Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Очистка и повторной укладки в амилоидных фибрилл в (Его) Published: December 19, 2015 doi: 10.3791/53432
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Virologie et Immunologie Moléculaires, INRA

Abstract

Система выражение палочка Escherichia является мощным инструментом для получения рекомбинантных белков эукариот. Мы используем его, чтобы произвести Shadoo, белок, относящийся к семейству прионов. Хроматографический метод очистки (Его) 6 -tagged рекомбинантного Shadoo выражается тела включения описан. Тела включени солюбилизируют в 8М мочевине и связан с 2+ -charged колонке Ni выполнить ионный аффинной хроматографии. Связанные белки элюируют градиентом имидазола. Фракции, содержащие белок Shadoo подвергают вытеснительной хроматографии с получением высокоочищенного белка. На заключительном этапе очищенный Shadoo обессоливают удалить соли, мочевину и имидазола. Рекомбинантный белок Shadoo является важным реагентом для биофизических и биохимических исследований конформации белка нарушений, происходящих в прионных заболеваний. Многие доклады продемонстрировали, что прионные нейродегенеративные заболевания происходят из осаждения ударале, приказал амилоидные фибриллы. Примеры протоколов, описывающие, как фибриллировать Shadoo в амилоидных фибрилл в кислой и нейтральной / основные значения рН представлены. Методы о том, как производить и фибрилляции Shadoo может способствовать исследования в лабораториях, работающих на прионных заболеваний, так как он позволяет производства больших количеств белка в быстрой и дешевой манере.

Introduction

Прионные нейродегенеративных заболеваний, в том числе крупного рогатого скота губчатой ​​энцефалопатии крупного рогатого скота, овец скрепи в и болезни Крейтцфельдта-Якоба у человека, являются фатальными и неизлечимая. Прионные болезни характеризуются конформационных изменений клеточного прионного белка в основном состоит из альфа-спиралей, в поперечном бета-амилоида, обогащенный листа конформера 1,2. Кросс-бета-структуры содержат плотно и высоко упорядоченные кристаллические, как бета-листов стабилизируется водородными связями 3,4. Прионные амилоиды может самовоспроизведению в связи с бета-нитей на растущий край, обеспечивающих шаблон для вербовки и преобразования мономера белка.

По данным "только белок" гипотезы, амилоид конформер прионного белка является единственным инфекционный агент. Тем не менее, некоторые другие биомолекулы были предложены, чтобы быть необходимым расстройств прионов. Например, клеточные мембраны, как считается, это место, где Конверсина происходит, и некоторые отрицательно заряженные липиды были показаны для улучшения процесса преобразования 5,6. Кроме того, некоторые белки могут быть также вовлечены в прионных патологий. В частности, есть два других члена семейства белков прионов: Двухместный и Shadoo 7,8. Двухместный имеет относительно жесткую конструкцию стабилизированной ди-сульфидных мостиков и не к самостоятельной полимеризации и совокупности с амилоидных фибрилл 9. В отличие от этого, похожи на прионного белка, Shadoo может принять β-листа, обогащенный структуру и самоассоциации в амилоидных фибрилл структур. Было показано, что Shadoo может фибрилляции в нативных условиях или при связывании отрицательно заряженные мембраны 10,11. Преобразование Shadoo в амилоидоподобных волокон могут быть связаны с патологией. Действительно, механизмы, с помощью которых амилоидные структуры, подобные вызывают заболевание мало изучены.

Shadoo несет гидрофобный домен (HD) и ряд тандем Arg / Gly повторяет аналогичную тО, N-концевой части белка приона (1А). Как N-концевой части прионного белка, Shadoo высоко положительно заряженные и, кажется, изначально неструктурированного белка 11,12. Shadoo, кажется, функционально связанных с нарушениями прионов, так как это может непосредственно связываться прионов протеина. Кроме того, его экспрессия вниз регулируется во время прионов патологии 13,14. Однако роль Shadoo в прион болезни еще не установлена.

Мы разработали плазмиду, несущую кодирующую последовательность гена мыши Shadoo. Плазмиду использовали дл трансформации E. палочка для производства N-концевой Его 6 фьюжн Shadoo белка. Эта система выражение хорошо зарекомендовали себя в нашей лаборатории и широко используется в наших текущих проектов 6,15,16. Важным вопросом для выражения Shadoo является выбор Е. Штамм. В то время как компетентный BL21 бактериальный штамм обычно используется для экспрессии рекомбинантного пробелки Shadoo успешно экспрессировали и очищали только из трансформированной SoluBL21 бактериального штамма. SoluBL21 компетентный Е. палочка является улучшенной мутант штамма BL21 принимающей разработана для производства белков, экспрессия в родительском BL21 не дали детектируемой растворимый продукт. Высокого уровня экспрессии Shadoo в SoluBL21 Е. палочка приводит к накоплению белка в тельцах включения. В общем, когда функции, неродного белок высоко выраженной в E. палочка, этот белок имеет тенденцию накапливаться в нерастворимых телец включения. Shadoo вероятно, агрегаты через нековалентных гидрофобных взаимодействий или ионных (или сочетание того и другого) в высокообогащенных динамических структур в сложенном белке или иной степени. В результате, очистка включает по меньшей мере из двух шагов: (I) селективное отделение белка из других биомолекул в денатурации среды, и (II) а ренатурация очищенного белка с использованием в пробирке складыванияметоды.

Селективное разделение Shadoo была достигнута в буферном растворе, содержащем 8 М мочевину (или альтернативно 6 М гуанидин-HCl)-. Удаление мочевины и ренатурации белков может быть сделано путем применения различных протоколов: (I) ренатурации в кислом растворе рН для получения неструктурированных мономерного Shadoo белок, или (II) ренатурации в растворе рН ≥ 7, чтобы получить Shadoo полимеризованное в стабильных амилоидных волокон с характерными кросс-β-листов мотивами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Генерация плазмиды и Shadoo слова

Примечание: ген, кодирующий белок мышиного Shadoo (Shadoo 25-122), субклонировали в вектор экспрессии ПЭТ-28 11. Этот клон был преобразован в E. палочка SoluBL21 бактериальный штамм, чтобы выразить Shadoo белок с N-концевой гексагистидиновой тега, (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG), как описано ранее 11. Плазмиды могут быть запрошены из авторов. Молекулярная масса Shadoo рассчитанная по его аминокислотной последовательности 12,243.2 да.

Примечание: Выполните все манипуляции с бактериями под капотом Ламиналь потока или близко к Бунзена пламени.

  1. Transform компетентные бактерии SoluBL21 с животным-28-6 Его -Shadoo плазмиды, используя стандартный протокол теплового шока. По этой смеси от 1 до 5 мкл плазмиды (как правило, 10 пг до 100нг) в 50 мкл бактерий в трубе. Выполнение теплового шока при 42 ° С в течение 45 сек.
  2. Культура не трансформированных бактерий при 37 ° С до тех пор, 600 0,5-0,7 в Лурии-Бертани, дополненной 40 мг / мл канамицина (Фиг.1В).
  3. Вызвать Shadoo выражение O / N, добавляя 240 мкг / мл изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид, ITPG, к культуре. Культура бактерий при встряхивании при 150 об при 37 ° С. Примечание: Как правило, бактериальная культура достигает 600 3 O / N.
    Примечание: трансформированных бактерий могут храниться при температуре -80 ° C для дальнейшего производства белка. Для этого добавьте 10% -50% (об / об) глицерина в стерильной бактериальной культуры аликвоты и замораживают их при -80 ° С.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема Shadoo конструкции экспрессии, трансформации и бактерий индукции экспрессии Shadoo (как описано в пункте 1). (А) экспрессирующую конструкцию для Shadoo кодирует гексагистидиновую метку, слитый с N-конца белка, NT. Схема показывает, что Shadoo белок содержит основные повторы аргинин / глицин (зеленый цилиндр), гидрофобный домен в (HD), и один сайт N-гликозилирования (CHO) с последующей в С-конце (КТ). (B), ПЭТ-28-His 6 -Shadoo плазмиды превращается в SoluBL21 бактерий теплового шока в течение 45 сек при 42 ° С. Трансформированные бактерии высевали на селективный агар, содержащий 40 мкг / мл канамицина. Одну колонию из планшета использовали дл прививки культуры в 1000-3000 мл шейкер колбу. Экспрессия рекомбинантного белка индуцируют 1 мМ IPTG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. Очистка Shadoo белка низкого давления жидкостной хроматографии (LPLC)

  1. Лизис клеток и Ввыводу подготовка тела
    1. Сбор бактериальной суспензии и передать его в центрифужные пробирки (рисунок 2).
    2. Спин при 2500 х г в течение 20 мин при 4 ° С. Удалить супернатант декантируют и ресуспендируют гранулы в 15 мл буфера (50 мМ Трис, 10 мМ ЭДТА, рН 8 анти-протеазы коктейль) для каждого из гранул, полученных в 500 мл клеточной культуры.
      Примечание: Ресуспендированные осадки могут быть заморожены и хранили при -20 ° С в течение нескольких дней. Замораживание способствует лизису бактериальных клеток.
    3. Проверьте Сверхэкспрессия рекомбинантного белка, используя грубые бактерий гранул путем анализа SDS-PAGE и окрашивания кумасси.
      1. Для этого, центрифуга 1 мл бактериальной культуры для осаждения клеток. Добавьте 100 мкл раствора Laemmli денатурации (277,8 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 4,4% SDS, 44,4% вес / объем глицерина, 0,02% бромфенолового синего), чтобы осадить и тепла при температуре 100 ° С в течение 5 мин.
      2. Нагрузка 10 мкл образца в 12% акриламида гель, запустите SDS-PAGE и VISUАлизе разделены белки с помощью окрашивания Кумасси.
    4. Добавить Triton X-100 до 0,5% конечной концентрации в абсолютно Ресуспендированный осадок из 2.1.2).
    5. Инкубируйте суспензии в водяной бане при 37 ° С в течение 30 мин.
    6. Разрушать ультразвуком суспензии в течение 5 мин при 6-12 мкм пик-пик амплитуды в ледяной воде, чтобы лизировать клетки бактерий.
    7. Передача ультразвуком суспензии в чистых 50 мл центрифужные пробирки.
    8. Пробирки центрифужные при 15000 х г в течение 15 мин при 4 ° С.
    9. Удалить супернатант декантируют и добавляют 5 мл буфером для связывания (20 мМ Трис-HCl буфера, рН 7,4, 0,5 М NaCl, 8 М мочевины, 5 мМ имидазол) на пробирку.
    10. Место трубки на вращающееся колесо O / N, чтобы полностью ресуспендирования белки из телец включения.

    фигура 2
    Рисунок 2. Схема очистки включенияорганов (как описано в шаге 2.1). Бактерии, экспрессирующие Трансформированные Shadoo собирают центрифугированием и ресуспендировали в буфере для лизиса в. Суспензию инкубировали при 37 ° С в течение 30 мин, а затем обрабатывали ультразвуком, чтобы разрушить механически бактериальных клеток. Озвучивание делается на льду, чтобы предотвратить нагрев образца. Разбитые клетки собирают центрифугированием и ресуспендировали в буфере, содержащем 8 М мочевину для растворения белков из телец включения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  2. Ni 2+ -affinity хроматографии
    Примечание: хроматографию на FPLC система, использующая Ni2 + -charged, 5 мл сефарозы колонка хелатирующий (3А). Все растворы наносили на колонку со скоростью потока 1 мл / мин.
    1. Внедрить 10 мл 0,2 М раствора 4 NiSO воды в колонке Sepharose для того, чтобы зарядить егос Ni 2+ -ионов.
    2. Уравновешивают колонку, загруженную Ni 2+ -ионов путем введения 30-50 мл связывающего буфера, содержащего низкую концентрацию имидазола (20 мМ Трис-HCl буфера, рН 7,4, 0,5 М NaCl, 8 М мочевины, 5 мМ имидазол).
    3. Загрузите мочевины-солюбилизированы белки с инъекционной петлей на 50 мл.
    4. Восстановление фракции проточный путем тщательного промывания колонки 10 мл низкого имидазола связывающем буфере (20 мМ Трис-HCl буфере, рН 7,4, 0,5 М NaCl, 8 М мочевины, 5 мМ имидазол), с тем, чтобы удалить максимум несвязанных белков из колонки.
    5. Промывают колонку 50-100 мл промывочного буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 0,5 М NaCl, 8 М мочевины, 80 мМ имидазол) для элюирования белков неспецифически связанных с колонкой.
    6. Нанесите 15 мин линейный градиент 80-800 мМ имидазола в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 0,5 М NaCl, 8 M мочевину. Собирают фракции по 1 мл в течение градиента применения. Примечание: His-меченых белков элюируют остроумиега градиент имидазола, содержащего буфер (используется в качестве конкурента).
    7. Возьмите 8 мкл аликвоты каждой фракции и добавить 4 мкл 4x Laemmli денатурации раствора (см 2.1.3.1). Тепловые растворы при 100 ° С в течение 5 мин.
    8. Нагрузка 10 мкл размера белка маркера и 10 мкл каждого образца в 12% акриламида гель, запустить SDS-PAGE и визуализировать разделенные белки окрашиванием Кумасси. Примечание: Молекулярная масса Shadoo рассчитывается образуют его аминокислоты последовательности 12,243.2 да.
    9. Бассейн все фракции, содержащие Shadoo.

    Рисунок 3
    Рисунок 3. Процедура очистки (как описано в шагах 2.2-2.4). (А) 2+ -ионов Ni могут быть согласованы с остатками гистидина, что позволяет селективного очистку полигистидиновые-меченных белков. Имидазол использовать, чтобы элюировать белок, черезего способность координировать с Ni 2+ -ion и сместить связанного белка. (Б) Белки различной гидродинамического радиуса, что были сохранены на Ni 2+ -column разделены на эксклюзивной колонке. Белки элюируют из самых больших до самых маленьких из них. (С) Перед использованием Фракции, содержащие Shadoo объединяют и обессоливают, чтобы удалить мочевину, имидазол и соли. Анализы контроля качества включают SDS-PAGE / окрашивания кумасси, Вестерн-блоттинга. Очищенный Shadoo можно сублимационной сушке. Лиофилизированный Shadoo стабилен в течение месяцев, если хранятся при -20 ° С. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  3. Гель-хроматографии
    Примечание: Вторая стадия очистки состоит в вытеснительной хроматографии, которая разделяет Shadoo белок от других белков совместно элюированных во время первой стадии очистки(3В).
    1. Равновесие Superdex колонну 120 мл общий объем кровать путем введения 250 мл 20 мМ Трис-HCl буфере, рН 7,4, 0,5 М NaCl, 8 М мочевины при скорости потока 1,5 мл / мин.
    2. Загрузка Объединенные фракции, содержащие от Shadoo 2.2.9 на уравновешенную колонку. Собирают фракции по 1 мл через колонку пустот объемом 40 мл при постоянном потоке выше буфера.
    3. Возьмите 10 мкл аликвоты каждой фракции и выполнить анализ SDS-PAGE и окрашивания кумасси, как описано выше, чтобы выяснить, какие фракции содержат Shadoo.
    4. Бассейн Фракции, содержащие Shadoo.
  4. Обессоливание
    Примечание: процедура обессоливания удаляет соли, мочевину и имидазола для получения рекомбинантного белка Shadoo в буфер, подходящий для дальнейших биофизических и биохимических исследований (рис 3C). Тот же результат может быть получен диализа образцы против буфера.
    1. Равновесие столбец обессоливающей 53 мл с 150 мл10 мМ ацетата аммония буфере, рН 5, при скорости потока 5 мл / мин.
    2. Нагрузка объединяли Shadoo фракции на колонке. После инъекции буфера ацетат аммония собирают вручную фракции, показывают увеличение сигнала на длине волны 280 нм на выходе детектора УФ.
    3. Вымораживанием сухой обессоленной Shadoo и хранить его при температуре -20 ° С.
    4. Растворить лиофилизированный Shadoo в адекватной буфера, такого как 10 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5, перед использованием.
      Примечание: полигистидиновой метки могут быть удалены с энтерокиназы.

3. In Vitro Сборка Shadoo в амилоидных фибрилл при физиологических рН

Примечание: белковые агрегаты Shadoo и спонтанно образует фибриллы при рН ≥ 7 11.

Рисунок 4
Рисунок 4. Схема Shadoo рефолдинга для амилоидных фибрилл (как descriкровать в шаге 3). Очищенную Shadoo самопроизвольно переходит в амилоидных фибрилл при растворении в буфере с рН ≥ 7 в кислом растворе, Shadoo преобразует в амилоидных фибрилл при инкубации с 1 М HCl GDN-при встряхивании. Контроль качества анализы включают электронную микроскопию и окрашивание ТНТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Развести Shadoo до конечной концентрации 2 мкм в буфере 20 мМ Трис-HCl, рН 7,4. Измерение концентрации путем измерения оптической плотности раствора при 280 нм и с помощью коэффициента экстинкции выведенную из состава Shadoo аминокислотной 20,970.
  2. Выдержите 500 мкл раствора в коническую пластиковую трубку при 4 ° С в течение нескольких недель, чтобы спонтанное превращение белка амилоида структур (рисунок 4).
  3. Добавить свежеприготовленный тиофлавина T (ТНТ) до конечной Concentration от 10 мкм до 100 мкл аликвоты раствора Shadoo. Инкубируйте раствор в течение 5 мин при комнатной температуре. Измерьте флуоресцентное излучение от 460 до 520 нм, используя длину волны возбуждения 435 нм, чтобы проверить наличие амилоидных структур 17.

4. В Vitro Сборка Shadoo к амилоидных фибрилл при кислом рН

  1. Развести Shadoo в 1 М GdnHCl, 20 мМ Na-ацетатном буфере, рН 5 в конечной концентрации 2 мкМ.
  2. Инкубируют 500 мкл этого раствора в конической трубе с продолжительным встряхиванием при 37 ° С, в течение 3-7 дней.
  3. Проверка на наличие амилоидных фибрилл при добавлении THT к аликвоте раствора, как в 3.3.
  4. Диализировать полученной суспензии с 10 мМ Na-ацетатном буфере, рН 5,0, для очистки Shadoo амилоидные фибриллы.
  5. Храните очищенные фибриллы при +4 ° C.

Рисунок 5 Рисунок 5. Представитель результаты. Белковые фракции, элюированные из Ni 2+ -charged колонку хелатирующую (A) и эксклюзивной колонке (B) были проанализированы с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси. Идентификация очищенной Shadoo оценивали с помощью SPRn анти-Shadoo антитела (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Около 5-10 мг очищенного белка Shadoo получается на литр бактериальной культуры. Двухступенчатый очистки необходимо для получения рекомбинантного Shadoo высокой чистоты. Первый этап выполняется с помощью аффинной хроматографии с Ni 2+ -charged столбца, сохраняет свои-меченых белков. Элюированных фракций подвергают SDS-ПААГ и окрашивали кумасси бриллиантовым голубым (5А). Фракции, содержащие белок Shadoo объединяют и дополнительно очищали гель-хроматографии, которая разделяет белки по их размерам (Shadoo молекулярная масса составляет около 12 кДа). Фракции, собранные на элюирования визуализируются SDS-PAGE / Coomassie анализа (рис 5B). Кроме того, Shadoo свидетельствует использованием конкретного анти-антитело, Shadoo SPRn, который связывается с эпитопом чувствительной между 76-105 аминокислот из белка С-концевой области (5С) с помощью Вестерн-блоттинга-.

Shadoo рефолдинга кmyloid фибриллы проверяется ThT окрашивания (6А) и отрицательной окрашивание электронной микроскопии (фиг.6В). ThT является флуоресцентный краситель, который связывается кросс-β-лист четвертичного структуры, характерные для амилоидных агрегатов. Увеличение интенсивности ThT в 6А показывает, что Shadoo преобразуется в амилоида структур.

Рисунок 6
Рисунок 6. Типичные результаты. (A) Shadoo фибриллы 2 мкМ мономера эквивалентной концентрации предварительно инкубировали с ThT (10 мкМ конечная концентрация) в течение 5 мин при комнатной температуре. Люминесцентные интенсивности выбросов записываются для каждого образца с использованием длины волны возбуждения при 435 нм. Примечание значительное увеличение интенсивности флуоресценции ThT в растворе, содержащем Shadoo полимеризуют амилоидных фибрилл по сравнению с контрольной сспособность по мономерного Shadoo. (B), просвечивающей электронной микроскопии волокнистой Shadoo. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Простой и эффективный протокол для обоих экспрессии и очистки большого количества рекомбинантного белка мыши Shadoo представлена. Метод, описанный позволяет успешно растворения и очистки (6 Его) -tagged рекомбинантного белка Shadoo. Важно, как отметил в названии, что при экспрессии в прокариотической бактерии E. палочка Shadoo накапливается в тельцах включения. Перед очисткой Shadoo, бактерии должны быть лизируют обработкой ультразвуком в буфере, содержащем Triton X-100. Впоследствии тела включени могут быть растворяют в 8 М мочевине денатурирующем растворе. Кроме того, вся процедура очистки должна быть выполнена в 8 буферного раствора мочевины, поскольку М Shadoo тенденцию к полимеризации и совокупного. После солюбилизации и разъяснений телец включения, супернатант, содержащий денатурированные белки подвергают процедуре очистки двухступенчатой: аффинной хроматографии и гель-хроматографии. Близость Chromatogфия шаг состоит в связывании Shadoo через (6) Его в тег к Ni 2+ -charged колонку хелатирующую. В 8 М раствора мочевины белков денатурируют и их остатков гистидина в экспонированы на поверхности. Кроме того, мочевина способствует структурной целостности Shadoo путем предотвращения протеолиза в случае загрязнения протеазы. На втором этапе очистки, Shadoo элюируют из градиентом имидазола подвергают гель-хроматографии, чтобы отделить примесей белков. На втором этапе, крупные белки элюируют сначала, как они не могут войти в поры матрицы и, таким образом, есть прямой путь через колонну. Меньшие белки, а Shadoo, занять больше времени, для элюирования из колонки, так как они могут войти в поры и имеют более замысловатую путь. И, наконец, белковый препарат обессоливают, чтобы удалить мочевину, имидазол и соли. Контроль качества означает, что после этой процедуры рекомбинантный Shadoo очищают высокой чистоты. Она может быть использована в стarious биологические и биотехнологические исследования.

Е. палочка система экспрессии является чрезвычайно полезным инструментом для экспрессии рекомбинантных белков. Низкая стоимость, легкая манипуляция, быстрота и удобство экспрессии белков млекопитающих в E. палочка сделать из этого хоста первым выбором инструмент для наук о жизни приложений. Однако не все белки млекопитающих могут быть выражены в растворимой форме и / или в количестве, достаточном в этой бактерии. Иногда, препятствия могут быть преодолены с помощью различных стратегий, как понижением температуры выражение, изменение промоутеров, добавив теги очистки с использованием альтернативных средств массовой информации 18-20. Тем не менее, в некоторых случаях, находя оптимальные условия экспрессии может иметь высокую стоимость во времени и усилий. Трудности для получения рекомбинантного Shadoo были преодолены с SoluBL21 компетентным Е. Штамм. Это мутантный штамм хозяина значительно улучшилось выход Shadoo производства и позволило получить полностью растворяетсяShadoo. Выходы, полученные находились в диапазоне 5-10 мг / л культуры.

Рекомбинантный Shadoo было показано, чтобы быть изначально неструктурированных белков дает функцию случайных катушке кругового дихроизма спектроскопии 11,12. Будучи весьма положительно заряженный белок (PI ~ 10.44) Shadoo стремится объединять при физиологическом рН. Тем не менее, Shadoo полностью растворяется в буферных растворах кислых значениях рН. Мы представили здесь простые и эффективные протоколы для полимеризации Shadoo к амилоидных фибрилл в разных значениях рН. Полимеризованный Shadoo представляет собой ценный инструмент для изучения патологических белковых складок, которые характеризуют некоторые нейродегенеративные заболевания. Рекомбинантный Shadoo очищают, используя нашу процедуру можно использовать для дальнейших биохимических и структурных характеристик конформационного переходного процесса.

Основываясь на своей основной структуре, Shadoo было предсказано, чтобы один N-связанный сайт гликозилирования и сигнальные пептиды для присоединения glycosylphosphatidylinositol (GPI) якорь рядом с его С-концевой (фиг.1А). Рекомбинантный Shadoo очищен от телец включения лишен углеводов, поскольку система экспрессии в E.coli не в состоянии выполнить пост-трансляционных модификаций. В результате, взаимодействие рекомбинантного Shadoo с белков, липидов или нуклеиновых кислот могут быть модифицированы по сравнению с нативным белком. Например, важность Shadoo гликозилирования Недавно был предложен деградации протеасом Shadoo после модификации белкового убиквитинирования 21. Роль GPI якоря в прион заболевания не известно, но многие исследования показывают, что GPI якорь может играть роль в патогенезе заболеваний прионов 22,23. Таким образом, бактериальная выразил Shadoo могут быть использованы для исследований в пробирке с учетом этих ограничений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AKTA FPLC  GE, Amersham # 1363
HiLoad 16/60 Superdex GE Healthcare 17-1069-01
HiTrap IMAC GE Healthcare GE17-0920-05
HiPrep26/10 Desalting column GE Healthcare GE17-5087-01
SoluBL21 Competent E. coli Genlantis C700200
pET-28b+ Novogen 69865-3
IPTG Sigma-Aldrich I6758
LB-Broth medium Sigma-Aldrich L3022
Eppendorf Biophotometar Eppendorf 550507804
Trito X-100 Life Technologies 85111
NiSO4 Sigma-Aldrich 656895
EDTA Sigma-Aldrich E6758
Tris-HCl Sigma-Aldrich RES3098T
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4693116001
NaCl Sigma-Aldrich 746398
Imidazol Sigma-Aldrich I5513
Gdn-HCl Sigma-Aldrich G4505
protein size marker  Thermo Fisher Scientific 26620

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Biasini, E., Turnbaugh, J. A., Unterberger, U., Harris, D. A. Prion protein at the crossroads of physiology and disease. Trends in Neurosciences. 35, 92-103 (2012).
  2. Colby, D. W., Prusiner, S. B. De novo generation of prion strains. Nature Reviews. Microbiology. 9, 771-777 (2011).
  3. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  4. Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435, 773-778 (2005).
  5. Murphy, R. M. Kinetics of amyloid formation and membrane interaction with amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1923-1934 (2007).
  6. Steunou, S., Chich, J. F., Rezaei, H., Vidic, J. Biosensing of lipid-prion interactions: insights on charge effect, Cu(II)-ions binding and prion oligomerization. Biosensors & Bioelectronics. 26, 1399-1406 (2010).
  7. Watts, J. C., Westaway, D. The prion protein family: diversity, rivalry, and dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta. 1772, 654-672 (2007).
  8. Westaway, D., Daude, N., Wohlgemuth, S., Harrison, P. The PrP-like proteins Shadoo and Doppel. Topics in Current Chemistry. 305, 225-256 (2011).
  9. Baillod, P., Garrec, J., Tavernelli, I., Rothlisberger, U. Prion versus doppel protein misfolding: new insights from replica-exchange molecular dynamics simulations. Biochemistry. 52, 8518-8526 (2013).
  10. Daude, N., et al. Wild-type Shadoo proteins convert to amyloid-like forms under native conditions. Journal of Neurochemistry. 113, 92-104 (2010).
  11. Li, Q., et al. Shadoo binds lipid membranes and undergoes aggregation and fibrillization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 438, 519-525 (2013).
  12. Watts, J. C., et al. The CNS glycoprotein Shadoo has PrP(C)-like protective properties and displays reduced levels in prion infections. The EMBO Journal. 26, 4038-4050 (2007).
  13. Watts, J. C., et al. Protease-resistant prions selectively decrease Shadoo protein. PLoS Pathogens. 7, e1002382 (2011).
  14. Westaway, D., et al. Down-regulation of Shadoo in prion infections traces a pre-clinical event inversely related to PrP(Sc) accumulation. PLoS Pathogens. 7, e1002391 (2011).
  15. Chevalier, C., et al. PB1-F2 influenza A virus protein adopts a beta-sheet conformation and forms amyloid fibers in membrane environments. The Journal of Biological Chemistry. 285, 13233-13243 (2010).
  16. Tarus, B., et al. Oligomerization paths of the nucleoprotein of influenza A virus. Biochimie. 94, 776-785 (2012).
  17. Biancalana, M., Koide, S. Molecular mechanism of Thioflavin-T binding to amyloid fibrils. Biochimica et Biophysica Acta. 1804, 1405-1412 (2010).
  18. Minic, J., Sautel, M., Salesse, R., Pajot-Augy, E. Yeast system as a screening tool for pharmacological assessment of g protein coupled receptors. Current Medicinal Chemistry. 12, 961-969 (2005).
  19. Schein, C. H. A cool way to make proteins. Nature Biotechnology. 22, 826-827 (2004).
  20. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. Journal of Biotechnology. 115, 113-128 (2005).
  21. Zhang, J., et al. Disruption of glycosylation enhances ubiquitin-mediated proteasomal degradation of Shadoo in Scrapie-infected rodents and cultured cells. Molecular Neurobiology. 49, 1373-1384 (2014).
  22. Englund, P. T. The structure and biosynthesis of glycosyl phosphatidylinositol protein anchors. Annual Review of Biochemistry. 62, 121-138 (1993).
  23. Puig, B., Altmeppen, H., Glatzel, M. The GPI-anchoring of PrP: implications in sorting and pathogenesis. Prion. 8, 11-18 (2014).

Tags

Молекулярная биология выпуск 106 Shadoo Прионных болезни амилоидные волокна неупорядоченные искробезопасности белка Его с метками Белки очистки включения тела хроматографии
Очистка и повторной укладки в амилоидных фибрилл в (Его)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged рекомбинантный белок Shadoo Выраженный в виде телец включения в<em&gt; Кишечная палочка</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Q., Richard, C. A., Moudjou, M., … More

Li, Q., Richard, C. A., Moudjou, M., Vidic, J. Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli. J. Vis. Exp. (106), e53432, doi:10.3791/53432 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter