Abstract
유도 된 심근 세포로 심장 섬유 아세포 (CFS)의 직접 변환 (ICMS)는 심장 질환의 치료를위한 대안 전략을 제공함으로써 재생 의학을위한 큰 잠재력을 보유하고있다. 이 변환은 Gata4 (G), Mef2c (M) 및 Tbx5 (T)로 정의 요인의 강제 식으로 이루어졌다. 전통적으로, ICMS는 이러한 개별 요소를 표현 바이러스의 칵테일에 의해 생성됩니다. 그러나, 효율을 재 프로그래밍하는 것은 상대적으로 낮고 시험관 대부분 G, M, 섬유 아세포가 곤란 리 프로그래밍 메커니즘을 연구 할 수있게, 충분히 재 프로그램되지 않은 T-형질. 우리는 최근 G, M의 화학 양론이, T 효율적 ICM의 프로그래밍에 대한 중요 것으로 나타났습니다. M하고 MGT 폴리 시스 트론 벡터 (이하 MGT라고 함) 상당히 증가 리 프로그래밍 효율을 이용함으로써 달성 G 및 T의 낮은 수준의 상대 수준이 높은 G, M, T 최적의 화학 양론과 시험 관내에서 향상된 품질 ICM. 여기서 우리는 심근 아세포에서 MGT 구성체 ICMS를 생성하기 위해 사용 된 방법의 상세한 설명을 제공한다. 심근 아세포, 프로그래밍 및 리 프로그래밍 프로세스 평가 용 바이러스의 생성은 분리 ICMS의 효율적이고 재생 가능한 생성을위한 플랫폼을 제공하기 위해 포함된다.
Protocol
여기에 설명 된 프로토콜은 신생아 마우스를 사용합니다. 동물 관리 및 실험은 노스 캐롤라이나 대학 부문 실험 동물 의학 (DLAM), 채플 힐에 의해 설립 된 지침에 따라 수행된다.
버퍼 및 미디어 1. 준비
- 섬유 아세포 (FB) 매체를 준비 : 100 ㎖ 태아 소 혈청 (FBS), 6 ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신 500 ml의에게 IMDM 미디어를 보충합니다.
- 100㎖의 M199 배지 및 50ml의 FBS와 400 mL의 DMEM 배지를 보충 : ICM 매체를 준비한다.
- B27 매체를 준비 : 10 ML의 B27 매체와 490 ml의 RPMI 1640 미디어를 보충합니다.
- 플랫-E 배양 배지를 준비 : 50 ㎖의 FBS, 5 ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신, 5 ml의 비 필수 아미노산과 500 ml의 DMEM 미디어를 보충합니다.
- 플랫-E 형질 전환 매체를 준비 : 50 ㎖의 FBS 및 5 ml의 비 필수 아미노산과 500 ml의 DMEM 미디어를 보충합니다.
- 홍보epare 젤라틴 24 웰 플레이트를 코팅 : 24 웰 플레이트의 잘 0.5 ml의 0.1 % 젤라틴 용액을 추가, 바로 사용하기 전에 최소 10 분, 흡인 37 ℃에서 배양한다.
- 라벨링 FACS 완충액을 제조 : 2 mM의 최종 농도에 도달하는 10 ㎖의 FBS와 2 ml의 EDTA (0.5 M)과 500㎖의 DPBS를 보완. 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 통해 전달합니다.
- MACS 완충액을 선별을 제조 : 2 mM의 최종 농도에 도달하기 위해 2.5 g의 BSA 및 2 ㎖의 EDTA (0.5 M)과 500㎖의 DPBS를 보완. 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 통해 전달합니다.
- 형질 전환을 위해 배 HBS 버퍼를 준비 : 280 mM의 염화나트륨 (8.1816 g)을, 10 밀리미터의 KCl (0.37275 G), 1.5 밀리미터 나 2 HPO 4 (0.10647 G), 12 mM의 포도당과 500 ml의에게 HEPES 버퍼 (50 mm)를 보완 (1.08096 g의 ). 7.05-7.12하여 pH를 조정하기 위해 약 650 μL 10 N의 NaOH를 추가합니다. 4 ° C에서 0.22 μm의 기공 필터와 저장소를 통해 필터링합니다.
- 형질 2.5 M CaCl2를 솔루션을 준비 : 18.376 g의 칼슘을 추가CL 2-50 ML의 DDH 2 O 4 ° C에서 0.22 μm의 기공 필터와 저장소를 통해 필터링합니다.
- ICC (면역 세포) 고정 버퍼를 준비 : 4 %의 최종 농도에 도달하기 위해 35 ML의 DPBS에 5 ml의 파라 포름 알데히드 (PFA, 32 %)를 첨가.
- ICC의 투과성으로 버퍼를 준비한다 : 0.1 %의 최종 농도에 도달하는 100 ㎖의 DPBS 0.1 mL의 트리톤 추가.
- ICC 블로킹 완충액을 제조 : 5 %의 최종 농도에 도달하는 100 ㎖의 DPBS에 5g 소 혈청 알부민 (BSA)을 추가한다.
- ICC 염색 버퍼를 준비 : 1 %의 최종 농도에 도달하는 100 ㎖의 DPBS로 1g의 BSA를 추가한다.
신생아 마우스 심장 섬유 아세포의 2 세대
- 절편 배양 방법에서 심장 섬유 아 세포를 생성
- 청소 신생아 αMHC-GFP 형질 전환 마우스 75 % 에탄올 (P2에 P1). 멸균 가위로 머리를 잘라. 그런 다음 다른 하나의 겨드랑이 아래에서 수평 절개를합니다. 멸균을 사용하여무딘 구부러진 집게는 심장을 해부하고 얼음처럼 차가운 PBS 버퍼를 포함하는 24 웰 플레이트 잘 하나에 배치합니다.
- 또한, 수평 절개 한 후 심장을 짠다.
- 형광 현미경으로 마음에 GFP 발현을 확인합니다. GFP 발현이 심장 특이 적 프로모터이다 αMHC 프로모터에 의해 구동되기 때문에 부정적인 마음이 어떤 형광 희미 동안, 형질 전환 마우스의 심장, 녹색 (15)에 있어야합니다.
- 60mm 센터 웰 배양 접시에 3 ~ 4 GFP 긍정적 인 마음을 가지고 멸균 가위와 집게로 작은 조각 크기가 1mm 미만 3로를 말하다.
- 2 ml의 FB 매체와 한 10cm 접시에 3-4 다진 마음을 놓습니다. 조직을 3 시간 동안 정착하자.
- 천천히 심장 조직을 포함하는 요리 8 ml의 예열 FB 미디어를 추가 할 수 있습니다. 사흘 동안 조직을 방해하지 마십시오.
- 3 일 미디어를 교체합니다.
- 7 일, aspir에문화 매체를 먹고 DPBS로 세포를 씻어. 각 접시에 3 ml의 0.05 % 트립신을 첨가하고 5 분 동안 37 ℃에서 다이제스트.
- 트립신을 해소하기 위해 5 ml의 FB 미디어를 추가합니다. 부드럽게 세포 스크레이퍼와 세포를 분리. 위로 더 기계적으로 조직을 떼어 놓다 아래로 미디어를 피펫.
- 세포를 수집하고 심장 조직 절편의 오염을 방지하기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터링 한 후 5 분 동안 200 XG에서 회전하여 세포 펠렛.
- 세척 세포는 한 번 맥 버퍼 및 세포 분류에 대한 준비가되어 있습니다.
- 청소 신생아 αMHC-GFP 형질 전환 마우스 75 % 에탄올 (P2에 P1). 멸균 가위로 머리를 잘라. 그런 다음 다른 하나의 겨드랑이 아래에서 수평 절개를합니다. 멸균을 사용하여무딘 구부러진 집게는 심장을 해부하고 얼음처럼 차가운 PBS 버퍼를 포함하는 24 웰 플레이트 잘 하나에 배치합니다.
- 효소 분해 방법에서 심장 섬유 아 세포를 생성
- 수확 GFP 2.1.1와 같은 긍정적 인 마음입니다. 10 ml의 얼음처럼 차가운 DPBS와 10cm 접시에 모든 마음을 전송합니다.
- 혈액을 제거하고 얼음처럼 차가운 DPBS로 한번 씻어 살균 집게와 심실을 짜내.
- 다른 조직과 지방의 자유를 마음을 낸다.
- 여전히 느슨하게 연결되어 약 4 조각으로 각각의 심장을 잘라.
- 20 미만 마음, 8 ml의 따뜻한 0.05 % 트립신 - EDTA와 15 ML 원뿔 튜브에 마음을 전송하고, 15 분 동안 37 ℃에서 배양합니다.
- 20-30 마음이있는 경우, 10 ml의 따뜻한 0.05 % 트립신 EDTA로 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 마음을 전송하고, 15 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
- 트립신을 취소하고 HBSS 또는 (20 ~ 30 하트) 10 ml의 따뜻한 II 형 콜라겐 (0.5 ㎎ / ㎖) (20 미만 마음이) 5 mL를 추가 할 수 있습니다.
- 소용돌이가 4-6 주위에 속도 수준에서 1 분 vortexer를에 튜브 (액체가 뚜껑까지하지 않는 경우, 속도는 괜찮습니다).
- 3 ~ 5 분 동안 37 ℃로 물을 욕조에 튜브를 품어.
- 1 분 동안 튜브를 소용돌이.
- 조직 조각이 정착 될 때까지 중력에 의해 1 분 동안 퇴적물은 5 ml의 차가운 FB 매체를 포함하는 새로운 튜브에 액체를 수집합니다.
- 반복 2.2.6-2.2.10 3-5 번 단계를 반복합니다.
- 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터링하여 모든 모음을 결합단일 세포 현탁액을 확인합니다.
- 4 ℃에서 5 분 200 XG에 원심 분리기.
- 재현 탁 (10) ML의 맥 버퍼에있는 세포, 4 ℃에서 5 분 200 XG에 원심 분리기.
- 선택적 : 1 ml의 RBC 용해 완충액 (150 mM의 NH 4 CL, 10 mM의 KHCO 3, 0.1 mM의 EDTA)과 혈액 세포에 resuspend 세포가 많이 존재한다면, 10 ㎖의 MACS로 희석시키고, 1 분간 얼음 위에 유지 버퍼 및 5 분 200 XG에 원심 분리기. MACS 버퍼와 한 번 더 씻는다.
- 맥에 의해 Thy1.2 + 섬유 아 세포의 분리 (자기 활성화 된 셀 정렬)
- 트리 판 블루 염색을 통해 생존 세포 수를 결정합니다.
- 단계 2.2.14에 10 ml의 세포 현탁액 10 μL 세포를 꺼냅니다. 10 μL 0.4 % 트리 판 블루 용액을 섞는다.
- 혈구에 혼합물을 추가합니다. 이 3 ~ 5 분간 방치 한 후 현미경으로 즉시 검사 할 수 있습니다. 파란색과 생존 세포에 염색 된 죽은 세포는 흠이다.
- 트리 판 블루 염색을 통해 생존 세포 수를 결정합니다.
- 이하 1 × 10 7 세포의 경우, 90 μL 10 μL의 Thy1.2 마이크로 비드와 재현 탁 세포는 맥 버퍼를 냉각. 이상 1 × 10 7 세포가 비례하는 경우 더 많은 구슬을 추가합니다. 잘 혼합하고 30 분 동안 냉장고 (2-8)에 품어.
- 10 ml의 맥이 버퍼와 스핀 샘플 5 분 200 XG에 추가; 다시 10 ml의 맥 버퍼와 원심 분리기로 한 번 씻는다.
- MACS 버퍼에 2 ml의 부피를 가져와.
- 맥 구분 후드에서 설정합니다. 분리기에 LS 열을 삽입합니다. 맥 컬럼에 버퍼 3 ㎖ 그것을 평형에 적용됩니다.
- 평형 LS의 칼럼을 통해 세포 현탁액을 전달합니다.
- 마다 버퍼 2 ML의 맥 3 회 반복한다.
- T 오프 LS 열을 가라그 세퍼레이터는 MACS 새로운 50 ㎖ 튜브에 버퍼 2 ㎖로 3 회 용출.
- 5 분 동안 200 XG 스핀.
- 10 ㎖의 FB 배지에서 재현 탁 세포는 세포를 계산하고 적당한 농도로 플레이트에 시드. 이식편 배양 방법에서 생성 된 섬유 아세포를 들어, 시드 세포 밀도는 약 2-3 × 104 세포 / 웰로 24 웰 플레이트 일 수있다. 효소 분해 방법에서 발생하는 섬유 아세포를 들어, 세포 밀도는 약 4 ~ 5 × 10 4 세포 / 웰 24 웰 플레이트 될 수 있습니다.
ICM 재 프로그래밍을위한 레트로 바이러스의 3 세대
참고 : 무균 조건 하에서 BSL2 생물 안전 캐비닛에서 다음 단계를 수행합니다. 형질 감염된 세포, 피펫 팁 및 튜브의 적절한 폐기는 환경과 건강 위험의 위험을 방지하는 것이 좋습니다.
- 1 μg의 / ㎖의 퓨로 마이신과 10 μg의 / ㎖의 B 보충 플랫-E 미디어에서 플랫 - E 세포를 유지5 % CO 2, 37 ℃에서 lasticidin.
- 하루에 2 일, 퓨로 마이신과 블라스트가없는 플랫-E 배양 배지로 매체를 교체합니다.
- 0 일에서 10cm 요리 약 형질 전날 플레이트 당 4 ~ 5 × 10 6 세포로 플랫 - E 세포를 분리. 세포는 ~ 형질의 날에 80~90% 합류해야한다.
- 1 일에, 이전에 형질 전환에 1 시간 내에서 세포에 형질 미디어로 변경 문화 미디어. 다음과 같은 형질의 절차는 다음과 같습니다
- 상업 키트를 사용하여 형질
- 20 ㎕를 형질 감염 시약 (리포 펙 타민 등) 500 μL를 혼합 감소 된 혈청 배지 (예를 들어,의 Opti-MEM). 혈청 미디어 감소 다른 500 μL에 레트로 바이러스 플라스미드의 10 μg의 추가. 5 분 동안 실온 (RT)에서 각각의 혼합물을 배양한다.
- 천천히 형질 전환 혼합물에 플라스미드 혼합물을 추가합니다. 이 단계는 15 ~ 30 초 정도 걸릴 수 있습니다. (솔루션은 흐린 나타날 수 있습니다) 실온에서 20 분 동안 혼합물을 품어. 세포 현명한 혼합물 드롭을 추가합니다.
- 37 ° C 배양기에서 하룻밤 품어.
- 인산 칼슘을 사용하여 형질 감염.
- 40 ㎕의 2.5 M CaCl2를 440 μL가 DDH 2 O 후 레트로 바이러스 플라스미드의 20 μg의 (총 부피 500 μL가되도록 DDH 2 O의 양을 조절)를 추가 혼합한다.
- 15 ML 원뿔 튜브에 HBS 배 500 μl를 추가합니다.
- HBS 와동과 한편 HBS에 칼슘-DNA 혼합물을 적가 추가 할 수 있습니다. 이 단계는 각 샘플에 대해 30 초 주위에 걸립니다. 그래서 최대한 동시에 3-4 샘플을한다.
- 더 이상 시간이 침전물을 차지하게됩니다 큰 침전물 적은 세포로 연결을위한 3 분의 보육 RT에서 품어.
- 혼합물이 세포에 적가하고 20 배 현미경으로 관찰 추가합니다. 미세 침전물 (작은 것들의 많은 좋은하지만 몇 가지 큰 사람이 잘되지 않습니다) 볼 수 있어야합니다.
- 37 ° C 배양기에서 밤새 품어.
- 하루에 2 일, 문화 미디어 데워진 8 mL를 세포에 미디어를 변경합니다. 24 시간 동안 품어.
- 3 일 및 4 일째, 0.45 ㎛의 공극 크기의 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 여과, 10 mL의 멸균 일회용 주사기를 사용하고 50 ㎖ 튜브에 전사함으로써 접시에서 배양 상등액을 모은다. 매 8 mL의 바이러스 함유 뜨는에 레트로 바이러스 침전 용액 2 ㎖를 추가합니다. 부드럽게 섞어 4 ℃에서 밤새 품어.
- 5 일에, 30 분 동안 4 ℃에서 1,500 × g에서 바이러스 액을 스핀. 바이러스 입자는 튜브의 바닥에 흰색 펠렛에 나타납니다.
- 상층 액을 버린다. 5 분 동안 1,500 × g에서 원심 분리하여, 잔류 용액을 스핀 다운. 펠렛에 침전 된 레트로 바이러스 입자를 방해하지 큰 관심을 가지고, 흡인에 의해 유체의 모든 흔적을 제거합니다.
- 매 8 mL의 바이러스 상층 액 100 μL의 DPBS 버퍼와 레트로 바이러스 펠렛을 재현 탁. 나누어지는얼음에 바이러스. 즉시 사용 또는 -80 ° C에서 저장합니다.
심장 섬유 아세포 4. 재 프로그래밍
- 10 ml의 ICM 매체에 10 ㎎ / ㎖ 폴리 브렌 솔루션의 4 μL를 추가로 pipetting 아래로 부드럽게 섞는다. 폴리 브렌의 최종 농도는 4 μg의 / ㎖이다.
- 섬유 아 세포와 시드 24 웰 플레이트의 각 웰에 500 μL ICM 미디어 포함 폴리 브렌를 추가합니다.
- 이식편 문화 또는 효소 절단 방법에서 4-5 × 10 4 세포에서 각 웰 포함 중 2 ~ 3 × 104 세포에 10 μL의 레트로 바이러스를 추가합니다. 바이러스의 양에 비례 다른 배양 플레이트 또는 접시에서 세포 수 증가와 함께 증가한다. 바이러스 감염을 허용하는 24 ~ 48 시간 동안 37 ° C를 배양기에서 접시를 넣습니다. 심장 리 프로그래밍에 대한 타임 라인은도 1에 도시된다.
- 바이러스 성 전달 후, 500 μL 일반 ICM 매체와 바이러스를 포함하는 미디어를 교체합니다.
- 2-3 일마다 미디어를 변경합니다. 바이러스 성 형질 도입 세포의 긍정적 인 선택을위한 세포를 대상으로 2 μg의 / ㎖에서 퓨로 마이신 보충 ICM 미디어를 추가 할 수 있습니다. 사흘 동안을 유지합니다. 그 후, 1 μg의 / ㎖의 농도로 배지에서 ICM 퓨로 마이신을 유지한다.
- 사흘 바이러스 감염 후, 인큐베이터에서 밖으로 판을 가지고 GFP 발현을 관찰하기 위해 거꾸로 형광 현미경 (20X) 아래에 배치합니다.
주 : 열흘 바이러스 감염 후에, 세포를 FACS 분석 및 리 프로그래밍의 효율을 결정하는 ICC 분석을 위해 채취 될 수있다 (단계 5 및 6). - 열네 일 바이러스 감염 후, B27 미디어와 ICM 미디어를 교체합니다. 3 일 미디어를 변경합니다. 자발적인 박동 세포 궤적 세 (효소 분해 방법과 세포) 또는 바이러스 성 전달 후 네 (절편 배양 방법과 세포) 주에서 나타날 수 있습니다.
재 프로그래밍 효율 5. 면역 세포 화학 분석
- 린스 세포세 번 PBS 차가운 얼음; 여분의 용액을 제거.
- 24 웰 플레이트의 각 웰에 0.5 ml의 ICC 고정 버퍼를 추가합니다. 15 ~ 20 분 동안 실온에서 세포를 수정.
- PBS로 3 회 세포를 씻어.
- 24 웰 플레이트의 각 웰에 0.5 ml의 ICC의 투과성으로 버퍼를 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 세포를 Permeabilize 하시려면.
- PBS로 3 회 세포를 씻어.
- 24 웰 플레이트의 각 웰에 버퍼를 차단 0.5 ml의 ICC 추가, 1 시간 동안 실온에서 품어.
- ICC 염색 버퍼로 희석 일차 항체. 잘 200 μL 각 항체 솔루션을 추가하고 밤새 4 ° C를 품어. 항체 희석 요인은 재료에 나열되어 있습니다.
- 다음날, PBS로 3 회 세포를 씻으십시오.
- 세포에 200 μL 차 항체 솔루션을 추가하고 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
- 3 회 PBS로 세포를 씻으십시오.
- 솔루션 각 웰에 DAPI를 포함하는 설치 150 μl를 추가합니다. 1 분 동안 핵을 염색 할 수 있습니다. 그때둥근 유리 커버 슬립과 잘 각각을 커버하고 부드럽게 공기 방울을 제거하기 위해 집게로 바닥면에 미끄럼을 누릅니다.
- 과잉 솔루션을 기음과 샘플 이미징을위한 준비가되어 있습니다. D14에서 표현 재 프로그램 세포 심장 마커 cTnT를하고 αActinin을 보여주는 대표 이미지는 그림 2B에 표시됩니다.
재 프로그래밍 효율의 6 FACS 분석
- 철저히 DPBS 한 번 세포를 씻으십시오. 각 웰에 0.3 ml의 트립신 (0.05 %)를 첨가하고, 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
- 부드럽게 세포를 해제 용이하게하기 위해 판을 누릅니다. 현미경으로 세포의 분리를 확인합니다. 대부분의 세포가 분해 될 때 각 웰에 1 ml의 외과 버퍼를 추가합니다. 피펫까지 추가로 기계적으로 세포를 떼어 놓다에 이르기까지.
- 잘 잘 96 웰 깊은 우물 판에 24 웰 플레이트에 세포를 전송합니다. 4 ℃에서 5 분 200 XG에 스핀 세포를 수집합니다.
- 한 번 씻을 세포FACS 버퍼입니다.
- 4 ℃에서 20 분 동안 세포를 재현 탁 100 μL 고정 / 투과성으로 솔루션을 추가합니다.
- 1X 세척 솔루션, 펠렛로 두 번 세포를 씻으하고, 상층 액을 제거합니다.
- 1X 세척 버퍼에 GFP 및 cTnT에 대한 일차 항체 솔루션을 준비합니다. 철저히 50 μL 항체 솔루션으로 각 샘플을 재현 탁하고 30 분 동안 4 ° C에서 품어.
- 1X 세척 솔루션, 펠렛에 한 번 세포를 씻으하고, 상층 액을 제거합니다.
- 각 샘플에 알렉사 플 루어 488 복합 당나귀 항 - 토끼 IgG의 알렉사 플 루어 647 복합 당나귀 안티 - 마우스 IgG를 포함하는 50 μL 차 항체 솔루션을 추가합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 4 ° C에서 품어.
- 1X 세척 솔루션, 펠렛에 한 번 세포를 씻으하고, 상층 액을 제거합니다.
- 400 μL 고정 버퍼 (1 % PFA와 DPBS)에 재현 탁 세포. 셀 스트레이너 캡 외과 튜브에 세포를 전송합니다. 샘플 외과 검출을위한 준비가되어 있습니다. 재 프로그래밍 efficienc의 대표 FACS 분석Y는 pMxs - 퓨로 마이신-MGT는도 2a에 도시 또는 퓨로 마이신 선택하지 않고 구성 사용.
- 상업 키트를 사용하여 형질
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Representative Results
프로그래밍 단계는. 그림 1에 개략적으로 요약된다 MGT 전달 후, 세포를 재 프로그램에서 GFP 발현은 초기 형질 세포의 3 퓨로 마이신 선택이 3 일에서 시작하고 2 주 동안 유지되는 날이 검출 될 수 있다면 PMX-순수하지 않아 -MGT 구조가 사용됩니다. 14 일에 10 일까지, cTnT를하고 αActinin 같은 심장 마커의 발현이 시작 섬유 아 세포가 심장 세포를 향해 재 프로그래밍을 겪고 있음을 나타내는 두 ICC (그림 2B, 5 단계) 및 외과 (그림 2A, 6 단계)에 의해 검출 될 수있다 운명.
그림 1. 각 시점에서 직접 심장 재 프로그래밍 과정의 도식 표현 절차 블랙 박스에 기재되어있다. 각 단계에 대한 문화 매체는 시간 아래 색상의 상자에 표시됩니다선.
그림 2 : 외과와 ICC에 의해 평가 재 프로그래밍 효율성 MGT 전달 후 10 일에서 갓 고립 된 섬유 아세포에서 생성 된 ICMS에 (A) FACS 분석.. DAPI와 αMHC-GFP, 심장 cTnT를하고 αActinin 2 주째 ICMS의 (B) 염색 (4 ', 6 diamidino -2- 페닐 인돌). 스케일 바 : 200 μm의
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Discussion
이 프로토콜을 사용하는 경우 성공적인 ICM 생성을위한, 전체 효율에 영향을 미치는 중요한 요인은 몇 가지가있다. 특히 섬유 아세포의 개시 조건으로 레트로 바이러스 부호화 MGT의 품질이 크게 리 프로그래밍의 효율에 영향을 미칠 수있다.
그것은 가능한 한 신선하고 건강한 섬유 아 세포를 생성하는 것이 중요하다. 이식편 후 7 일이 접시에 플레이 팅 하였다 전에 이식편 배양 방법, 섬유 아세포가 사용될 수있다. 효소 분해 방법의 경우, 섬유 아세포의 격리 빠르면 다음날로서 사용될 수있다. 냉동 또는 재 프로그래밍의 섬유 아 세포를 계대하지 않는 것이 좋습니다. 섬유 아 세포의 이러한 추가 치료는 크게 프로그래밍의 효율성을 감소합니다. 시딩 밀도 리 프로그래밍의 효율에 영향을 미치는 또 다른 중요한 인자이다. 세포가 띄엄 띄엄 시딩 경우, 불규칙한 세포 형태와 크기에 큰 해로운지는 경향. 좀처럼 공동 없습니다ULD 그 균체 ICMS로 변환 될 수있다. 세포가 너무 조밀하게 파종하는 경우, 바이러스 감염에 대한 MOI (감염의 다중성)이 감소된다. 감염되지 않은 섬유 아 세포의 과대 성장이 크게하여 ICMS의 낮은 비율의 결과로 재 프로그래밍 이벤트를 희석. 더 많은 셀들이 프로그래밍을 위해 접종하는 경우 또한 조약돌 모양의 형태로 작은 세포의 출현을 통지. 그들은 거의 재 프로그래밍되지 따라서 감소 프로그래밍 효율이 발생할 수 있습니다. 조직 배양 접시의 다른 크기의 프로토콜을 수정할 경우, 그 세포 수를 파종하여 배양 접시의 표면 면적에 비례하여 조정하는 것이 권장된다.
섬유 아 세포의 순도는 프로그래밍 중요합니다. 섬유 아세포의 높은 순도는 우리가 여기에서 설명 된 바와 같이 외과는 15 맥 농축을 정렬하여 하나 달성 할 수있다. FACS 정렬에 비해 MACS 정렬이 쉽게 완만, 더욱 편리하다. 맥 후 세포 순도 90 중량 % 이상에 도달 할 수암탉은 엄격하게 프로토콜을 다음과 같습니다. 오염 된 세포가 섬유 아세포보다 재 프로그래밍 어려워 때문에 섬유 아세포의 낮은 순도는 재 프로그래밍 효율을 감소시킬 수 있으며, 그들은 재 프로그래밍 세포보다 훨씬 빠르게 증식있다. 그것은 또한 매우 바로 맥 후 세포를 씨와 밤새 시딩 후 바이러스 감염을 수행하는 것이 좋습니다. 정렬 된 섬유 아세포는 부분적으로 만 증식하는 세포를 감염 레트로 바이러스의 흡수를 감소 오랜 시간에 대한 접시에 성장 후 노화 될 수 있습니다. 꼬리 끝의 섬유 아세포 (TTFs) 및 배아 섬유 아 세포 (MEFs에)는 10,12,19,26 요인 다른 전사와 ICMS로 변환되는 것으로보고되고있다. 우리의 프로토콜은 여기에만 심장 섬유 아 세포에 초점을 맞추고있다. 다른 유형의 섬유 아세포이 프로토콜의 적용은 상기 인해 이러한 증식 유전 상태, 섬유 아세포 등의 후생 유전 학적 최적 서명의 고유의 변화에 최적화 될 수있다.
목전달을위한 레트로 바이러스의 전자 품질이 가장 중요합니다. 낮은 역가의 바이러스는 ICMS에 섬유 아세포를 변환하는 데 실패합니다. 반면에 과도한 양의 바이러스는 직접 세포 사멸을 섬유 아세포에 이르게 세포 독성의 원인이됩니다. 이것은 실험실 셋업 및 실험 조건에 따라 재 프로그래밍 바이러스를 투여 바이러스 역가를 결정하고 최적화 할 필요가있다. 바이러스 적정 방법은 충분히 23 전에 설명 하였다. 사실, 우리는 플랫-E 세포의 성장 조건이 직접 바이러스 성 품질에 관한 것으로 나타났다. 그것은 하부 통로 (<30)마다에 플랫 - E 세포를 해동하는 것이 좋습니다. 유로 세에서 얻어진 세포 밀도로 10cm의 배양 접시 당 약 4 ~ 5 × 10 6 세포 포장 바이러스에 가장이다. 또한, 갓 수확 된 바이러스는 바이러스 냉동보다 리 프로그래밍의 효율을 얻었다. 프로그래밍 효율 possib을 감소 다른 pMxs 벡터 기반의 레트로 바이러스와 MGT 바이러스의 동시 감염을 유의하시기 바랍니다동일한 유형의 두 바이러스 간의 경쟁에 의한 LY. 두 개의 서로 다른 형질 전환 방법은 여기에 제공됩니다. 두 방법 모두 유사한 레트로 바이러스를 생성합니다. 리포 펙 타민 상업적 비싼하지만 안정하지만, 인산 칼슘 트랜 싸다. HBS 완충액의 제조 HBS 완충액의 pH가 크게 형질 전환 효율이 큰 영향을 주므로주의를 취할 필요가있다.
해결해야 할이 프로토콜의 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 한계 중 하나는 필연적으로 바이오 안전성 문제로 렌더링 레트로 바이러스의 사용에있다. 섬유 아 세포의 이질성과 분리를위한 특정 심장 섬유 아세포 마커의 부족은 또한 재 프로그래밍되어 세포의 순도에 영향을 미칩니다. 리 프로그래밍 효율의 변화로 인해 섬유 아세포의 조건과 바이러스 생산에 내재 배치 변동에 관찰 될 수있다. 또한, 세포는 재 프로그램 심장 트로포 닌 T로서 근절 구조 단백질을 발현되지만과 αActinin, 그들은 같은 수축력 및 전기 전파 등의 기능적 특성을 특징으로 성숙한 심근 세포는 여전히 없습니다.
요약하면, 여기에 설명 된 방법은 하나의 구조에 M, G, T의 전사 인자의 레트로 바이러스 전달을 기반으로 ICMS를 효율적으로 생성 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 ICM 연구를위한 재현하고 가치있는 플랫폼을 제공하고, 높은 처리량 검사 및 ICM의 재 프로그래밍의 기계적인 연구에 지속적인 노력을 용이하게하고, 궁극적으로 임상 응용 프로그램에 ICM의 재 프로그램 필드 가까이 이동합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-cardiac troponin T | Thermo Scientific | MS-295-PO | 1:200 for FACS and 1:400 for ICC |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | 1:500 for both FACS and ICC |
| anti- aActinin | Sigma-Aldrich | A7811 | 1:500 for both FACS and ICC |
| anti-Connexin43 | Sigma-Aldrich | C6219 | 1:500 for ICC |
| anit-Mef2c | Abcam | ab64644 | 1:1,000 for ICC |
| anti-Gata4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1237 | 1:200 for ICC |
| anti-Tbx5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17866 | 1:200 for ICC |
| Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-545-152 | 1:500 for both FACS and ICC |
| Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 715-605-150 | 1:500 for both FACS and ICC |
| Cytofix/Cytoperm kit for intracellular staining | BD Biosciences | 554722 | |
| Rhod-3 Calcium Imaging Kit | Life Technologies | R10145 | |
| Thy1.2 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | |
| Vectashield solution with DAPI | Vector labs | H-1500 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F-2442 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052 | |
| PRMI1640 medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| IMDM | Life Technologies | 12440-053 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| M199 medium | Life Technologies | 10-060 | |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin | Corning | 30-002 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11130-050 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668500 | |
| blasticidin | Life Technologies | A11139-03 | |
| puromycin | Life Technologies | A11138-03 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | BP358-212 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | PX1405 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | 9048-46-8 | |
| paraformaldehyde | EMS | 15714 | |
| Retrovirus Precipitation Solution | ALSTEM | VC-200 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Corning | 21022 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 0.45 μm cellulose acetate filter | Thermo Scientific | 190-2545 | |
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Thermo Scientific | 172958 | |
| 60 mm center well culture dish | Corning | 3260 | |
| 96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well Plate | Denville Scientific | P9639 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Vortexer MINI | VWR | 58816-121 | |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System | Life Technologies | AMAFD1000 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Round glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 72195-15 |
References
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