物は、（小さなものの多くは良いですが、いくつかの大規模なものが良いものではありません）見られるべきです。
- 37℃のインキュベーターで一晩インキュベートします。
- 2日目、8ミリリットル予め温め培養培地と細胞上のメディアを変更します。 24時間インキュベートします。
- 3日目および4日目に、0.45μmの細孔サイズの酢酸セルロースフィルターを介して濾過する、10 mlの滅菌使い捨て注射器を用いて、50 mlチューブに移すことにより皿から培養上清を収集します。すべての8ミリリットルウイルス含有上清にレトロウイルス沈殿溶液2mlを追加します。静かにそれを混合し、4℃で一晩インキュベートします。
- 5日目に、4℃で30分間1500×gでウイルスの混合物をスピン。ウイルス粒子は、チューブの底に白いペレットに表示されます。
- 上清を捨てます。 5分間1500×gで遠心分離することにより残存溶液をスピンダウン。ペレット中に沈殿したレトロウイルス粒子を乱さないように細心の注意を取って、吸引により流体の痕跡をすべて削除します。
- すべての8ミリリットルウイルス上清100μlのDPBS緩衝液を用いてレトロウイルスペレットを再懸濁します。一定分量氷の上のウイルス。すぐに使用するか、-80℃で保存します。
心臓線維芽細胞の再プログラミング4.
- 10 mlのICMの培地中に10 mg / mlのポリブレン溶液4μlを添加し、ピペッティングにより穏やかに混合します。ポリブレンの最終濃度は4 / mlのです。
- 線維芽細胞を播種した24ウェルプレートの各ウェルに500μlのICMのメディア含むポリブレンを追加します。
- 移植片培養や酵素消化法4から5×10 4個の細胞から各ウェルのいずれかを含む2〜3×10 4個の細胞に10μlのレトロウイルスを追加します。ウイルスの量は比例異なる培養プレートまたは皿で増加した細胞数を増加させるべきです。ウイルス感染を可能にするために24〜48時間、37℃のインキュベーターでプレートを置きます。心臓再プログラミングするためのタイムラインは 、図1に示されています。
- ウイルス形質導入後、500μlの定期的なICMのメディアでウイルス含有培地を交換してください。
- 2〜3日おきにメディアを変更します。ウイルス形質導入細胞の正の選択のために、細胞を標的とする2μgの/ mlのピューロマイシンを補充したICMのメディアを追加。三日間のためにそれを保管してください。その後、1μgの/ mlの濃度でICM培地中のピューロマイシンを維持します。
- 三日ウイルス感染後、インキュベーターからプレートを取り出し、GFPの発現を観察するために倒立蛍光顕微鏡（20X）下に置きます。
注：10日、ウイルス感染後、細胞は、（ステップ5および6）再プログラミング効率を決定するために、FACS分析およびICC分析のために回収することができます。 - 14日、ウイルス感染後、B27メディアとICMのメディアを交換してください。 3日ごとにメディアを変更します。自発拍動する細胞の遺伝子座は、3（酵素消化法から細胞）または4（移植片培養法から細胞）ウイルス形質導入後の数週間から表示されることがあります。
初期化の効率の5免疫細胞化学的解析
- 細胞をすすぎます氷冷PBSで3回。余分な溶液を除去します。
- 24ウェルプレートの各ウェルに0.5 mlのICC固定バッファに追加します。 15〜20分間室温で細胞を固定してください。
- PBSで細胞を3回洗浄します。
- 24ウェルプレートの各ウェルに0.5ミリリットルのICC透過性バッファーを追加します。室温で15分間、細胞を透過性。
- PBSで細胞を3回洗浄します。
- 室温で1時間インキュベートし、24ウェルプレートの各ウェルにブロッキングバッファー0.5ミリリットルICCを追加します。
- ICC染色緩衝液で希釈した一次抗体。それぞれに200μlの抗体溶液は十分に加え、4℃で一晩インキュベートします。抗体希釈倍率は、材料に記載されています。
- 翌日、PBSで3回細胞を洗浄します。
- 細胞に200μlの二次抗体溶液を加え、暗所で室温で1時間インキュベートします。
- 3回、PBSで細胞を洗浄します。
- 各ウェルにDAPIを含む溶液を取り付ける150μLを加えます。 1分間核を染色することを許可します。そして、丸いガラスカバースリップで各ウェルを覆い、静かに気泡を除去するために鉗子で底面に対してスリップを押してください。
- 過剰の溶液を吸引除去し、サンプルは、イメージングのための準備ができています。 D14で心臓マーカーcTnTのとαActininを表現再プログラムされた細胞を示す代表的な画像を図2Bに示されています。
初期化の効率の6 FACS分析
- 徹底的にDPBSで細胞を1回洗浄します。各ウェルに0.3 mlのトリプシン（0.05％）を添加し、5分間37℃でインキュベートします。
- 静かに細胞を持ち上げる容易にするためにプレートをタップします。顕微鏡下で細胞の剥離を確認してください。ほとんどの細胞が解離されている場合に、各ウェルに1ミリリットルFACSバッファを追加します。ピペットアップし、さらに機械的に細胞を解離させるためにダウン。
- ウェルに96ウェルディープウェルプレートに24ウェルプレート中の細胞を移します。細胞を収集する4℃で5分間、200×gでスピン。
- で細胞を1回洗浄しますFACS緩衝液。
- 4℃で20分間、細胞を再懸濁し、100μlの固定/透過処理ソリューションを追加します。
- 1×洗浄溶液、ペレットで細胞を2回洗浄し、上清を除去します。
- 1×洗浄緩衝液におけるGFPおよびcTnTのに対する一次抗体溶液を準備します。徹底的に50μlの抗体溶液を用いて、各サンプルを再懸濁し、4℃で30分間インキュベートします。
- 1×洗浄溶液、ペレット中で細胞を1回洗浄し、上清を除去します。
- 各サンプルにアレクサフルオロ488結合ロバ抗ウサギIgGおよびAlexaフルーア647結合ロバ抗マウスIgGを含有する50μlの二次抗体溶液を加えます。暗所で30分間、4℃でインキュベートします。
- 1×洗浄溶液、ペレット中で細胞を1回洗浄し、上清を除去します。
- 400μlの固定バッファー（1％PFAでDPBS）で細胞を再懸濁。セルストレーナーキャップでFACSチューブに細胞を移します。サンプルは、FACS検出のための準備ができています。再プログラミングefficiencの代表的なFACS分析pMxs-ピューロマイシンMGTを使用してyのピューロマイシン選択の有無にかかわらず構築を図2Aに示されています。
- 市販のキットを使用してトランスフェクション
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
再プログラミングステップは、MGTの導入後、細胞を再プログラミングにおけるGFP発現は、形質導入した細胞の3ピューロマイシン選択が3日目から始まり、PMX-puroの場合、最初の2週間の間、維持され、早ければ一日として検出することができた。 図1の模式によって要約されています-MGT構築物が使用されます。 14日目に10日目では、cTnTのとαActininなどの心臓マーカーの発現が開始線維芽細胞が心筋細胞に向かって再プログラミングを受けていることを示し、両方のICC（ 図2B、ステップ5）およびFACS（ 図2A、ステップ6）によって検出される可能性があります運命。
図1：各時点での直接の心臓再プログラミングプロセスの概略手順はブラックボックスに記載されています。各ステージの培養培地は時間以下の色のボックスに表示されていますライン。
図2：FACSおよびICCによって評価再プログラミング効率 MGTの形質導入後10日目に新鮮に単離された線維芽細胞から生成されたICMSの（A）、FACS分析。 （B）αMHC-GFPで2週間でICMSの染色、心臓cTnTの、及びDAPIとαActinin（4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）。スケールバー：200ミクロン
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルを使用するときに成功したICMの世代のために、全体的な効率に影響を与えるいくつかの重要な要因があります。特に繊維芽細胞を開始する条件及びレトロウイルスをコードするMGTの品質が大幅に再プログラミングの効率に影響を与えることができます。
それは可能な限り新鮮で健康的な線維芽細胞を生成することが重要です。外植片が皿上にプレーティングした後に外植片培養法では、線維芽細胞は、7日前に使用することができます。酵素消化法のために、線維芽細胞は、初期の単離の次の日として使用することができます。凍結や再プログラミングのための線維芽細胞を継代することはお勧めできません。線維芽細胞のこれらの追加の治療は大幅に初期化の効率が低下します。播種密度は、再プログラミングの効率に影響を与える別の重要な要因です。細胞がまばらに播種する場合、それらは、不規則な細胞形態を有すると大きなサイズの不健康になる傾向があります。めったに共同ませんULDこれらの細胞は、ICMSに変換されます。細胞があまりにも密に播種された場合、ウイルス感染のMOI（感染多重度）が低下します。感染していない線維芽細胞の過剰増殖が大幅ので、ICMSの割合が低い結果として再プログラミングイベントを希釈します。より多くの細胞が再プログラミングのために播種されている場合我々はまた、丸石様の形態が小さい細胞の出現に注意してください。彼らはほとんど再プログラムされていないため、縮小再プログラミング効率につながる可能性があります。組織培養皿の異なるサイズのためのプロトコルを変更する場合には、播種細胞数は、培養皿の表面積に比例して調整することをお勧めします。
線維芽細胞の純度は、再プログラミングのために重要です。私たちはここで説明するように、線維芽細胞の高純度は15またはMACS濃縮をFACSソーティングのいずれかを達成することができます。 FACS選別に比べて、MACSのソートは、簡単に穏やかな、そしてより便利です。 MACS後の細胞の純度は、90％wの上に達する可能性があります鶏は、厳密にプロトコルを以下に示します。汚染された細胞は、線維芽細胞よりも再プログラムすることが困難であるため、線維芽細胞の低純度は、初期化の効率が低下することがあり、それらは再プログラム細胞よりもはるかに速く増殖すること。また、非常に右MACS後に細胞をシードし、一晩播種後のウイルス感染を実行することをお勧めします。ソート線維芽細胞は、部分的にのみ増殖細胞に感染するレトロウイルスの取り込みを減少させ、長い時間のための皿の中で成長した後、老化になることがあります。テール先端繊維芽細胞（TTFを）および胚性線維芽細胞（MEFが）いくつかの他の転写が10,12,19,26因子とICMSに変換することが報告されています。私たちのプロトコルは、ここでの唯一の心臓線維芽細胞に焦点を当てています。他の線維芽細胞の型にこのプロトコルの適用はさらにこのような増殖の遺伝的状態、およびエピジェネティックなランドマークなどの線維芽細胞のシグネチャの固有の変動を最適化することができます。
目形質導入のためのレトロウイルスのE品質が最も重要です。低力価のウイルスは、ICMSに線維芽細胞を変換することができません。一方、過剰な量でウイルスが直接細胞死を線維芽細胞につながる細胞毒性の原因となります。これは、ウイルス力価を決定し、実験室の設定および実験条件に基づいて、再プログラミングのためのウイルスの投与量を最適化する必要があります。ウイルスの力価測定のための方法は、完全に23の前に記載されています。実際に、我々は、のPlat-E細胞の成長条件は、直接ウイルス品質に関係することを見出しました。これは、下の通路（<30）は、各時点でのPlat-E細胞を解凍することをお勧めします。継代3で得られた細胞を、10cmの培養皿あたり約4〜5×10 6個の細胞密度でパッケージングウイルスのために最適です。さらに、新たに採取したウイルスは、凍結されたウイルスよりも高い初期化の効率が得られます。再プログラミング効率possibを低下させる別のpMxsベクトルベースのレトロウイルスとMGTウイルスの同時感染に注意してください。同じタイプの2つのウイルス間の競争によるLY。二つの異なるトランスフェクション法は、ここで提供されています。どちらの方法でも、同等のレトロウイルスを生産します。商業リポフェクタミンはコストがかかるが、安定しているが、リン酸カルシウムを用いたトランスフェクションは安いです。 HBSバッファーの調製は、HBS緩衝液のpHが大幅にトランスフェクション効率に影響を与えるため、十分な注意を取る必要があります。
対処する必要があり、このプロトコルのいくつかの制限があります。制限の1つは、必然的にバイオセーフティの問題にレンダリングするレトロウイルスの使用、です。線維芽細胞の不均一性と分離のための具体的な心臓線維芽細胞マーカーの欠如はまた、再プログラム可能である細胞の純度に影響を与えます。再プログラミング効率の変動は、線維芽細胞の状態及びウイルス産生に固有のバッチ変動を観察することができます。加えて、再プログラミングされた細胞は、心臓トロポニンTとしてサルコメア構造タンパク質を発現するもののそして、αActininは、彼らはまだそのような収縮性および電気的伝播などの機能特性を特徴とする心筋細胞を成熟されていません。
要約すると、ここで説明する方法は、単一の構築物では、M、G、Tの転写因子のレトロウイルス配信に基づいてICMSの効率的な生成を可能にします。私たちのプロトコルは、ICM研究の再現性と価値のあるプラットフォームを提供し、ハイスループットスクリーニングの継続的な努力とICMの再プログラミングのメカニズムの研究を促進し、最終的に近い臨床応用へのICMの再プログラミングのフィールドを移動します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-cardiac troponin T | Thermo Scientific | MS-295-PO | 1:200 for FACS and 1:400 for ICC |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | 1:500 for both FACS and ICC |
| anti- aActinin | Sigma-Aldrich | A7811 | 1:500 for both FACS and ICC |
| anti-Connexin43 | Sigma-Aldrich | C6219 | 1:500 for ICC |
| anit-Mef2c | Abcam | ab64644 | 1:1,000 for ICC |
| anti-Gata4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1237 | 1:200 for ICC |
| anti-Tbx5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17866 | 1:200 for ICC |
| Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-545-152 | 1:500 for both FACS and ICC |
| Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 715-605-150 | 1:500 for both FACS and ICC |
| Cytofix/Cytoperm kit for intracellular staining | BD Biosciences | 554722 | |
| Rhod-3 Calcium Imaging Kit | Life Technologies | R10145 | |
| Thy1.2 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | |
| Vectashield solution with DAPI | Vector labs | H-1500 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F-2442 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052 | |
| PRMI1640 medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| IMDM | Life Technologies | 12440-053 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| M199 medium | Life Technologies | 10-060 | |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin | Corning | 30-002 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11130-050 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668500 | |
| blasticidin | Life Technologies | A11139-03 | |
| puromycin | Life Technologies | A11138-03 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | BP358-212 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | PX1405 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | 9048-46-8 | |
| paraformaldehyde | EMS | 15714 | |
| Retrovirus Precipitation Solution | ALSTEM | VC-200 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Corning | 21022 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 0.45 μm cellulose acetate filter | Thermo Scientific | 190-2545 | |
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Thermo Scientific | 172958 | |
| 60 mm center well culture dish | Corning | 3260 | |
| 96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well Plate | Denville Scientific | P9639 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Vortexer MINI | VWR | 58816-121 | |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System | Life Technologies | AMAFD1000 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Round glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 72195-15 |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2014).
- Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
- Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
- Choi, W. Y., Poss, K. D.
- Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A.
- Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
- Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
- Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
- Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
- Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577 (2013).
- Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
- Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
- Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
- Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
- Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
- Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
- Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. , (2014).
- Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. , (2014).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
- Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652 (2012).
- Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
- Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. , 116-216 (2015).
- Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).
