Abstract
La conversión directa de los fibroblastos cardíacos (CFS) en cardiomiocitos inducidos (ICMS) tiene un gran potencial para la medicina regenerativa al ofrecer estrategias alternativas para el tratamiento de enfermedades del corazón. Esta conversión se ha logrado mediante la expresión forzada de los factores definidos, tales como Gata4 (G), MEF2C (M) y Tbx5 (T). Tradicionalmente, los ICMs son generados por un cóctel de virus que expresan estos factores individuales. Sin embargo, la reprogramación de la eficiencia es relativamente baja y la mayor parte de la in vitro G, M, T-transduced fibroblastos no se vuelven totalmente reprogramados, lo que dificulta el estudio de los mecanismos de reprogramación. Recientemente hemos demostrado que la estequiometría de G, M, T es crucial para una eficiente reprogramación iCM. Una estequiometría óptima de G, M, T con un alto nivel relativo de M y bajos niveles de G y T obtenidos mediante el uso de nuestro vector policistrónico MGT (en lo sucesivo referido como MGT) aumentó significativamente la eficiencia de reprogramación y mejora de la calidad iCM in vitro. Aquí le ofrecemos una descripción detallada de la metodología utilizada para generar ICMS con constructo MGT de fibroblastos cardíacos. El aislamiento de los fibroblastos cardíacos, generación de virus para la reprogramación y la evaluación del proceso de reprogramación también se incluyen para proporcionar una plataforma para la generación eficiente y reproducible de ICMS.
Protocol
El protocolo descrito aquí utiliza ratones recién nacidos. Cuidado de los animales y los experimentos se realizan de acuerdo con los lineamientos establecidos por la División de Laboratorio de Medicina Animal (DLAM) en la Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill.
1. Preparación de tampones y Medios de Comunicación
- Preparar fibroblastos (FB) medio: Suplemento de 500 ml de medio IMDM con 100 ml de suero fetal bovino (FBS) y 6 ml de penicilina / estreptomicina.
- Prepare medio iCM: Suplemento de 400 ml de medio DMEM con 100 ml de medio M199 y 50 ml de FBS.
- Preparar medio B27: Suplemento 490 ml RPMI 1640 los medios de comunicación con 10 ml B27 medios.
- Preparar medio de cultivo Plat-E: Suplemento 500 ml DMEM medios con 50 ml de FBS, 5 ml de penicilina / estreptomicina y 5 ml aminoácidos no esenciales.
- Preparar medio de transfección Plat-E: Suplemento 500 ml de DMEM los medios de comunicación con 50 ml de FBS y 5 ml de aminoácidos no esenciales.
- Prepare gelatina revestido placa de 24 pocillos: Añadir solución de gelatina 0,5 ml 0,1% a un pocillo de placa de 24 pocillos, se incuba a 37 ° C durante al menos 10 minutos y aspirado de la derecha antes de su uso.
- Preparar tampón FACS etiquetado: Suplemento 500 ml de DPBS con 10 ml de FBS y 2 ml de EDTA (0,5 M) para alcanzar una concentración final de 2 mM. Pasar a través de un filtro y tienda de 0,22 micras a 4 ° C.
- Preparar tampón MACS de clasificación: Suplemento 500 ml de DPBS con 2,5 g de BSA y 2 ml de EDTA (0,5 M) para alcanzar una concentración final de 2 mM. Pasar a través de un filtro y tienda de 0,22 micras a 4 ° C.
- Preparar tampón HBS 2x para la transfección: Suplemento 500 ml de tampón HEPES (50 mM) con NaCl 280 mM (8,1816 g), mM KCl 10 (0,37275 g), 1,5 mM Na 2 HPO 4 (0,10647 g), 12 mM de glucosa (1,08096 g ). Añadir alrededor de 650 l 10 N NaOH para ajustar el pH a 7.5 a 7.12. Filtrar a través de un filtro de 0,22 micras de poro y se almacena a 4 ° C.
- Preparar M CaCl solución 2,5 2 para la transfección: Agregar 18,376 g de CaCl 2 a 50 ml ddH2O Filtrar a través de un filtro de 0,22 micras de poro y se almacena a 4 ° C.
- Preparar ICC (inmunocitoquímica) Tampón de fijación: Añadir 5 ml de paraformaldehído (PFA, 32%) a 35 ml de DPBS para llegar a una concentración final de 4%.
- Preparar tampón de permeabilización ICC: Añadir 0,1 ml de Triton 100 ml de DPBS para llegar a una concentración final de 0,1%.
- Preparar tampón de bloqueo ICC: Añadir 5 g de albúmina de suero bovino (BSA) a 100 ml de DPBS para llegar a una concentración final de 5%.
- Preparar tampón de tinción ICC: Añadir 1 g de BSA a 100 ml de DPBS para llegar a una concentración final de 1%.
2. Generación de neonatales mouse cardíacos fibroblastos
- Generar fibroblastos cardíacos de método de cultivo de explante
- Clean neonatal αMHC-GFP ratón transgénico (P1 a P2) con etanol 75%. Corta la cabeza con unas tijeras estériles. A continuación, hacer una incisión horizontal desde debajo de una axila a la otra. Use un estérilfórceps romos y se inclinó para diseccionar el corazón y la colocan en un pocillo de la placa de 24 pocillos que contiene tampón PBS helado.
- Alternativamente, exprimir el corazón después de la incisión horizontal.
- Compruebe la expresión de GFP en el corazón por el microscopio de fluorescencia. Dado que la expresión de GFP es impulsado por el promotor αMHC que es un promotor específico cardíaco, el corazón de ratón transgénico debe estar en verde 15, mientras que el corazón negativo es tenue en cualquiera de fluorescencia.
- Tome 3-4 GFP corazones positivos en un pozo central placa de cultivo de 60 mm y picar en trozos pequeños de menos de 1 mm 3 en el tamaño de tijeras y pinzas estériles.
- Coloca 3-4 corazones picados en una sola placa de 10 cm con 2 ml de medio de FB. Deje que los tejidos se establecen durante 3 horas.
- Agregue lentamente 8 ml precalentado medios FB a los platos que contienen los tejidos del corazón. No moleste a los tejidos durante tres días.
- Vuelva a colocar los medios de comunicación cada tres días.
- El día 7, aspircomió el medio de cultivo y lavar las células con DPBS. Añadir 3 ml 0,05% de tripsina a cada placa y digerir a 37 ° C durante 5 min.
- Añadir 5 ml de medio de FB para saciar la tripsina. Separar suavemente las células con un raspador de células. Pipetear los medios de comunicación de arriba a abajo para disociar más mecánicamente el tejido.
- Recoger las células y filtrar a través de 40 micras coladores celulares para evitar la contaminación de fragmentos de tejido del corazón, y luego sedimentar las células mediante centrifugación a 200 xg durante 5 min.
- Lavar las células una vez con tampón MACS y las células están listas para la clasificación.
- Clean neonatal αMHC-GFP ratón transgénico (P1 a P2) con etanol 75%. Corta la cabeza con unas tijeras estériles. A continuación, hacer una incisión horizontal desde debajo de una axila a la otra. Use un estérilfórceps romos y se inclinó para diseccionar el corazón y la colocan en un pocillo de la placa de 24 pocillos que contiene tampón PBS helado.
- Generar fibroblastos cardíacos de método de digestión enzimática
- Cosecha GFP corazones positivos como 2.1.1. Transferir todos los corazones en un plato de 10 cm con 10 ml de DPBS enfriado con hielo.
- Apriete ventrículos con pinzas estériles para quitar la sangre y enjuagar una vez con DPBS enfriado con hielo.
- Recorte los corazones de estar libre de otros tejidos y grasa.
- Corte cada corazón en aproximadamente 4 piezas que todavía están conectados vagamente.
- Si menos de 20 corazones, transfiera los corazones en un tubo cónico de 15 ml con 8 ml cálida 0,05% de tripsina-EDTA, y se incuba a 37 ° C durante 15 min.
- Si hay 20-30 corazones, transferir los corazones en un tubo cónico de 50 ml con 10 ml cálida 0,05% de tripsina-EDTA, y se incuba a 37 ° C durante 15 min.
- Deseche la tripsina y añadir 5 ml (por menos de 20 corazones) o 10 ml (para 20-30 corazones) cálida colagenasa tipo II (0,5 mg / ml) en HBSS.
- Vortex el tubo de vórtice durante 1 minuto a un nivel de velocidad alrededor de 4 a 6 (si el líquido no se levante a la tapa, entonces la velocidad está muy bien).
- Incubar el tubo en 37 ° C baño de agua durante 3-5 minutos.
- Vortex el tubo durante 1 min.
- Sedimentos durante 1 minuto por gravedad hasta que los trozos de tejido se calmen, recoger el líquido en un nuevo tubo que contiene 5 ml de medio FB frío.
- Repita los pasos 2.2.6-2.2.10 3-5 veces.
- Combinar todas las colecciones mediante la filtración a través de filtro de células de 40 micrashacer suspensión de células individuales.
- Centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Resuspender las células en 10 ml de tampón MACS, y centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Opcional: Si hay una gran cantidad de células sanguíneas, Resuspender las células con 1 ml de RBC tampón de lisis (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO3, y EDTA 0,1 mM), mantener en hielo durante 1 min, luego se diluye con 10 ml MACS tampón y se centrifuga a 200 xg durante 5 min. Lavar una vez más con tampón MACS.
- Aislamiento de Thy1.2 + fibroblastos por MACS (magnético clasificación de células activadas)
- Determinar el número de células viables mediante tinción con azul de tripano.
- Tomar 10 células mu l a partir de la suspensión de células de 10 ml en el paso 2.2.14. Mezclar con solución de azul de 10 l 0,4% de tripano.
- Añadir la mezcla a un hemocitómetro. Deje reposar durante 3-5 minutos y luego examinar de inmediato con un microscopio. Las células muertas se tiñen en las células azules y viables son sin mancha.
- Determinar el número de células viables mediante tinción con azul de tripano.
- Por menos de 1 x 10 7 células, las células volver a suspender las microesferas con 10 l Thy1.2 en 90 l enfriaron tampón MACS. Añadir más cuentas proporcionalmente si hay más de 1 x 10 7 células. Mezclar bien e incubar en nevera (2-8 ° C) durante 30 minutos.
- Añadir 10 ml de tampón MACS y muestras giran a 200 xg durante 5 min; lavar una vez con tampón MACS 10 ml y centrifugar de nuevo.
- Traiga volumen de 2 ml en tampón MACS.
- Establecer un separador de MACS en el capó. Inserte una columna LS al separador. Aplicar 3 ml MACS buffer para la columna que se equilibren.
- Pasar la suspensión celular a través de la columna LS equilibrada.
- Lavar 3 veces con 2 ml de tampón MACS cada vez.
- Tome la columna de la LS fuera tque Separador y eluir 3 veces con 2 ml MACS amortiguan en un nuevo tubo de 50 ml.
- Girar a 200 xg durante 5 min.
- Resuspender las células en 10 ml de medio FB, cuentan las células y se siembran en placas a una densidad adecuada. Para fibroblastos generados por el método de cultivo de explante, la densidad de células de siembra podría ser alrededor de 2.3 x 10 4 células / pocillo de placa de 24 pocillos. Para fibroblastos generados por método de digestión enzimática, la densidad de las células podría ser alrededor de 5.4 x 10 4 células / pocillo de placa de 24 pocillos.
3. Generación de retrovirus para iCM Reprogramación
Nota: Realice los siguientes pasos en un Gabinete de Seguridad Biológica BSL2 en condiciones estériles. Se recomienda la eliminación adecuada de las células transfectadas, puntas de pipeta y tubos para evitar el riesgo de los riesgos ambientales y de salud.
- Mantener células Plat-E en Plat-E medio suplementado con 1 mg / ml de puromicina y 10 mg / ml blasticidin a 37 ° C con 5% de CO 2.
- El día 2, sustituir el medio por el medio de cultivo Plat-E carente puromicina y blasticidina.
- En el día 0, dividir celdas Plat-E en placas de 10 cm el día antes de la transfección en aproximadamente 4-5 x 10 6 células por placa. Las células deben ser ~ 80-90% de confluencia en el día de la transfección.
- El día 1, los medios de comunicación el cambio de cultura a los medios de transfección de las células dentro de 1 hora antes de la transfección. Procedimiento de transfección es la siguiente:
- La transfección utilizando kits comerciales
- Mezclar 20 l de reactivo de transfección (Lipofectamine por ejemplo) y 500 l de suero reducido medios de comunicación (por ejemplo, Opti-MEM). Añadir 10 g del plásmido retroviral a otros 500 l reducidos medio de suero. Incubar cada mezcla a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
- Poco a poco agregue la mezcla de plásmido a la mezcla de transfección. Este paso puede tardar 15-30 seg. Incubar la mezcla durante 20 min a RT (solución puede aparecer turbia). Añadir gota sabia mezcla de las células.
- Incubar toda la noche en una incubadora a 37 °.
- La transfección utilizando fosfato de calcio.
- Mezclar 40 l 2,5 M CaCl2 y 440 l ddH2O, a continuación, añadir 20 g de plásmido retroviral (ajustar la cantidad de ddH2O de manera que el volumen total es de 500 l).
- Añadir 500 l 2x HBS a un tubo cónico de 15 ml.
- Vortex la HBS y añada su parte la mezcla de ADN de calcio a la HBS gota a gota. Este paso lleva alrededor de 30 segundos para cada muestra. Así máximamente hacer 3-4 muestras simultáneamente.
- Incubar a temperatura ambiente durante 3 min de incubación durante más tiempo lleva al precipitado más grande y menos células asumirá el precipitado.
- Añadir la mezcla gota a gota a las células y observar bajo el microscopio 20X. Precipitados finos (un montón de pequeñas son buenas pero algunas grandes no son buenos) deben ser vistos.
- Incubar durante la noche a 37 ° C incubadora.
- El día 2, cambiar el medio sobre las células con 8 ml precalentada medios de cultivo. Incubar durante 24 horas.
- El día 3 y el día 4, recoger el sobrenadante del cultivo de las placas mediante el uso de una jeringa desechable de 10 ml estéril, filtrándola a través de un filtro de acetato de celulosa de tamaño de poro 0,45 micras, y transferir a un tubo de 50 ml. Añadir 2 ml de solución de precipitación retrovirus a cada sobrenadante que contiene virus-8 ml. Suavemente mezclar e incubar durante la noche a 4 ° C.
- El día 5, girar la mezcla viral a 1500 × g a 4 ° C durante 30 min. Las partículas virales deben aparecer en pellet blanco en la parte inferior del tubo.
- Eliminar el sobrenadante. Centrifugar la solución residual por centrifugación a 1500 xg durante 5 min. Quite todos los rastros de líquido por aspiración, teniendo mucho cuidado de no molestar a las partículas retrovirales precipitados en tabletas.
- Resuspender gránulos retrovirales con tampón DPBS 100 l por cada 8 ml de sobrenadante viral. Alícuotael virus en hielo. Utilice inmediatamente o almacenar a -80 ° C.
4. La reprogramación de fibroblastos cardíacos
- Añadir 4 l de solución de polibreno 10 mg / ml en el medio de iCM 10 ml, y mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo. La concentración final de polibreno es 4 mg / ml.
- Añadir 500 l medios iCM que contiene polibreno a cada pocillo de placa de 24 pocillos sembrada con fibroblastos.
- Añadir 10 l retrovirus a cada pocillo que contienen ya sea 2-3 x 10 4 células de cultivo de explantes o 4-5 x 10 4 células de método de digestión enzimática. La cantidad de virus se debe aumentar proporcionalmente con el aumento de número de células en diferentes placas o placas de cultivo. Poner la placa en una incubadora a 37ºC durante 24 a 48 horas para permitir que la infección viral. La línea de tiempo para la reprogramación cardiaca se muestra en la Figura 1.
- Después de la transducción viral, reemplace virus medios que contienen con 500 l de medios regulares iCM.
- Cambie los medios de comunicación cada 2-3 días. Para la selección positiva de células transducidas virales, añadir medios ICM suplementados con puromicina a 2 mg / ml a las células diana. Manténgalo durante tres días. Después de eso, mantener la puromicina en el medio iCM a la concentración de 1 mg / ml.
- Tres días después de la infección viral, tomar la placa hacia fuera de la incubadora y colocarlo bajo un microscopio de fluorescencia invertida (20X) para observar la expresión de GFP.
Nota: Diez días después de la infección viral, las células pueden ser cosechadas para el análisis FACS y análisis de la CPI para determinar la eficiencia de reprogramación (en el paso 5 y 6). - Catorce días después de la infección viral, reemplace medios iCM con medios B27. Cambie los medios de comunicación cada tres días. Espontánea loci celular latido puede aparecer a partir de tres (células de método de digestión enzimática) o cuatro (células de método de cultivo de explante) semanas después de la transducción viral.
5. Inmunocitoquímico Análisis de Eficiencia Reprogramación
- Enjuague las célulascon el hielo frío PBS tres veces; eliminar el exceso de solución.
- Añadir tampón de fijación 0,5 ml de la CPI a cada pocillo de placas de 24 pocillos. Fijar las células a temperatura ambiente durante 15-20 min.
- Enjuagar las células con PBS tres veces.
- Añadir 0,5 ml de tampón de permeabilización ICC a cada pocillo de las placas de 24 pocillos. Permeabilizar las células a temperatura ambiente durante 15 min.
- Enjuagar las células con PBS tres veces.
- Añadir 0,5 ml de la CPI tampón de bloqueo a cada pocillo de placa de 24 pocillos, se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora.
- Anticuerpos primarios diluidos con tampón de tinción ICC. Añadir 200 l soluciones de anticuerpo a cada pocillo e incubar durante la noche a 4 ° C. Los factores de dilución de anticuerpo se enumeran en Materiales.
- En el día siguiente, lavar las células con PBS tres veces.
- Añadir 200 soluciones de anticuerpos secundarios mu l a las células y se incuba durante 1 hora a TA en la oscuridad.
- Lavar las células con PBS tres veces.
- Añadir 150 l solución que contiene DAPI a cada pocillo de montaje. Permitir a manchar núcleos durante 1 min. entoncescubrir cada pocillo con hoja de la cubierta de cristal redondo y presione suavemente el deslizamiento contra la superficie inferior con unas pinzas para quitar las burbujas de aire.
- Aspirar el exceso de solución y las muestras están listas para la imagen. Las imágenes representativas que muestran las células reprogramadas que expresan marcadores cardíacos cTnT y αActinin en d14 se muestran en la Figura 2B.
6. FACS análisis de la eficiencia de reprogramación
- Lave las células una vez con DPBS. Añadir 0,3 ml de tripsina (0,05%) a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 5 min.
- Golpee suavemente la placa para facilitar el levantamiento de las células. Compruebe el desprendimiento de células bajo el microscopio. Añadir 1 ml de tampón FACS a cada pocillo cuando se disocian mayoría de las células. Pipetear hacia arriba y abajo para disociar más mecánicamente las células.
- Transferir las células de la placa de 24 pocillos de una placa de 96 pozos profundos bien a bien. Centrifugado a 200 xg durante 5 min a 4 ° C para recoger las células.
- Lavar las células una vez conTampón FACS.
- Añadir 100 soluciones de fijación / permeabilización mu l para resuspender las células durante 20 min a 4 ° C.
- Lavar las células dos veces con solución de lavado 1x, pellets, y retirar el sobrenadante.
- Prepare la solución de anticuerpo primario contra la GFP y cTnT en tampón de lavado 1x. Resuspender a fondo cada muestra con una solución de anticuerpo 50 l y se incuba a 4 ° C durante 30 min.
- Lave las células una vez en solución de lavado 1x, pellets, y retirar el sobrenadante.
- Añadir 50 solución de anticuerpo secundario que contiene l Alexa Fluor 488 burro conjugado IgG anti-conejo y Alexa Fluor 647 burro conjugado anti-IgG de ratón a cada muestra. Se incuba a 4 ° C durante 30 min en la oscuridad.
- Lave las células una vez en solución de lavado 1x, pellets, y retirar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 400 l de tampón de fijación (DPBS con 1% PFA). La transferencia de células en el tubo de FACS con el casquillo de filtro de células. Las muestras están listas para la detección FACS. El análisis FACS representante de una eficiencia de reprogramacióny usando pMxs-puromicina-MGT construir con o sin selección puromicina se muestra en la Figura 2A.
- La transfección utilizando kits comerciales
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Representative Results
Los pasos de reprogramación se resumen por esquema de la Figura 1. Después de la transducción de MGT, la expresión de GFP en la reprogramación de células podrían ser detectados tan pronto como día 3. puromicina selección de células transducidas comienza a partir de 3 días y se mantiene durante las dos primeras semanas si PMX-puro se utiliza constructo -MGT. Por día 10 a día 14, la expresión de los marcadores cardíacos como cTnT y αActinin podría ser detectada tanto por ICC (Figura 2B, paso 5) y FACS (Figura 2A, paso 6), indicando que los fibroblastos de partida son sometidos a la reprogramación hacia una célula cardíaca destino.
Figura 1:. Representación esquemática del proceso de reprogramación directa cardiaca Procedimientos en cada punto de tiempo se describen en cajas negras. Los medios de cultivo para cada etapa se muestran en cajas de colores debajo del tiempolínea.
Figura 2: Reprogramación eficiencia evaluado por FACS y CPI (A) FACS análisis sobre ICMS generados a partir de fibroblastos recién aisladas en el día 10 después de la transducción MGT.. (B) Tinción de iCMS a las 2 semanas con αMHC-GFP, cTnT cardiaca, y αActinin con DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol). Barra de escala: 200 m
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Discussion
Para exitosa generación iCM al utilizar este protocolo, hay varios factores importantes que tienen un impacto en la eficiencia global. Particularmente las condiciones de fibroblastos de partida y la calidad de codificación retrovirus MGT pueden afectar en gran medida la eficiencia de la reprogramación.
Es importante generar fibroblastos tan fresco y saludable posible. Para el método de cultivo de explantes, los fibroblastos se pueden utilizar antes de siete días después de los explantes se sembraron en platos. Para el método de digestión con enzimas, los fibroblastos pueden utilizarse tan pronto como el día siguiente de aislamiento. No se recomienda la congelación o pases los fibroblastos para la reprogramación. Estos tratamientos adicionales de fibroblastos disminuirán significativamente la eficiencia de reprogramación. La densidad de siembra es otro factor importante que afecta a la eficiencia de reprogramación. Si las células son escasamente cabeza de serie, que tienden a ser poco saludable con la morfología celular irregular y de tamaño grande. Pocas veces coULD esas células pueden convertir en ICMS. Si las células se siembran demasiado densamente, la MOI (multiplicidad de infección) para la infección viral se reduce. El crecimiento excesivo de los fibroblastos no infectados diluye significativamente los eventos de reprogramación que resulta en un bajo porcentaje de ICMS. También notamos la aparición de células más pequeñas en adoquines morfología similar si más células se siembran para su reprogramación. No podían ser reprogramadas y por lo tanto resultan en reducción de la eficiencia de reprogramación. Al modificar el protocolo para diferentes tamaños de placas de cultivo tisular, se recomienda que la siembra el número de células se puede modificar proporcionalmente a la superficie de la placa de cultivo.
La pureza de los fibroblastos es crítico para la reprogramación. La alta pureza de los fibroblastos podría lograrse ya sea por FACS clasificación 15 o enriquecimiento MACS como describimos aquí. En comparación con FACS clasificación, clasificación MACS es más fácil, más suave, y más conveniente. La pureza de la célula después de MACS podría llegar a más del 90% wgallina siguiendo estrictamente el protocolo. Baja pureza de los fibroblastos puede disminuir la eficiencia de reprogramación ya que las células contaminadas son más difíciles de ser reprogramado de fibroblastos y que proliferan mucho más rápido que las células reprogramación. También es muy recomendable para sembrar las células después de MACS y realizar infección viral durante la noche después de la siembra. Los fibroblastos pueden ordenados parcialmente convertido en senescentes después de crecer en el plato durante mucho tiempo, lo que disminuye la absorción del retrovirus que sólo infecta las células proliferantes. Fibroblastos punta de la cola (RSA) y fibroblastos embrionarios (MEFs) se han reportado para ser convertido en ICMs con algún otro factores de transcripción 10,12,19,26. Nuestro protocolo aquí sólo se centra en los fibroblastos cardiacos. La aplicación de este protocolo a otros tipos de fibroblastos se puede optimizar aún más debido a las variaciones inherentes de firmas de fibroblastos tales como el estado de la proliferación, la genética y monumentos epigenéticos.
The calidad de retrovirus para la transducción es de suma importancia. Virus bajo título no logran convertir fibroblastos en ICMS. Mientras que los virus en cantidad excesiva hará que la citotoxicidad que conduce directamente a fibroblastos muerte celular. Es necesario determinar el título viral y optimizar la dosis viral para la reprogramación de laboratorio basado en la configuración y las condiciones experimentales. El método para la titulación viral se ha descrito a fondo antes de 23. De hecho, se encontró que la condición de crecimiento de las células Plat-E se relaciona directamente con la calidad viral. Se recomienda descongelar las células Plat-E en el paso inferior (<30) cada vez. Las células obtenidas en el paso de tres son los mejores para el virus de envases con una densidad de alrededor de 4-5 x 10 6 células por placa de 10 cm cultura. Además, los virus recién cosechadas producen una mayor eficiencia de la reprogramación de los virus congelados. Tenga en cuenta que la co-infección de virus de MGT con otros pMxs retrovirus vector basado disminuirá la posib eficiencia reprogramaciónLy debido a la competencia entre los dos virus del mismo tipo. Dos métodos de transfección diferentes se proporcionan aquí. Ambos métodos producen retrovirus comparables. Mientras Lipofectamine comercial es costoso, pero estable, transfección con fosfato de calcio es más barato. Preparación del tampón HBS tiene que tener mucho cuidado porque el pH del tampón HBS afecta significativamente la eficacia de transfección.
Hay algunas limitaciones de este protocolo que deben abordarse. Una de las limitaciones radica en el uso de retrovirus, lo que hace inevitablemente a cuestiones de bioseguridad. La heterogeneidad de los fibroblastos y la falta de marcador de fibroblastos cardíacos específicos para el aislamiento también afectan a la pureza de las células que son reprogramable. Variación de la eficiencia de reprogramación se puede observar debido a la variabilidad inherente a la condición lote de fibroblastos y la producción de virus. Además, aunque las células reprogramadas expresan proteínas de la estructura del sarcómero como la troponina T cardiacay αActinin, todavía no son cardiomiocitos maduros se caracterizan por propiedades funcionales tales como la contractilidad y la propagación eléctrica.
En resumen, la metodología descrita aquí permite la generación eficiente de iCMS basado en la entrega de factores de transcripción retroviral M, G, T en un único constructo. Nuestro protocolo proporciona una plataforma reproducible y valiosa para la investigación iCM, y facilitará los esfuerzos en curso sobre cribado de alto rendimiento y de estudios sobre el mecanismo de iCM reprogramación, y en última instancia se mueven campo reprogramación iCM más a las aplicaciones clínicas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-cardiac troponin T | Thermo Scientific | MS-295-PO | 1:200 for FACS and 1:400 for ICC |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | 1:500 for both FACS and ICC |
| anti- aActinin | Sigma-Aldrich | A7811 | 1:500 for both FACS and ICC |
| anti-Connexin43 | Sigma-Aldrich | C6219 | 1:500 for ICC |
| anit-Mef2c | Abcam | ab64644 | 1:1,000 for ICC |
| anti-Gata4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1237 | 1:200 for ICC |
| anti-Tbx5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17866 | 1:200 for ICC |
| Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-545-152 | 1:500 for both FACS and ICC |
| Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 715-605-150 | 1:500 for both FACS and ICC |
| Cytofix/Cytoperm kit for intracellular staining | BD Biosciences | 554722 | |
| Rhod-3 Calcium Imaging Kit | Life Technologies | R10145 | |
| Thy1.2 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | |
| Vectashield solution with DAPI | Vector labs | H-1500 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F-2442 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052 | |
| PRMI1640 medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| IMDM | Life Technologies | 12440-053 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| M199 medium | Life Technologies | 10-060 | |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin | Corning | 30-002 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11130-050 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668500 | |
| blasticidin | Life Technologies | A11139-03 | |
| puromycin | Life Technologies | A11138-03 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | BP358-212 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | PX1405 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | 9048-46-8 | |
| paraformaldehyde | EMS | 15714 | |
| Retrovirus Precipitation Solution | ALSTEM | VC-200 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Corning | 21022 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 0.45 μm cellulose acetate filter | Thermo Scientific | 190-2545 | |
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Thermo Scientific | 172958 | |
| 60 mm center well culture dish | Corning | 3260 | |
| 96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well Plate | Denville Scientific | P9639 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Vortexer MINI | VWR | 58816-121 | |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System | Life Technologies | AMAFD1000 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Round glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 72195-15 |
References
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