Abstract
Прямое преобразование сердечных фибробластов (CFS) в индуцированных кардиомиоцитов (холодильников) имеет большой потенциал для регенеративной медицины, предлагая альтернативные стратегии для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Это преобразование было достигнуто за счет принудительной экспрессии определенных факторов, таких как Gata4 (G), MEF2C (М) и Tbx5 (T). Традиционно, холодильников генерируются коктейль вирусов, выражающих эти индивидуальные факторы. Тем не менее, эффективность перепрограммирования является относительно низким, и большинство из в пробирке G, M, T-трансдуцированных фибробластов не станет полностью перепрограммировать, что затрудняет изучение механизмов перепрограммирования. Недавно мы показали, что стехиометрия G, M, T имеет решающее значение для эффективного ICM перепрограммирования. Оптимальный стехиометрии G, M, T с относительной высокой M и низким уровнем G и T, достигнутых с помощью нашего полицистронных MGT вектор (далее именуемое MGT) значительно повышенную эффективность перепрограммирования и улучшение качества ICM в пробирке, Здесь мы предлагаем подробное описание методологии, используемой для создания холодильников с MGT конструкции из сердечных фибробластов. Выделение сердечных фибробластов, поколения вируса для перепрограммирования и оценки процесса перепрограммирования также включены, чтобы обеспечить платформу для эффективного и воспроизводимого поколения холодильников.
Protocol
Протокол изложил здесь использует новорожденных мышей. Уход за животными и эксперименты выполняются в соответствии с руководящими принципами, установленными Отделом лабораторных животных медицины (DLAM) в Университете Северной Каролины, Чапел-Хилл.
1. Подготовка буферов и СМИ
- Подготовьте фибробластов (FB) среды: Дополнение 500 мл IMDM среду 100 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 6 мл пенициллина / стрептомицина.
- Подготовка ICM среда: Дополнение 400 мл DMEM СМИ со 100 мл М199 СМИ и 50 мл FBS.
- Подготовка B27 среду: Дополнение 490 мл RPMI1640 медиа с 10 мл B27 СМИ.
- Подготовьте Plat-E культуральную среду: Дополнение 500 мл DMEM среды с 50 мл FBS, 5 мл пенициллина / стрептомицина и 5 мл Номера незаменимых аминокислот.
- Подготовка Плат-E трансфекции среду: Дополнение 500 мл DMEM СМИ с 50 мл FBS и 5 мл Номера для незаменимых аминокислот.
- Прepare покрытые желатином 24-луночный планшет: Добавить 0,5 мл 0,1% раствора желатина в скважине 24-луночного планшета, инкубируют при 37 ° С в течение по меньшей мере 10 мин и аспирации непосредственно перед использованием.
- Подготовка FACS буфера маркировки: Дополнение 500 мл DPBS 10 мл FBS и 2 мл ЭДТА (0,5 М) до конечной концентрации 2 мМ. Пройти через фильтр и хранят 0,22 мкм при 4 ° С.
- Подготовка MACS буфера сортировки: Дополнение 500 мл DPBS с 2,5 г BSA и 2 мл ЭДТА (0,5 М), чтобы достичь конечной концентрации 2 мМ. Пройти через фильтр и хранят 0,22 мкм при 4 ° С.
- Подготовьте 2x буфера HBS для трансфекции: дополнить 500 мл HEPES буфера (50 мм) с 280 мм NaCl (8,1816 г), 10 мМ KCl (0,37275 г), 1,5 мМ Na 2 HPO 4 (0,10647 г), 12 мМ глюкозы (1.08096 г ). Добавить около 650 мкл 10 N NaOH, чтобы довести рН до 7,05-7,12. Фильтруют через фильтр 0,22 мкм пор и хранят при температуре 4 ° С.
- Подготовьте 2,5 М CaCl 2 решение для трансфекции: Добавить 18.376 г CaCl 2 до 50 мл DDH 2 O. Фильтруют через фильтр 0,22 мкм пор и хранят при температуре 4 ° С.
- Подготовка ICC (Иммуноцитохимическая) фиксации буфер: Добавить 5 мл параформальдегида (PFA, 32%) в 35 мл DPBS до конечной концентрации 4%.
- Подготовка ICC проницаемости буфер: Добавить 0,1 мл Тритона до 100 мл DPBS до конечной концентрации 0,1%.
- Подготовка блокирующего буфера ICC: Добавить 5 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 100 мл DPBS до конечной концентрации 5%.
- Подготовка ICC окрашивающего буфера: Добавить 1 г БСА на 100 мл DPBS до конечной концентрации 1%.
2. Генерация неонатальных мышей сердечных фибробластов
- Создание сердечные фибробласты из метода эксплантов культуры
- Чистый новорожденных αMHC-GFP трансгенной мыши (P1 до P2) 75% -ным этанолом. Отрежьте голову стерильными ножницами. Затем сделать горизонтальную разрез из-под одной подмышки до другой. Используйте стерильныйтупые и изогнутые щипцы рассекать из сердца и поместить его в одну лунку 24-луночного планшета, содержащего ледяной PBS буфера.
- Кроме того, выжать сердце после горизонтальной разреза.
- Проверьте GFP выражение в сердце флуоресцентным микроскопом. Так как выражение GFP управляется αMHC промотора, который является сердечная промотор, сердце из трансгенной мыши должны быть в зеленой 15, в то время как отрицательное сердце тусклый в любом флуоресценции.
- Принимают 3-4 GFP позитивные сердца в 60 мм центр культуральной чашки а фарш их на мелкие кусочки менее 1 мм 3 в размерах стерильными ножницами и щипцами.
- Поместите 3-4 фарш сердца в одно блюдо 10 см с 2 мл FB СМИ. Пусть ткани осесть в течение 3 часов.
- Медленно добавить 8 мл подогретого FB СМИ к блюдам, содержащих сердечные ткани. Не беспокоить тканей в течение трех дней.
- Замените носитель каждые три дня.
- На 7 день, Aspirели культуральной среды и промыть клетки с DPBS. Добавить 3 мл 0,05% трипсина в каждую чашку и переварить при 37 ° С в течение 5 мин.
- Добавьте 5 мл FB СМИ, чтобы утолить трипсина. Осторожно открепления клеток с клеточным скребком. Внесите СМИ вверх и вниз для дальнейшего механически отделить ткани.
- Сбор клеток и фильтруют через 40 мкм ячейки сита, чтобы избежать загрязнения фрагментов тканей сердца, а затем осадить клетки центрифугированием при 200 мкг в течение 5 мин.
- Вымойте клетки один раз MACS-буфера и клетки готовы для сортировки.
- Чистый новорожденных αMHC-GFP трансгенной мыши (P1 до P2) 75% -ным этанолом. Отрежьте голову стерильными ножницами. Затем сделать горизонтальную разрез из-под одной подмышки до другой. Используйте стерильныйтупые и изогнутые щипцы рассекать из сердца и поместить его в одну лунку 24-луночного планшета, содержащего ледяной PBS буфера.
- Создание сердечные фибробласты из ферментов методом пищеварения
- Урожай GFP положительные сердца как 2.1.1. Перенесите все сердца в 10 см блюдо с 10 мл ледяной DPBS.
- Сожмите желудочки с стерильным пинцетом, чтобы удалить кровь и промыть один раз ледяной DPBS.
- Обрезать сердца, чтобы быть свободным от других тканей и жира.
- Разрежьте каждый сердце в примерно 4 частей, которые по-прежнему слабо связанных.
- Если менее 20 сердца, сердца передачи в 15 мл коническую пробирку 8 мл теплой 0,05% трипсина-ЭДТА, и инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин.
- Если есть 20-30 сердца, сердца передачи в 50 мл коническую пробирку с 10 мл теплого 0,05% трипсина-ЭДТА, и инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин.
- Откажитесь от трипсина и добавить 5 мл (менее 20 сердец) или 10 мл (для 20-30 сердца) теплой тип II коллагеназы (0,5 мг / мл) в HBSS.
- Вихревые трубки на вихревом смесителе в течение 1 мин при уровне скорости около 4 до 6 (если жидкость не вставать с крышкой, то скорость в порядке).
- Выдержите трубки в 37 ° С на водяной бане в течение 3-5 мин.
- Vortex трубку в течение 1 мин.
- Осадок в течение 1 мин под действием силы тяжести до тех пор, пока кусочки ткани осесть, сбора жидкости в новую пробирку, содержащую 5 мл холодной FB среды.
- Повторите шаги 3-5 2.2.6-2.2.10 раз.
- Смешайте все коллекции с помощью фильтрации через фильтр 40 мкм клетокчтобы суспензии отдельных клеток.
- Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
- Ресуспендируют клеток в 10 мл буфера MACS и центрифуге при 200g в течение 5 мин при 4 ° С.
- Необязательно: Если существует много клеток крови, ресуспендирования клеток с 1 мл РБК буфера для лизиса (150 мм NH 4 Cl, 10 мМ КНСО 3 и 0,1 мМ ЭДТА), держать на льду в течение 1 мин, затем разбавляют 10 мл MACS буфер и центрифугируют при 200 х г в течение 5 мин. Вымойте еще раз с MACS буфера.
- Выделение Thy1.2 + фибробластов по MACS (магнитно-активированных клеток сортировка)
- Определить количество жизнеспособных клеток через окрашивания трипановым синим.
- Возьмите 10 мкл клеток из суспензии на 10 мл клеточной этапе 2.2.14. Смешайте его с 10 мкл 0,4% трипанового синий раствор.
- Добавить смесь к гемоцитометра. Позвольте ему стоять в течение 3-5 мин, а затем изучить непосредственно под микроскопом. Мертвые клетки окрашиваются в синий и жизнеспособных клеток неокрашенных.
- Определить количество жизнеспособных клеток через окрашивания трипановым синим.
- Для менее чем 1 х 10 7 клеток, ресуспендирования клеток с 10 мкл Thy1.2 микросфер в 90 мкл охлажденной MACS буфера. Добавить еще бусы пропорционально, если есть более чем 1 х 10 7 клеток. Хорошо перемешать и инкубировать в холодильнике (2-8 ° С) в течение 30 мин.
- Добавить 10 мл MACS-буфера и образцы вращаются на 200 мкг в течение 5 мин; Промывают один раз 10 мл буфера MACS и центрифуги снова.
- Принесите объем до 2 мл в MACS буфера.
- Настройка МАКС Сепаратор в капот. Вставка столбца LS в сепаратор. Применение 3 мл буфера для MACS колонке, чтобы уравновесить его.
- Pass клеточной суспензии через уравновешенную колонку LS.
- Промыть 3 раза с 2 мл MACS буфера каждый раз.
- Возьмите колонку LS выкл тон сепаратор и элюируют 3 раза с 2 мл MACS буфера в новую пробирку на 50 мл.
- Спин при 200g в течение 5 мин.
- Ресуспендируют клеток в 10 мл FB СМИ, подсчет клеток и семян в планшеты надлежащего плотности. Для фибробластов, полученных от метода эксплантов культуры, посев плотность клеток может быть около 2-3 х 10 4 клеток / лунку 24 луночного планшета. Для фибробластов, полученных от фермента методом пищеварения, плотность клеток может быть около 4-5 х 10 4 клеток / лунку 24 луночного планшета.
3. Генерация ретровируса для ICM перепрограммирования
Примечание: Выполните следующие шаги в BSL2 биологическом Кабинета безопасности в стерильных условиях. Надлежащая утилизация трансфицированных клеток, наконечники пипеток и труб рекомендуется, чтобы избежать риска опасностей окружающей среды и здоровья.
- Поддержание Plat-E клеток в Plat-E, дополненной 1 мкг / мл пуромицин и 10 мкг / мл бlasticidin при 37 ° С с 5% СО 2.
- На 2-й день, замените носитель по Plat-E культуральной среде не хватает пуромицин и бластицидин.
- В день 0, разделить Plat-E клеток в 10 см чашки за день до трансфекции приблизительно 4-5 × 10 6 клеток на чашку. Клетки должны быть ~ 80-90% сплошности в день трансфекции.
- В день 1, изменение питательных сред для трансфекции клеток на средах в течение 1 часа до трансфекции. Процедура трансфекции выглядит следующим образом:
- Трансфекция с использованием коммерческих наборов
- Смешайте 20 мкл реагента для трансфекции (например, LipofectAMINE) и 500 мкл сыворотки снижается СМИ (например, Opti-MEM),. Добавить 10 мкг плазмиды ретровирусов еще 500 мкл сыворотки сниженным СМИ. Инкубируют каждый смеси при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
- Медленно добавить смесь плазмиды трансфекции смеси. Этот шаг может занять 15-30 сек. Выдержите смесь в течение 20 мин при комнатной температуре (раствор может появиться облачно). Добавить смесь по каплям к клеткам.
- Инкубируют в течение ночи в 37 ° С инкубатор.
- Трансфекция с использованием фосфата кальция.
- Смешайте 40 мкл 2,5 М CaCl 2 и 440 мкл DDH 2 O, а затем добавить 20 мкг плазмиды ретровирусной (регулировать количество DDH 2 O, так что общий объем составл ет 500 мкл).
- Добавить 500 мкл 2x HBS в 15 мл коническую трубку.
- Vortex ОБД и тем добавить смесь кальция-ДНК в HBS по каплям. Этот шаг занимает около 30 сек для каждого образца. Так максимально сделать 3-4 образцов одновременно.
- Выдержите при комнатной температуре в течение 3 мин инкубации в течение больше времени приводит к большей осадка и менее клеток займет осадка.
- Добавить смесь по каплям к клеткам и наблюдать под микроскопом 20Х. Изобразительное осадки (много маленьких хороши, но несколько больших не хорошо) должно быть видно.
- Инкубируют в течение ночи при 37 ° С инкубатор.
- На 2-й день, изменить СМИ на клетки с 8 мл предварительно нагретой культура СМИ. Инкубируют в течение 24 часов.
- На 3-й день и 4-й день, собирают супернатант культуры из блюд с помощью 10 мл стерильного одноразового шприца, фильтрация его через 0,45 мкм размер пор фильтра из ацетата целлюлозы, и передачи в 50 мл пробирку. Добавить 2 мл раствора ретровируса осадков каждому 8 мл вируссодержащей супернатанта. Аккуратно перемешать и инкубировать в течение ночи при 4 ° С.
- На 5 день вращаться вирусную смесь при 1500 х г при 4 ° С в течение 30 мин. Вирусные частицы должны появляться в белом осадке на дне пробирки.
- Удалите супернатант. Спин вниз остаточный раствора центрифугированием при 1500 х г в течение 5 мин. Удалить все следы жидкости стремлением, принимая большую заботу, чтобы не нарушить осажденных частиц в ретровирусных таблетки.
- Ресуспендируют гранул ретровирусных с 100 мкл буфера для DPBS каждые 8 мл вирусной супернатант. Алиготевирус на льду. Использование сразу или хранить при -80 ° С.
4. Перепрограммирование фибробластов сердечных
- Добавьте 4 мкл 10 мг / мл раствора Полибрен в 10 мл среды ICM, и аккуратно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Конечная концентрация полибрена это 4 мкг / мл.
- Добавить 500 мкл среды, содержащей ICM полибрена в каждую лунку 24-луночного планшета затравку фибробластов.
- Добавить 10 мкл ретровируса в каждую лунку содержащих либо 2-3 х 10 4 клеток эксплантата культуры или 4-5 х 10 4 клеток методом ферментативного расщепления. Количество вируса должна быть пропорционально увеличена с увеличением количества клеток в различных культуральных планшетах или кухни. Поместите пластину в 37 ° C инкубаторе в течение 24-48 часов, чтобы позволить вирусную инфекцию. Время линия для сердечной перепрограммирования показано на рисунке 1.
- После вирусной трансдукции, заменить вирусов, содержащий носитель с 500 мкл регулярной ICM СМИ.
- Изменить СМИ каждые 2-3 дней. Для позитивной селекции вирусных трансдуцированных клеток, добавить ICM среде с пуромицин по 2 мкг / мл к клеткам-мишеням. Держите его в течение трех дней. После этого сохранить пуромицин в среде ICM при концентрации 1 мкг / мл.
- Через три дня после вирусной инфекции, принимать пластины из инкубатора и помещают его под инвертированным флуоресцентным микроскопом (20х), чтобы наблюдать выражение GFP.
Примечание: Через десять дней после вирусной инфекции, клетки могут быть собраны для анализа FACS анализа и ICC для определения эффективности перепрограммирования (на этапе 5, и 6). - Четырнадцать дней после вирусной инфекции, заменить ICM СМИ с B27 СМИ. Изменить СМИ каждые три дня. Спонтанное локусы избиение клеток может появиться из трех (клеток фермента методом пищеварения) или четырех (клеток методом культивирования эксплантов) недель после вирусной трансдукции.
5. Анализ Иммуноцитохимическая перепрограммирования эффективности
- Промойте клеткильдом PBS холодной три раза; удаления избытка раствора.
- Добавить 0,5 мл ICC фиксации буфера в каждую лунку 24-луночных планшетах. Зафиксировать клетки при комнатной температуре в течение 15-20 мин.
- Промыть клетки с PBS три раза.
- Добавить 0,5 мл ICC проницаемости буфер в каждую лунку в планшетах 24 также. Клетки проницаемыми при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Промыть клетки с PBS три раза.
- Добавить 0,5 мл ICC блокирующего буфера в каждую лунку 24-луночного планшета, инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Разводненная первичные антитела с окрашиванием МТП буфера. Добавить 200 мкл антител решения в каждую лунку и инкубируют в течение ночи при 4 ° C. Факторы разбавления антитела перечислены в материалов.
- На следующий день, мыть клетки с PBS три раза.
- Добавить 200 мкл вторичного антитела решения к клеткам и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре в темный.
- Промыть клеток PBS три раза.
- Добавить 150 мкл раствора, содержащего монтажные DAPI в каждую лунку. Разрешить для окрашивания ядер в течение 1 мин. затемпокрыть каждую лунку с круглым покровным стеклом и слегка нажмите на скольжение по отношению к нижней поверхности пинцетом, чтобы удалить пузырьки воздуха.
- Аспирируйте избытка раствора и образцы готовы для работы с изображениями. Представительные изображения, показывающие перепрограммировать клетки, которые экспрессируют маркер сердечной cTnT и αActinin на d14, показаны на рис 2B.
6. Анализ FACS перепрограммирования эффективности
- Тщательно промыть клетки один раз DPBS. Добавить 0,3 мл трипсина (0,05%) в каждую лунку и инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин.
- Аккуратно постучите по планшету для облегчения подъема клеток. Проверить открепления клеток под микроскопом. Добавить 1 мл FACS буфера в каждую лунку, когда большинство клеток диссоциируют. Пипетка вверх и вниз для дальнейшего механического диссоциации клеток.
- Передача клеток в 24-луночный планшет в 96-луночные планшеты глубокой скважины скважины к скважине. Спин при 200g в течение 5 минут при 4 ° С для сбора клеток.
- Вымойте клетки один раз сFACS-буфера.
- Добавить 100 мкл решения фиксации / проницаемости для ресуспендирования клеток в течение 20 мин при 4 ° С.
- Вымойте клеток дважды 1x промывочного раствора, гранул и удалить супернатант.
- Подготовка первичной решение антител против GFP и cTnT в 1x промывочного буфера. Тщательно ресуспендирования каждый образец с раствором 50 мкл антител и инкубируют при 4 ° С в течение 30 мин.
- Вымойте клеток один раз в 1x промывочного раствора, гранул и удалить супернатант.
- Добавить 50 мкл раствора, содержащего вторичное антитело Alexa Fluor 488 конъюгированный осла против кролика IgG и Alexa Fluor 647 конъюгированный осла против мыши IgG к каждому образцу. Выдержите при 4 ° С в течение 30 мин в темноте.
- Вымойте клеток один раз в 1x промывочного раствора, гранул и удалить супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 400 мкл буфера фиксации (DPBS с 1% PFA). Перевести ячейку в FACS трубы с сотового фильтра крышкой. Образцы готовы для обнаружения FACS. Представитель FACS анализ перепрограммирования efficiencу с помощью pMxs-пуромицину МГТ построить с или без отбора пуромицином показано на рисунке 2А.
- Трансфекция с использованием коммерческих наборов
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Шаги перепрограммирования обобщаются схеме на фиг.1. После MGT трансдукции, GFP выражение в перепрограммировании клеток может быть обнаружен уже в день 3. Пуромицин выбор трансдуцированных клеток начинается с 3-й день и сохраняется в течение первых двух недель, если PMX-Puro -MGT используется конструкция. Днем 10 до 14 дня, выражение кардиомаркеров как cTnT и αActinin могут быть обнаружены как ICC (Фигура 2В, стадия 5) и FACS-(фиг.2А, шаг 6), указывая, что исходные фибробласты претерпевают перепрограммирование к сердечной клетки Судьба.
Рисунок 1:. Схематическое представление процесса прямого перепрограммирования сердечной процедуры в каждый момент времени, описаны в черный ящик. Культуральные среды для каждой стадии, приведены в цветных квадратов ниже времялиния.
Рисунок 2: Перепрограммирование эффективность оценивается FACS и ICC (А) FACS-анализ на холодильников, полученных от свежевыделенных фибробластов на 10 день после MGT трансдукции.. (В) Окрашивание холодильников через 2 недели с αMHC-GFP, сердечной cTnT и αActinin с DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол). Масштаб бар: 200 мкм
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для успешного поколения ICM при использовании этого протокола, есть несколько важных факторов, которые оказывают влияние на общую эффективность. В частности, условия, начиная фибробластов и качество кодирования ретровирус MGT может значительно повлиять на эффективность перепрограммирования.
Важно, чтобы генерировать фибробласты, как свежей и здоровой, насколько это возможно. Для способа культивирования эксплантов, фибробласты могут быть использованы, прежде чем через семь дней после эксплантов высевают на кухне. Для фермента методом варки, фибробласты могут быть использованы как уже на следующий день изоляции. Замораживание или пересева фибробласты для перепрограммирования не рекомендуется. Эти дополнительные процедуры фибробластов будет значительно снижает эффективность перепрограммирования. Плотность посева еще один важный фактор, который влияет на эффективность перепрограммирования. Если клетки высевают разреженно, они имеют тенденцию становиться нездоровым с неправильной морфологии клеток и большого размера. Редко сотрудничатьпакетирования эти клетки быть преобразованы в ICMS. Если клетки высевают слишком плотно, МВД (множественность инфекции) для вирусной инфекции уменьшается. Чрезмерный рост неинфицированных фибробластов значительно разбавляет перепрограммирования события таким образом, что приводит к низким процентом холодильников. Мы также заметили появление мелких ячеек в булыжной морфологией, если больше клетки высевают для перепрограммирования. Они вряд ли можно перепрограммировать и, таким образом, привести к снижению эффективности перепрограммирования. При изменении протокола для различного размера чашки для культивирования тканей, рекомендуется посев числа клеток регулироваться пропорционально площади поверхности чашки для культивирования.
Чистоту фибробластов является критическим для перепрограммирования. Высокая чистота фибробластов может быть достигнуто либо путем FACS сортировки или 15 MACS обогащение как мы описали здесь. По сравнению с FACS сортировки, сортировка MACS легче, мягче и удобнее. Чистота клеток после MACS может достигать более 90% маскурица строго следуя протоколу. Низкий чистота фибробластов может снизить эффективность перепрограммирования, поскольку загрязненные клетки труднее, чем перепрограммировать фибробласты, и что они пролиферируют значительно быстрее, чем перепрограммирования клеток. Он также настоятельно рекомендуется, чтобы отобрать клетки сразу после MACS и выполнять вирусной инфекции ночь после посева. Отсортированные фибробласты могут частично станут стареющей после роста в чашке в течение длительного времени, что снижает поглощение ретровируса, что только инфицирует пролиферирующих клеток. Кончика хвоста фибробласты (СТСТ) и эмбриональных фибробластов (МЭФ), как сообщается, быть преобразованы в ICMS с какой-то другой транскрипции факторы 10,12,19,26. Наш протокол фокусируется здесь только на сердечных фибробластов. Применение этого протокола с другими фибробластов типов может быть дополнительно оптимизирован за счет присущих вариаций подписей фибробластов, такие как статус пролиферации, генетических и эпигенетических ориентиров.
ЧтE Качество ретровируса для трансдукции имеет первостепенное значение. Низкие вирусы титр не конвертировать фибробласты в ICMS. В то время как вирусы в избыточном количестве вызывает цитотоксичность, что непосредственно приводит к гибели клеток фибробластов. Это необходимо определить титр вируса и оптимизировать вирусной дозировку для перепрограммирования на основе лабораторной установки и условий эксперимента. Способ вирусной титрования была подробно описана до 23. На самом деле мы обнаружили, что состояние роста Плат-E клеток напрямую связано с вирусной качества. Рекомендуется, чтобы растопить Плат-E клеток в нижней проход (<30) каждый раз. Клетки, полученные при прохождении трех лучше всего подходят для упаковки вируса при плотности около 4-5 х 10 6 клеток на 10 см блюдо культуры. Кроме того, свежесобранные вирусы дают более высокую эффективность, чем перепрограммирование замороженных вирусов. Пожалуйста, обратите внимание, что ко-инфекции вируса MGT с другой вектор на основе ретровируса pMxs снизится possib эффективности перепрограммированияLY из-за конкуренции между двумя вирусами того же типа. Два различных методов трансфекции, представленная здесь. Оба метода получения сопоставимых ретровирус. В то время как коммерческий Липофектамин является дорогостоящим, но стабильным, трансфекции с фосфатом кальция дешевле. Подготовка HBS буфера нужно принимать с большой осторожностью, потому что рН буфера HBS существенно влияет на эффективность трансфекции.
Есть некоторые ограничения этого протокола, которые должны быть решены. Одним из ограничений заключается в использовании ретровируса, который неизбежно оказывает по вопросам биобезопасности. Неоднородность фибробластов и отсутствие конкретного сердечной фибробластов маркера для изоляции также влияют на чистоту клеток, которые перепрограммируемой. Изменение эффективности перепрограммирования может наблюдаться из-за изменчивости пакетном присущей состоянии фибробластов и продукции вируса. Кроме того, несмотря на то перепрограммировать клетки экспрессируют саркомера структуры белков, таких как сердечный тропонин Ти αActinin, они все еще не зрелые кардиомиоциты, характеризующиеся функциональными свойствами, такими как сократимости и электрической распространения.
Таким образом, методика описана здесь позволяет эффективно генерировать холодильников на основе ретровирусного доставки М, G, T транскрипционных факторов в один конструкт. Наш протокол обеспечивает воспроизводимое и ценный платформу для исследования ICM, и будет способствовать продолжающиеся усилия по высокопроизводительного скрининга и механистических исследованиях ICM перепрограммирования, и в конечном итоге перейти ICM перепрограммирование поле ближе к клинической практике.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-cardiac troponin T | Thermo Scientific | MS-295-PO | 1:200 for FACS and 1:400 for ICC |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | 1:500 for both FACS and ICC |
| anti- aActinin | Sigma-Aldrich | A7811 | 1:500 for both FACS and ICC |
| anti-Connexin43 | Sigma-Aldrich | C6219 | 1:500 for ICC |
| anit-Mef2c | Abcam | ab64644 | 1:1,000 for ICC |
| anti-Gata4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1237 | 1:200 for ICC |
| anti-Tbx5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17866 | 1:200 for ICC |
| Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-545-152 | 1:500 for both FACS and ICC |
| Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 715-605-150 | 1:500 for both FACS and ICC |
| Cytofix/Cytoperm kit for intracellular staining | BD Biosciences | 554722 | |
| Rhod-3 Calcium Imaging Kit | Life Technologies | R10145 | |
| Thy1.2 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | |
| Vectashield solution with DAPI | Vector labs | H-1500 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F-2442 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052 | |
| PRMI1640 medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| IMDM | Life Technologies | 12440-053 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| M199 medium | Life Technologies | 10-060 | |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin | Corning | 30-002 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11130-050 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668500 | |
| blasticidin | Life Technologies | A11139-03 | |
| puromycin | Life Technologies | A11138-03 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | BP358-212 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | PX1405 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | 9048-46-8 | |
| paraformaldehyde | EMS | 15714 | |
| Retrovirus Precipitation Solution | ALSTEM | VC-200 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Corning | 21022 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 0.45 μm cellulose acetate filter | Thermo Scientific | 190-2545 | |
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Thermo Scientific | 172958 | |
| 60 mm center well culture dish | Corning | 3260 | |
| 96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well Plate | Denville Scientific | P9639 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Vortexer MINI | VWR | 58816-121 | |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System | Life Technologies | AMAFD1000 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Round glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 72195-15 |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2014).
- Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
- Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
- Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).
- Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).
- Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
- Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
- Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
- Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
- Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577 (2013).
- Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
- Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
- Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
- Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
- Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
- Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
- Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. , (2014).
- Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. , (2014).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
- Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652 (2012).
- Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
- Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. , 116-216 (2015).
- Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).
